Summary
Denne undersøgelse introducerer en metode til den samtidige optagelse af lokalt felt potentialer i hjernen, elektrokardiogrammer, electromyograms, og vejrtrækning signaler af en frit bevægende rotte. Denne teknik, som reducerer eksperimentelle omkostninger og forenkler dataanalyse, vil bidrage til forståelse af samspillet mellem hjernen og perifere organer.
Abstract
Overvågning af fysiologiske dynamikken i hjernen og perifere væv er nødvendige for at løse en række spørgsmål om, hvordan hjernen styrer kroppen funktioner og indre organ rytmer når dyr udsættes for følelsesmæssige udfordringer og ændringer i deres levende miljøer. I almindelighed, eksperimenter, signaler fra forskellige organer, såsom hjernen og hjertet, registreres af uafhængige optagelsessystemer, der kræver flere enheder til videooptagelse og forskellige procedurer for behandling af datafiler. Denne undersøgelse beskriver en ny metode, der samtidig kan overvåge elektriske biosignalers, herunder titusinder af lokale felt potentialer i flere områder af hjernen, elektrokardiogrammer, der repræsenterer den hjerterytmen, electromyograms, der repræsenterer vågen / søvn-relateret muskelsammentrækning, og vejrtrækning signaler, i en frit bevægende rotte. Optagelse konfigurationen af denne metode er baseret på en konventionel mikro-drev array for kortikale lokale felt potentielle optagelser, hvor snesevis af elektroder er indkvarteret, og signalerne fra disse elektroder er integreret i en enkelt elektrisk bord monteret på dyrets hoved. Her, blev denne optagelse system forbedret, så signaler fra de perifere organer er også overført til en elektrisk interface bord. I en enkelt operation, er elektroder først separat implanteret i de passende kropsdele og hjernen målområder. De åbne ender af alle disse elektroder er derefter loddet til individuelle kanaler af elektriske bestyrelsen over dyrets hoved, så at alle signaler kan integreres i den enkelt elektrisk bord. Tilsluttet en optageenhed dette board giver mulighed for samling af alle signalerne i en enkelt enhed, der reducerer eksperimentelle omkostninger og forenkler databehandling, fordi alle data kan håndteres i den samme datafil. Denne teknik vil støtte forståelsen af de neurofysiologiske korrelerer til Associeringskontrakter mellem centrale og perifere organer.
Introduction
Centralnervesystemet styrer kroppen stater som svar på forskellige miljømæssige ændringer, og denne kontrol er typisk repræsenteret som ændringer i hjertefrekvens, åndedrætsfrekvens og muskelsammentrækninger. Men få undersøgelser har testet hvor perifere fysiologiske faktorer er forbundet med kortikale aktivitet. For at løse dette problem, er en storstilet optagelse metode til overvågning af elektriske biosignalers fra både centrale og perifere væv nødvendige. I hjernebarken registreres lokale felt potentielle (LFP) signaler extracellularly af elektroder, der er indsat i det kortikale væv1,2,3. Hvis du vil samtidig optage flere LFP signaler fra de kortikale regioner af små pattedyr, såsom rotter og mus, har en række undersøgelser udviklet forskellige typer af skræddersyede elektrode assemblies, der kaldes mikro-drev. En konventionel micro-drive er sammensat af metal skruer knyttet til de midterste dele af elektroderne, (som typisk er Tetroder), en core krop, som kan rumme skruer og elektroder og en elektrisk grænsefladekredsløb (EIB), der kan rumme metal huller til Tilslut de åbne ender af elektroder (figur 1, figur 2og figur 3). Denne elektrode samling gør det muligt for operatøren at styre dybden af mange elektroder indsat i hjernen i løbet af dage til uger, og giver mulighed for gennemførelse af langfristede kroniske optagelser af neuronal aktivitet som dyret bliver udfordret med forskellige adfærdsmæssige opgaver. I perifere organer, hjerteslag signaler registreres som elektrokardiogrammer (EKG'er) af et par af elektroder, der er implanteret på eller omkring hjertet område4,5,6, og skeletmuskulatur signaler registreres som electromyograms (EMGs) med elektroder, som er indsat i muskel væv7,8,9. Forholdet mellem elektriske signaler af olfaktoriske pære og vejrtrækning (BR) rytme er blevet undersøgt med enkelt enhed optagelser10,11. I konventionelle optagelsessystemer, disse signaler fra forskellige væv har været fanget af uafhængige enheder til videooptagelse, hvilket betyder, at en yderligere eksperimentel system skal netop synkronisere disse flere enheder for samtidige optagelser af hjerne-krop signaler. Dette system blev udviklet for at overvinde dette problem. I dette system, er alle elektriske signaler registreret fra de perifere organer, herunder EKG'er, EMGs og elektriske signaler fra lugtekolben, der afspejler vejrtrækning rytme, integreret i en enkelt micro-drev array1,2 ,3, her kaldes en integrativ mikro-drev array. Dette system kræver kun en multi-kanal optagelse enhed, og gælder for alle konventionelle mikro-drev array. Fordelene ved denne teknik er at det ikke kræver nogen særlige enheder eller udløser signaler til at matche optagetid på flere enheder, og det giver mulighed for mere praktisk databehandling, da alle signalerne, der er registreret som lignende datatyper. Denne teknik vil støtte forståelsen af de neurofysiologiske korrelerer til Associeringskontrakter mellem centrale og perifere organer. Dette papir beskriver de procedurer, der er forbundet med teknikken og præsenterer repræsentative datasæt fra en rotte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, der involverer dyr emner blev udført ifølge NIH retningslinjer for pleje og brug af dyr.
1. forberedelse af matrixen Integrativ mikro-drev
- Oprette en mikro-drev array for kortikale LFP optagelser som beskrevet andetsteds1,2,3. Orlov på mindst 6 metal huller åbne på en elektrode grænsefladekredsløb (EIB) til brug som EMG-ECG-BR-kanaler, der er tilsluttet bioflex ledninger som beskrevet i punkt 1.2.
- Skære en bioflex wire i 6 stykker med længder på 5,0 cm. skræl off polytetrafluorethylen (PTFE) belægning i begge ender af alle wire stykkerne med længder af ~5.0 mm. Tilslut den ene ende af hver af wire stykkerne til en af de åbne metallisk huller (EMG-ECG-BR kanaler) på den EIB med en guldnål.
- Skære en emalje wire i to 5.0-cm stykker. Lodde ene ende af hver af disse ledninger til jorden/reference (g/r) kanaler på EIB (figur 3, se også tidligere papirer12,13).
- For forberedelse af EKG-elektroderne, skære en bioflex wire i to 16-cm stykker. Skrælle PTFE coating af enderne af disse wire stykker på længder af ~5.0 mm på ene ende (korte ende) og ~ 15 mm på anden enden (lange ende).
- Danne en wire ring med en diameter på 2,0 mm bøjning den lange ende af wiren, og om fastsættelse af formen af ringen af lodning.
- For forberedelse af EMG elektroder, skære en bioflex wire i 2 stykker med længder på 8 cm. skræl off PTFE coating fra begge ender af disse stykker, wire med længder af ~5.0 mm.
- For forberedelse af BR elektroder, skære en bioflex wire i 2 stykker med længder på 6,0 cm. skræl off den emalje belægning i begge ender af disse stykker, wire med længder af ~5.0 lodde mm. ene ende af hver af disse wire stykker i hovedet af en rustfrit stål skrue (stilk dia meter: 1,0 mm, stamceller længde: 4,0 mm).
- Til forberedelse af jorden/referenceelektroder (gr), skåret en emalje wire i 2 stykker med længder på 6,0 cm. skræl off den emalje belægning i begge ender af disse stykker, wire med længder af ~5.0 mm. lodde ene ende af hver af disse wire stykker i hovedet af en rustfri-st ål skrue (stamceller diameter: 1,4 mm, stamceller længde: 3,0 mm).
- Gas sterilisere alle elektroder og rustfri skruer og holde disse i en rent plads.
2. implantation af EKG/EMG elektroder
Bemærk: Udfør alle kirurgiske skridt med aseptisk teknik ved hjælp af steriliseret handsker og autoklaveres instrumenter. Alle trin, der indebærer oprettelse af et snit, sterilisere huden med 70% ethanol før og dække snit med kirurgisk gardiner.
- Lave en bedøvede (1.0-3.0% isofluran gas) rotte på ryggen på en flad varme pad. Give buprenorphin som en smertestillende. Placer veterinære salve på rottens øjne til at forhindre tørhed. Bruge betadine for at rengøre overfladen af huden.
- Gøre et snit på ~2.0 cm i den mediale brystet. Udsætte den interkostale muskulatur ved at adskille brystmusklerne. Sutur ringene af EKG-elektroder til den interkostale muskulatur.
- Rette maven af dyret på varme pad. Gøre et snit på ~1.0 cm i den dorsale halsområdet.
- Indsæt EKG-elektroderne subkutant gennem brystet snit. Skubbe enderne til dorsale hals-området, og trække dem ud fra hals indsnit. Sutur brystet indsnit.
- Sæt den ene ende af hver af EMG elektroderne subkutant til en længde på ~2.0 cm gennem halsen snit. Fix EMG elektroder til nakke muskler ved suturering.
3. implantation af matrixen Integrativ Micro-drev og BR elektroder
- Fix rotten på et stereotaxisk enhed. Gøre et snit på ~3.0 cm på hovedet langs midterlinjen fra punktet mellem øjnene til hals-området. Udsætte kraniet.
- Gøre to cirkulære craniotomies med diameter på 0,7-1,0 mm over lugtekolben 11,0 mm anterior og 1 mm bilaterale til bregma med en højhastigheds boremaskine. Implantat to BR elektroder i kraniet, indtil spidsen af skruen stængler er knyttet til hjernens overflade.
- Foretage to cirkulære craniotomies med diameter på 0,7-1,0 mm over den frontale cortex 2,7 mm anterior og 2,7 mm bilaterale bregma. Implantat to g/r elektroder i kraniet, indtil spidsen af skruen stilk er knyttet til hjernens overflade.
- Lave seks til otte huller med diameter 1.0 mm i området omkring de store kraniotomi. Implantat anker skruer (stamceller diameter: 1,4 mm, stamceller længde: 3,0 mm) i kraniet.
- Foretage en stor cirkulær kraniotomi med en diameter på ~2.0 mm over hippocampus 3,8 mm bageste og 2,5 mm bilaterale bregma. Placer Integrativ mikro-drev array således at kanylen spidsen af matrixen drev er placeret over den store kraniotomi
- Fyld hullet plads mellem kanyle tip og hjernen overflade med ~ 100 µL af to løsninger, dvs., 0,5% (vægtprocent) natriumalginat og 10% (vægtprocent) calciumchlorid.
Bemærk: Denne proces danner en gennemsigtig gel i ~ 5 min, efter de to løsninger er blandet på kraniet. - Dække kanylen, BR elektroder, g/r elektroder, og anker skruer med dental cement med en tykkelse på 0,5 cm. være forsigtig ikke at dække de åbne ender af BR og g/r elektroder med cement på dette trin.
- Lodde de åbne ender af EKG, EMG, BR og g/r elektroderne til individuelle wire tips, der var tidligere forbundet til EIB (Se trin 1.2 og 1.3).
- Dække den nederste del af matrixen Integrativ mikro-drev, og alle elektrode ledninger med dental cement. Sikre, at alle elektrode ledningerne er helt dækket , således at rotten ikke kan ridse dem efter implantation.
- Efter at genvinde tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency, returnere dyret til sin gennemsigtige Plexiglas hjem cag, og holde det på sin egen med fri adgang til vand og mad. Efter operationen, behandling af dyr med antibiotika (gentamicin).
- Efter kirurgi, overvåge dyr med daglig observation. Check at de gå ordentligt, og at de ikke knirke når eksperimentatoren rører mikro-drev array.
4. in Vivo optagelser
Bemærk: Alle signalerne forstærkes, stikprøven ved 2 kHz, og sporgruppe-pass filtreret (0,1 - 500 Hz) undtagen enhed aktiviteter (stikprøven på 30 kHz og sporgruppe-pass filtreret (500-6 kHz)).
- Tilslut EIB af matrixen Integrativ micro-drive til headstage af en optageenhed.
- Fremme af Tetroder ved at dreje på skruerne for et par uger efter operationen. Når Tetroder er støder op til hjernen målområderne, løse Tetroder i områderne over en periode på flere dage for stabile optagelser.
- Overvåge de elektriske signaler, mens dyret frit bevæger sig i en optagelse kammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode kan samtidig indfange bioelektriske signaler fra flere organer, der repræsenterer den neuronal aktivitet i hjernen, puls, vejrtrækning rytme og skeletmuskulatur sammentrækninger (figur 1). Figur 4 giver repræsentative optagelse data fra en frit bevægende rotte, der frit fouragering i en rektangulær kasse (25 × 40 cm2). Eksempel datasættet omfatter typisk adfærdsmæssige overgange mellem bevæger sig og hvile stater. En power spectrum var beregnet fra hippocampus LFP spor af wavelet analyse. BR signalet optaget fra den overflade område af olfaktoriske pære blev brugt til groft beregne de relative ændringer i vejrtrækning frekvenser, som dem, der opstår under sonderende snuse adfærd.
Figur 1 : Illustration af registreringssystem til overvågning flere hjerne-krop-signaler fra en frit bevægende rotte. Alle bioelektriske signaler (LFP, ECG, EEG, BR signaler) fra en frit bevægende rotte er indsamlet i matrixen Integrativ microdrive monteret på hovedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : En integrativ mikro-drev array. Alle LFP, EKG, EEG og BR signaler transmitteres til hullerne på EIB, som er angivet med pilene. Den stiplede område er forstørret i højre panel og viser nogle af Tetroder stikker ud fra matrixen mikro-drev, der er indsat i hjernevæv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : En top Se EIB 's. EIB omfatter 24 kortikale LFP (LFP) kanaler, der er forbundet med Tetroder, 2 ECG kanaler, 2 EMG kanaler, 2 BR kanaler og 2 jorden (Gr) kanaler. Alle kanaler undtagen LFP kanaler var forbundet til isolerede ledninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Et eksempel på den samtidige multi-kanal optagelse af bioelektriske signaler.
(Fra top til bund) LFP signaler i den somatosensoriske cortex (skalalinjen: 250 µV). LFP signaler i CA1 hippocampus området (skalalinjen: 500 µV). Et farvekodede magt spektrum af hippocampus LFP sporing. En EKG-signalet (sporgruppe-pass filtreret på 20-200 Hz, skalalinjen: 500 µV). En EMG signal (sporgruppe-pass filtreret på 100-500 Hz, skalalinjen: 100 µV). En BR signal (skalalinjen: 500 µV). Et farvekodede magt spektrum af BR signal, der angiver sniffing adfærd som defineret af en forbigående stigning i åndedræt sats. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at forstå hvordan hjernen modulerer perifere aktivitetsniveau, og vice versa, storstilet optagelse metoder til at samtidig indfange elektriske biosignalers fra flere krop områder er nødvendige. Denne undersøgelse beskrev en kirurgisk procedure, og en optagelse system til overvågning af cerebral lokale felt potentialer, hjerte rum, omfanget af muskel opførelse og respiratorisk satser, der er blevet forbedret på et registreringssystem, der bruges til ekstracellulære optagelser i hjernevæv. Dette system indsamler elektriske signaler fra både hjernen og de perifere organer i en enkelt EIB på en integrativ mikro-drev array. Forberedelse af matrixen Integrativ mikro-drev bør indledes mindst flere timer før operationen, som det tager tid. Her drev array indeholder Tetroder til optagelse af hjernen lokale felt potentialer, men andre typer af metal elektroder, såsom platinum og wolfram elektroder, kan knyttes til EIB, hvis enderne af disse elektroder er korrekt loddet. Når du følger de kirurgiske procedurer i protokollen, har erfarne eksperimentatorer været i stand til at fuldføre alle procedurer inden for 2-3 h.
Et kritisk trin i denne protokol er placering af elektroderne på væv, især for EKG og EMG elektroderne. Flere uddannelse gentagelser kan være nødvendigt at opnå stabile optagelser. Til dato, har alle optagelser været stabil i mindst en måned efter operationen. Eksperimentatorer bør bemærke, at hvis signal-støj forhold til den registrerede data bliver lav, problemet er ofte på grund af løs optagelse af jorden/referenceelektroder eller utilstrækkelig lodning af enderne af ledningerne mellem EIBs eller anden ende af ledninger. Sammenlignet med en konventionel elektrofysiologiske optagelse ved hjælp af nogle uafhængige enheder, er fordelene ved denne metode at (1) det er teknisk simpelt at gennemføre, hvis uddannet flere gange, (2) det kræver ikke et kommunikationssystem til at synkronisere flere enheder, (3) når det reducerer de samlede eksperimentelle omkostninger, som kun en optageenhed der kræves, og (4) alle indspillede data filer kan håndteres af den samme forarbejdningsmetode og program, som øger effektiviteten af dataanalyse. Desuden, den metodologiske koncept gælder for mange kombinationer af flere områder af hjernen og perifere organer, herunder åndedrætsorganerne, kredsløbssygdomme og autonome nervesystem. Det gælder også for ethvert kommercielt tilgængelige elektrisk optageenhed. Samtidig overvågning af systemisk fysiologiske aktivitet mønstre ved hjælp af denne metode vil være nyttigt at belyse neuronal aktivitet mønstre i forskellige fysiologiske stater mod følelsesmæssige udfordringer, eksterne sensoriske graduering, og patologisk sygdomme, fører til en øget forståelse for de biologiske mekanismer bag foreningen hjerne-krop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kak-Hej 17 H 05939; 17 H 05551, Nakatomi Foundation og Suzuken Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
- Kloosterman, F., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication. JoVE. (26), e1094 (2009).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (26), e1098 (2009).
- Jog, M. S., et al. Tetrode technology: advances in implantable hardware, neuroimaging, and data analysis techniques. J Neurosci Methods. 117 (2), 141-152 (2002).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nat Protoc. 11 (1), 61-86 (2016).
- Rossi, S., et al. The effect of aging on the specialized conducting system: a telemetry ECG study in rats over a 6 month period. PLoS One. 9 (11), 112697 (2014).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. JoVE. (57), (2011).
- Zeredo, J. L., Kumei, Y., Shibazaki, T., Yoshida, N., Toda, K. Measuring biting behavior induced by acute stress in the rat. Behav Res Methods. 41 (3), 761-764 (2009).
- Young, G. A., Khazan, N. Electromyographic power spectral changes associated with the sleep-awake cycle and with diazepam treatment in the rat. Pharmacol Biochem Be. 19 (4), 715-718 (1983).
- Oishi, Y., et al. Polygraphic Recording Procedure for Measuring Sleep in Mice. JoVE. (107), e53678 (2016).
- Chaput, M. A. Respiratory-phase-related coding of olfactory information in the olfactory bulb of awake freely-breathing rabbits. Physiol Behav. 36 (2), 319-324 (1986).
- Ravel, N., Pager, J. Respiratory patterning of the rat olfactory bulb unit activity: Nasal versus tracheal breathing. Neurosci Lett. 115 (2-3), 213-218 (1990).
- Okada, S., Igata, H., Sakaguchi, T., Sasaki, T., Ikegaya, Y. A new device for the simultaneous recording of cerebral, cardiac, and muscular electrical activity in freely moving rodents. J Pharmacol Sci. 132 (1), 105-108 (2016).
- Sasaki, T., Nishimura, Y., Ikegaya, Y. Simultaneous Recordings of Central and Peripheral Bioelectrical Signals in a Freely Moving Rodent. Biol Pharm Bull. 40 (5), 711-715 (2017).
