Summary
Deze studie introduceert een methode voor het gelijktijdig opnemen van lokale veld potentieel in de hersenen, elektrocardiogrammen, electromyograms en signalen voor een vrij bewegend rat te ademen. Deze techniek, die experimentele kosten vermindert en vereenvoudigt gegevensanalyse, zal bijdragen aan het begrip van de interacties tussen de hersenen en perifere organen.
Abstract
Bewaking van de fysiologische dynamiek van de hersenen en perifere weefsels is noodzakelijk voor het aanpakken van een aantal vragen over hoe de hersenen controles body functies en inwendige organen ritmes wanneer dieren worden blootgesteld aan emotionele uitdagingen en veranderingen in hun leefomgeving. In het algemeen worden experimenten, signalen van verschillende organen, zoals de hersenen en het hart, door onafhankelijke opnamesystemen die vereisen meerdere opname-apparaten en verschillende procedures voor het verwerken van de gegevensbestanden geregistreerd. Deze studie beschrijft een nieuwe methode die gelijktijdig elektrische biosignals, met inbegrip van tientallen lokale veld potentieel in meerdere hersengebieden elektrocardiogrammen die de cardiale ritme vertegenwoordigen, en electromyograms die wakker vertegenwoordigen kunt controleren / slaap-gerelateerde spiercontractie en signalen, in een vrij bewegende rat te ademen. De configuratie van de opname van deze methode is gebaseerd op een conventionele micro-drive-arrays voor corticale lokale potentiële veldopnames waarin tientallen elektroden worden ondergebracht en de signalen die deze elektroden verkregen zijn geïntegreerd in één Elektrisch bord gemonteerd op de kop van het dier. Hier, was deze opname-systeem verbeterd zodat signalen uit het perifere organen ook naar een elektrische interfacekaart overgebracht worden. In een enkele operatie, zijn elektroden eerst apart ingeplant de juiste lichaamsdelen en de doelgebieden van de hersenen. De open uiteinden van al deze elektroden zijn daarna vastgesoldeerd aan afzonderlijke kanalen van het elektrische bord boven het hoofd van het dier, zodat alle signalen kunnen worden geïntegreerd in de interne elektrische bestuur. Dit bord verbinden met een opname-apparaat zorgt voor de verzameling van alle signalen in een enkel apparaat, die experimentele kosten vermindert en vereenvoudigt de verwerking van de gegevens, omdat alle gegevens kunnen worden verwerkt in het zelfde gegevensbestand. Deze techniek zal helpen het begrip van de neurofysiologische correlaten van de associaties tussen centrale en perifere organen.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel besturingselementen lichaam Staten in reactie op de diverse veranderingen in het milieu en dit besturingselement wordt meestal weergegeven als veranderingen in harttarief, ademhalingstarief, en spiercontracties. Nochtans, hebben de weinige studies getest hoe dergelijke perifere fysiologische factoren worden geassocieerd met corticale activiteit. Om dit probleem te verhelpen, is een grootschalige opnamemethode voor controle van elektrische biosignals van zowel de centrale en de perifere weefsels noodzakelijk. In de hersenschors, zijn lokale veld potentiële (LFP) signalen extracellularly opgenomen door elektroden die worden ingevoegd in de corticale weefsels1,2,3. Als u wilt gelijktijdig opnemen van meerdere LFP signalen van de corticale gebieden van kleine zoogdieren, zoals ratten en muizen, hebben een aantal studies ontwikkeld verschillende soorten op maat gemaakte elektrode-assemblages die micro-stations worden genoemd. Een conventionele micro-aandrijving is samengesteld uit metalen schroeven gekoppeld aan de middelste delen van de elektroden (die zijn meestal schutterijofficieren) en een romp dat geschikt is voor de schroeven en de elektroden een elektrische interfacekaart (EIB) dat geschikt is voor metalen gaatjes Sluit de open uiteinden van de elektroden (Figuur 1, Figuur 2en Figuur 3). Deze elektrode vergadering maakt de exploitant aan het bepalen van de diepte van vele elektroden in de hersenen in de loop van dagen tot weken ingevoegd, en laat de uitvoering van langdurige chronische opnames van neuronale activiteit als het dier wordt uitgedaagd met verschillende gedrags taken. In de perifere organen, heartbeat signalen worden opgenomen als elektrocardiogrammen (ECG) door een paar van elektroden die worden geïmplanteerd op of rond het hart gebied4,5,6, en skeletspieren signalen zijn opgenomen Als electromyograms (EMGs) met elektroden die worden ingevoegd in de spier weefsel7,8,9. De relatie tussen elektrische signalen van de bulbus olfactorius en ritme van de ademhaling (BR) is onderzocht met één eenheid opnames10,11. In conventionele opnamesystemen, deze signalen uit verschillende weefsels en zijn vastgelegd door onafhankelijke opname-apparaten, wat betekent dat een extra experimenteel systeem moet juist het synchroniseren van deze meerdere apparaten voor gelijktijdige opnames van signalen van de hersenen-lichaam. Dit systeem werd ontwikkeld om deze kwestie te overwinnen. In dit systeem, zijn alle elektrische signalen opgenomen van perifere organen, met inbegrip van ECG's, EMGs en elektrische signalen van de bulbus olfactorius die overeenkomen met het ritme van de ademhaling, geïntegreerd in een enkele micro-drive arrays1,2 ,3, hier genoemd een integratieve micro-drive-arrays. Dit systeem vereist slechts één multi-kanaals opname-apparaat, en is van toepassing op elke conventionele micro-drive-arrays. De voordelen van deze techniek zijn dat het vereist geen speciale apparatuur of trigger signalen aan de opnametijd van meerdere apparaten, en het laat voor gegevensverwerking handiger, omdat alle signalen worden geregistreerd als soortgelijke gegevens. Deze techniek zal helpen het begrip van de neurofysiologische correlaten van de associaties tussen centrale en perifere organen. Deze paper beschrijft de procedures die zijn gekoppeld aan de techniek en presenteert representatieve datasets verkregen van een rat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de NIH voor de zorg en het gebruik van dieren.
1. bereiding van de integratieve Micro-Drive-arrays
- Maak een micro-drive-arrays voor corticale LFP opnamen zoals elders beschreven1,2,3. Verlof ten minste 6 metalen gaten open op een elektrode-interfacekaart (EIB) voor gebruik als ECG/EMG/BR-kanalen die zijn verbonden met bioflex draden zoals beschreven in 1.2.
- Knip een draad bioflex in 6 stukken met een lengte van 5,0 cm. Peel off de polytetrafluorethyleen (PTFE) coating van beide uiteinden van de draad van alle stukken met een lengte van ~5.0 mm. Sluit het ene uiteinde van elk van de stukken van de draad aan één van de open metalen gaatjes (ECG/EMG/BR kanalen) op de EIB met een gouden speld.
- Een glazuur-draad in twee stukken van 5.0-cm snijden. Soldeer videoconnectors aan elk van deze draden naar de grond/verwijzing (g/r) kanalen op de EIB (Figuur 3, zie ook vorige papieren12,13).
- Voor de bereiding van ECG elektroden, een bioflex-draad in twee stukken van de 16-cm snijden. Afschilferen van de PTFE-coating van de uiteinden van deze stukken draad op lengte van ~5.0 mm aan de ene kant (korte eind) en ~ 15 mm aan de andere kant (lange zijde).
- Vorm een ring van de draad met een diameter van 2.0 mm door het buigen van de lange uiteinde van de draad, en tot vaststelling van de vorm van de ring door solderen.
- Voor de voorbereiding van EMG elektroden, Knip een bioflex draad in 2 stukken met een lengte van 8 cm. Peel off de PTFE coating aan beide kanten van deze stukken draad met een lengte van ~5.0 mm.
- Voor de voorbereiding van BR elektroden, Knip een draad bioflex in 2 stukken met een lengte van 6,0 cm. Peel off de glazuur coating van beide uiteinden van de stukken van deze draad met een lengte van ~5.0 soldeer mm. videoconnectors aan elk van deze stukken van de draad aan het hoofd van een roestvrij stalen schroef (stam dia meter: 1.0 mm steellengte: 4,0 mm).
- Voor de bereiding van grond/Referentie (gr)-elektroden soldeer knippen een emaille draad in 2 stukken met een lengte van 6,0 cm. Peel off de glazuur coating van beide uiteinden van de stukken van deze draad met een lengte van ~5.0 mm. een einde van elk van deze stukken van de draad aan het hoofd van een roestvrij-st paling schroef (stammen diameter: 1.4 mm, steellengte: 3.0 mm).
- Gas steriliseren alle elektroden en RVS schroeven en bewaar deze in een schone ruimte.
2. de innesteling van de ECG/EMG elektroden
Opmerking: Alle chirurgische stappen uitvoeren met aseptische techniek met behulp van gesteriliseerde handschoenen en gesteriliseerde met autoclaaf instrumenten. Voor alle maatregelen waarbij de oprichting van een incisie, steriliseren van de huid met 70% ethanol vóór en dekking van de incisie met afdeklakens.
- Fix een narcose (1.0-3.0% Isofluraan gas) rat op zijn rug op een vlakke warmte pad. Het geven van buprenorfine als pijnstiller. Veterinaire zalf op de rat's ogen om te voorkomen dat droge plaatsen. Gebruik betadine om het oppervlak van de huid schoon te maken.
- Maak een insnijding van ~2.0 cm in de mediale borst gebied. De intercostale spieren door te scheiden van de spieren van de borst bloot. Suture de ringen van de ECG-elektroden op de intercostale spieren.
- De maag van het dier vast op de warmte pad. Maak een insnijding van ~1.0 cm in de dorsale halsgebied.
- Plaats de elektroden van de ECG subcutaan via de borst incisie. Schuif de uiteinden naar de dorsale halsgebied en trek ze uit de hals snede. Sutuur (geologie) de borst incisie.
- Steek het ene uiteinde van elk van de EMG elektroden subcutaan tot een lengte van ~2.0 cm via de hals snede. Bevestigen de EMG elektroden om de spieren van de hals door te hechten.
3. de innesteling van de integratieve Micro-Drive-Array en de BR-elektroden
- Fix de rat op een stereotaxic apparaat. Maak een insnijding van ~3.0 cm op het hoofd langs de middellijn vanaf het punt tussen de ogen naar het halsgebied. Blootstellen van de schedel.
- Maken twee cirkelvormige craniotomies met een diameter van 0,7-1.0 mm boven de bulbus olfactorius 11.0 mm anterior en 1 mm bilaterale bregma met een high-speed boor. Implantaat twee BR elektroden in de schedel tot de toppen van de schroef stengels zijn aangesloten op de hersenen oppervlak.
- Maken twee cirkelvormige craniotomies met een diameter van 0,7-1.0 mm boven de frontale cortex 2,7 mm anterior en 2,7 mm bilaterale bregma. Implantaat twee g/r elektroden in de schedel tot het uiteinde van de stengel van de schroef is aangesloten op de hersenen oppervlak.
- Zes tot acht gaten met een diameter van 1,0 mm maken in de omgeving van de grote craniotomy. Implantaat anker schroeven (stammen diameter: 1.4 mm, steellengte: 3.0 mm) in de schedel.
- Maken een grote cirkelvormige craniotomy met een diameter van ~2.0 mm boven de hippocampus posterieure 3.8 mm en 2,5 mm bilaterale bregma. Plaats van de integratieve micro-drive arrays, zodanig dat het uiteinde van de canule van de drive-arrays zich boven de grote craniotomy bevindt
- Vul de ruimte van de kloof tussen het uiteinde van de canule en de hersenen oppervlak met ~ 100 µL van twee oplossingen, dwz., natriumalginaat 0,5% (massaprocent) en 10% (massaprocent) calciumchloride.
Opmerking: Dit proces vormt een transparante gel in de ~ 5 min, nadat de twee oplossingen zijn gemengd op de schedel. - Dekking van de canule, BR elektroden, g/r elektroden, en anker schroeven met tandheelkundige cement met een dikte van 0,5 cm. Wees voorzichtig niet ter dekking van de open uiteinden van BR en g/r elektroden met de cement bij deze stap.
- Soldeer de open uiteinden van de elektroden van het ECG, EMG, BR en g/r op de individuele draad tips die eerder aan de EIB werden aangesloten (Zie de stappen 1.2 en 1.3).
- Betrekking hebben op het onderste gedeelte van de integratieve micro-drive-array en alle draden van de elektrode, met tandheelkundige cement. Ervoor zorgen dat alle draden van de elektrode volledig afgedekt zodat de rat kan niet hen uit na de innesteling krabben.
- Na het herwinnen van voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding, het dier terug naar haar transparant Plexiglas huis cag en houd het op zijn eigen met gratis toegang tot water en voedsel. Na de operatie, behandelen de dieren met antibiotica (gentamicine).
- Na de operatie, de dieren met dagelijkse observatie te controleren. Check dat zij goed lopen, en dat ze niet piepen als de experimentator raakt de micro-drive-arrays.
4. in Vivo opnames
Opmerking: Alle signalen worden versterkt, bemonsterd op 2 kHz, en band-pass gefilterde (0.1 - 500 Hz) met uitzondering van de werkzaamheden van de afdeling (bemonsterd op 30 kHz en band-pass gefilterde (500-6 kHz)).
- De headstage van een opname-apparaat verbinden met de EIB van de integratieve micro-drive-arrays.
- Verder de schutterijofficieren door de schroeven draaien voor een paar weken na de operatie. Zodra de schutterijofficieren naast de doelgebieden van de hersenen zijn, regelen de schutterijofficieren in de gebieden over een periode van meerdere dagen voor stabiele opnamen.
- De elektrische signalen controleren terwijl het dier vrij in de zaal van een opname beweegt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode kan gelijktijdig vangen bioelectrische signalen van meerdere organen die de neuronale activiteit van de hersenen, de hartslag vertegenwoordigen, ademhaling ritme en skeletspieren contracties (Figuur 1). Figuur 4 biedt representatieve opnamegegevens van een vrij bewegende rat die vrij was foerageren in een rechthoekige doos (25 × 40 cm2). De voorbeeld-dataset bevat typische gedrags overgangen tussen bewegen en rust van de Staten. Een macht spectrum was berekend op basis van een hippocampal LFP spoor door wavelet-analyse. De BR-signaal opgenomen van het oppervlak van de bulbus olfactorius gewend was ongeveer schatten de relatieve veranderingen in de ademhaling van frequenties, zoals die zich tijdens verkennend snuiven gedrag voordoen.
Figuur 1 : Illustratie van de opname-systeem voor het toezicht op meerdere hersenen-lichaam signalen van een vrij bewegende rat. Alle bioelectrische signalen (LFP, ECG, EEG, BR signalen) van een vrij bewegende rat zijn verzameld in de matrix van de integratieve-microdrive gemonteerd op het hoofd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Een integratieve micro-drive-arrays. Alle LFP, ECG, EEG, and BR signalen worden doorgegeven aan de openingen van de EIB, zoals aangegeven door de pijlen. De gestippelde gebied wordt vergroot in het rechter paneel en toont een aantal van de schutterijofficieren uitsteken van de micro-drive arrays die zijn ingevoegd in het hersenweefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Een bovenaanzicht van de EIB. De EIB omvat 24 corticale LFP (LFP) kanalen die zijn aangesloten op de schutterijofficieren, 2 ECG kanalen, 2 EMG kanalen, 2 BR kanalen en 2 kanalen van de grond (Gr). Alle kanalen, behalve de LFP kanalen waren aangesloten op geïsoleerde draden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Een voorbeeld van de gelijktijdige multi-kanaals opname van bioelectrische signalen.
(Van boven naar beneden) LFP signalen in de Somatosensorische cortex (schaal bar: 250 µV). LFP signalen in de regio CA1 hippocampal (schaal bar: 500 µV). Een gekleurde macht spectrum van de hippocampal LFP trace. Een ECG-signaal (band-pass gefilterd bij 20-200 Hz, schaal bar: 500 µV). Een EMG-signaal (band-pass gefilterd op 100-500 Hz, schaal bar: 100 µV). Een signaal van BR (schaal bar: 500 µV). Een gekleurde macht spectrum van de BR-signaal dat aangeeft snuiven gedrag zoals gedefinieerd door een tijdelijke toename van de ademhaling tarief. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om inzicht te krijgen hoe de hersenen moduleert perifere activiteitenniveaus, en vice versa, grootschalige methoden om gelijktijdig vangen elektrische biosignals uit meerdere lichaamsgebieden opname noodzakelijk zijn. Deze studie beschreven een chirurgische ingreep, en een opname-systeem voor het toezicht op cerebrale lokale veld mogelijkheden, tarieven van het hart, de omvang van de bouw van de spier en de luchtwegen tarieven die zijn verbeterd op een opnamesysteem dat wordt gebruikt voor extracellulaire opnamen in hersenweefsel. Dit systeem verzamelt elektrische signalen vanuit de hersenen en de perifere organen in een enkele EIB op een integratieve micro-drive-arrays. De voorbereiding van de integratieve micro-drive-array moet worden gestart ten minste enkele uren voor de operatie, als het duurt enige tijd. Hier, de drive-arrays omvat schutterijofficieren voor het opnemen van hersenen lokale veld potentieel, maar de andere soorten metalen elektroden, zoals platina en wolfraam elektroden, kunnen worden gekoppeld aan de EIB als de uiteinden van deze elektroden worden goed gesoldeerd. Toen na de chirurgische ingrepen in het protocol, is ervaren onderzoekers geweest kundig voor alle procedures binnen 2-3 uur.
Een kritieke stap binnen dit protocol is de positionering van de elektroden op het weefsel, vooral voor de ECG en EMG elektroden. Verschillende opleiding herhalingen kunnen verplicht zijn te verkrijgen van stabiele opnamen. Tot op heden zijn alle opnamen stabiel ten minste één maand na de operatie. Onderzoekers moeten er rekening mee dat, als de signal-to-noise verhouding van de vastgelegde gegevens laag worden, dit probleem is vaak te wijten aan losse vastleggingen van de grond/referentie-elektroden, of onvoldoende solderen van de uiteinden van de draden tussen de EIBs of de andere uiteinden van draden. In vergelijking met een conventionele elektrofysiologische opname via sommige onafhankelijke apparaten, zijn de voordelen van deze methode dat (1) het is technisch eenvoudig uit te voeren, als meermaals is opgeleid, (2) het niet nodig een communicatiesysteem te synchroniseren meerdere apparaten, (3) het vermindert de totale experimentele kosten, aangezien slechts één opname-apparaat vereist is, en (4) allen opgenomen gegevens bestanden kunnen worden behandeld door de dezelfde methode en programma, dat de efficiëntie van data-analyse verhoogt. Bovendien is het methodologische concept geldt voor vele combinaties van meerdere hersengebieden en perifere organen, met inbegrip van de ademhalingswegen, bloedsomloop en autonome zenuwstelsel. Het is ook van toepassing op alle commercieel beschikbare elektrische opname-apparaat. Gelijktijdige controle van systemische fysiologische activiteit patronen met behulp van deze methode is nuttig in het ophelderen van neuronale activiteit patronen in verschillende fysiologische staten tegen emotionele uitdagingen, externe zintuiglijke modulatie, en pathologische ziekten, resulterend in een toegenomen inzicht in de biologische mechanismen ten grondslag liggen aan de hersenen-lichaam-vereniging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Kaken-hi 17 H 05939; 17 H 05551, de Nakatomi Foundation, en de Suzuken Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094 (2009).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098 (2009).
- Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
- Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697 (2014).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
- Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
- Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
- Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678 (2016).
- Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
- Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
- Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
- Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).
