Summary
Diese Studie stellt eine Methode für die gleichzeitige Aufzeichnung von lokales Feld Potenziale im Gehirn, EKG, Elektromyogrammen und Signale einer frei beweglichen Ratte zu atmen. Diese Technik, die experimentelle Kosten reduziert und vereinfacht die Analyse der Daten, wird zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Gehirn und periphere Organe beitragen.
Abstract
Überwachung der physiologischen Dynamik des Gehirns und des peripheren Geweben ist notwendig für eine Reihe von Fragen, wie das Gehirn kontrolliert Körper Funktionen und inneren Organe Rhythmen, wenn Tiere emotionale Herausforderungen und Veränderungen in ausgesetzt sind ihrer Wohnwelten. Im Allgemeinen werden Experimente, Signale von verschiedenen Organe wie das Gehirn und das Herz von unabhängigen Recording-Systeme erfasst, die mehrere Aufnahmegeräte und verschiedene Verfahren für die Bearbeitung der Datendateien erfordern. Diese Studie beschreibt eine neue Methode, die gleichzeitig elektrischen Biosignalen überwachen können, darunter Zehntausende lokales Feld Potenziale in mehreren Hirnregionen, Elektrokardiogramme, die das Herzrhythmus darstellen, Elektromyogrammen, die wach darstellen / schlafbezogenen Muskelkontraktion und Signale in einer frei beweglichen Ratte zu atmen. Aufnahmekonfiguration dieser Methode basiert auf eine konventionelle Mikro-Laufwerk-Array für kortikale lokales Feld möglicher Aufnahmen, in denen zig Elektroden untergebracht und die Signale, die von diesen Elektroden erhalten sind integriert in einem einzigen Schalttafel montiert auf den Kopf des Tieres. Hier wurde diese Aufnahme-System verbessert, so dass Signale aus den peripheren Organen auch eine elektrische Schnittstelle-Board übertragen werden. In einer einzigen Operation werden Elektroden zuerst separat in die entsprechenden Körperteile und den Zielgebieten Gehirn implantiert. Die offenen Enden der all diese Elektroden werden dann auf einzelne Kanäle von der Schalttafel über dem Kopf des Tieres verlötet, so dass alle Signale in elektrische Einplatinen integriert werden können. Dieses Board zu einem Aufnahmegerät anschließen ermöglicht die Sammlung aller Signale in einem einzigen Gerät, das experimentelle Kosten reduziert und vereinfacht, Datenverarbeitung, da alle Daten in der gleichen Datendatei behandelt werden können. Diese Technik wird das Verständnis für die neurophysiologische Korrelate der Zusammenhänge zwischen zentralen und peripheren Organe unterstützen.
Introduction
Das zentrale Nervensystem steuert Körper Staaten als Reaktion auf verschiedene Veränderungen der Umwelt, und dieses Steuerelement ist in der Regel als Veränderungen der Herzfrequenz, Atemfrequenz und Muskelkontraktionen vertreten. Jedoch haben einige Studien getestet wie periphere physiologische Faktoren kortikale Aktivität zugeordnet sind. Um dieses Problem zu beheben, ist eine groß angelegte Aufnahmemethode zur Überwachung von elektrischen Biosignalen von zentralen und peripheren Gewebe notwendig. In der Großhirnrinde sind lokale Feld möglicher (LFP) Signale extrazellulär von Elektroden aufgenommen, die in der kortikalen Gewebe1,2,3eingefügt werden. Um gleichzeitig mehrere LFP-Signale aus den kortikalen Regionen kleine Säugetiere wie Ratten und Mäuse, aufzuzeichnen haben eine Reihe von Studien verschiedene Arten von maßgeschneiderten Elektroden-Einheiten entwickelt, die Mikro-Laufwerke bezeichnet werden. Einem konventionellen Mikro-Antrieb besteht aus Metall Schrauben befestigt, die mittleren Teile der Elektroden (die in der Regel Tetroden sind), ein Kernkörper, der die Schrauben und die Elektroden unterbringt und eine elektrische Schnittstelle-Board (EIB), das Metall Löcher, bietet Platz für Schließen Sie die offenen Enden der Elektroden (Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3). Diese Elektrodenanordnung ermöglicht dem Bediener die Tiefe der vielen Elektroden in das Gehirn im Laufe von Tagen bis Wochen eingesetzt Steuern und ermöglicht die Durchführung von chronischen Langzeitaufzeichnungen neuronaler Aktivität wie das Tier mit verschiedenen in Frage gestellt wird Verhaltens Aufgaben. In den peripheren Organen Herzschlag Signale werden durch zwei Elektroden, die am oder um das Herz Bereich4,5,6implantiert werden als Elektrokardiogramm (EKG) aufgezeichnet und Skelettmuskulatur Signale aufgezeichnet als Elektromyogrammen (EMGs) mit Elektroden, die in den Muskel Gewebe7,8,9eingefügt werden. Die Beziehung zwischen elektrischen Signale von den Riechkolben und Atemrhythmus (BR) wurde mit Einheit Aufnahmen10,11untersucht. In herkömmlichen Aufzeichnungssysteme, diese Signale aus verschiedenen Geweben erfasst wurden von unabhängigen Aufnahmegeräte, was bedeutet, dass ein zusätzliches experimentelle System erforderlich ist, um genau diese mehrere Geräte für synchronisieren gleichzeitigen Aufnahmen von Gehirn-Körper-Signale. Dieses System wurde entwickelt, um dieses Problem zu umgehen. In diesem System sind alle elektrischen Signale aufgezeichnet aus den peripheren Organen, einschließlich EKG, EMGs und elektrische Signale von den Riechkolben, die den Atemrhythmus zu reflektieren in einem einzigen Micro-Drive Array1,2 integriert. ,3, hier ein integrativer Micro-Drive Array bezeichnet. Dieses System erfordert nur eine Mehrkanal-Aufnahme-Gerät und ist anwendbar auf jedem herkömmlichen Mikro-Laufwerk-Array. Die Vorteile dieser Technik sind, dass es keiner, keine spezielle Geräte oder Triggersignale entsprechend der Aufnahmedauer von mehreren Geräten und ermöglicht es bequemer Datenverarbeitung, da alle Signale als ähnliche Datentypen aufgezeichnet werden. Diese Technik wird das Verständnis für die neurophysiologische Korrelate der Zusammenhänge zwischen zentralen und peripheren Organe unterstützen. Dieses Whitepaper beschreibt die Verfahren in Zusammenhang mit der Technik und präsentiert repräsentative Datasets aus einer Ratte gewonnen.
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Protocol
Alle Verfahren mit tierische Themen wurden nach dem NIH-Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt.
1. Vorbereitung des integrativen Micro-Drive Arrays
- Erstellen eines Micro-Drive Arrays für kortikale LFP-Aufnahmen wie beschrieben an anderer Stelle1,2,3. Lassen Sie mindestens 6 Metall Löcher öffnen auf eine Elektrode Schnittstellenkarte (EIB) für den Einsatz als ECG/EMG/BR-Kanäle, die mit Bioflex Drähte verbunden sind, wie unter 1.2 beschrieben.
- Schneiden Sie einen Bioflex Draht in 6 Stücke mit einer Länge von 5,0 cm. Schale aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Beschichtung von beiden Enden der Draht-Stücke mit einer Länge von ~5.0 mm. Schließen Sie ein Ende der einzelnen Stücke Draht zu eines der offenen metallisches Löcher (ECG/EMG/BR-Kanäle) auf die EIB mit einem gold-Pin.
- Schneiden Sie einen Emaille-Draht in zwei 5,0-cm-Stücke. Löten Sie ein Ende eines dieser Kabel für Bezugsmasse (g/R) Kanäle auf die EIB (Abbildung 3, siehe auch vorherigen Papiere12,13).
- Für die Zubereitung von EKG-Elektroden, einen Bioflex Draht in zwei 16 cm-Stücke schneiden. Die PTFE-Beschichtung der Enden dieser Draht-Stücke in Längen von ~5.0 mm an einem Ende (kurze Ende) und ~ 15 mm am anderen Ende (lange Ende) abziehen.
- Bilden Sie einen Drahtring mit einem Durchmesser von 2,0 mm durch biegen das lange Ende des Drahtes, und fixieren die Form des Ringes durch Löten.
- Schneiden Sie für die Zubereitung von EMG-Elektroden einen Bioflex Draht in 2 Stücke mit einer Länge von 8 cm. Schale aus PTFE-Beschichtung von beiden Enden dieser Draht-Stücke mit einer Länge von ~5.0 mm.
- Für die Vorbereitung der BR Elektroden, schneiden Sie einen Bioflex Draht in 2 Stücke mit einer Länge von 6,0 cm. Peel off der Emaillierung von beiden Enden dieser Draht-Stücke mit einer Länge von ~5.0 Löten mm. ein Ende jedes dieser Stücke Draht auf den Kopf einer Schraube aus rostfreiem Stahl (Stamm dia Messgerät: 1,0 mm, Länge stammen: 4,0 mm).
- Für die Zubereitung von Boden/Referenzelektroden (Gr) Schnitt ein Emaille-Draht in 2 Stücke mit einer Länge von 6,0 cm. Peel off der Emaillierung von beiden Enden dieser Draht-Stücke mit einer Länge von ~5.0 mm. Löten ein Ende jedes dieser Stücke Draht auf den Kopf von einer Edelstahl-st Aal-Schraube (Stamm Durchmesser: 1,4 mm, Länge stammen: 3,0 mm).
- Gas sterilisieren alle Elektroden und Edelstahlschrauben und bewahren Sie diese auf eine saubere Unterkunft.
2. Implantation der EKG/EMG-Elektroden
Hinweis: Führen Sie alle OP-Schritte mit aseptischen mit sterilen Handschuhen und autoklaviert Instrumente. Sterilisieren Sie für alle Schritte, die die Schaffung von einen Einschnitt die Haut mit 70 % Ethanol vor und decken Sie die Inzision mit OP-Tüchern.
- Beheben eines narkotisierten Ratte (1,0-3,0 % Isofluran Gas) auf dem Rücken auf einer flachen Wärmekissen. Buprenorphin als Schmerzmittel zu geben. Legen Sie tierärztliche Salbe auf die Ratte Augen Trockenheit zu verhindern. Betadine, reinigen Sie die Oberfläche der Haut zu verwenden.
- Machen Sie einen Schnitt von ~2.0 cm, im medialen Brustbereich. Setzen Sie die Zwischenrippenmuskeln durch die Trennung der Brustmuskulatur. Die Ringe des EKG-Elektroden, die Zwischenrippenmuskeln Naht.
- Befestigen Sie den Magen des Tieres auf das Wärmekissen. Machen Sie einen Schnitt von ~1.0 cm im dorsalen Halsbereich.
- Legen Sie die EKG-Elektroden subkutan durch die Brust Schnitt. Schieben Sie die Enden an der dorsalen Hals-Bereich, und ziehen Sie sie heraus aus der Hals-Schnitt. Naht der Brust Schnitt.
- Stecken Sie ein Ende eines jeden der EMG-Elektroden subkutan auf eine Länge von ~2.0 cm durch den Hals Schnitt. Befestigen Sie die EMG-Elektroden an den Hals Muskel durch Vernähen.
3. die Implantation des integrativen Micro-Drive Arrays und die BR-Elektroden
- Befestigen Sie die Ratte auf einem stereotaktischen Gerät. Machen Sie einen Schnitt von ~3.0 cm am Kopf entlang der Mittellinie vom Punkt zwischen den Augen um den Hals-Bereich. Setzen Sie den Schädel.
- Nehmen Sie zwei kreisförmige Kraniotomien mit einem Durchmesser von 0,7-1,0 mm über den Riechkolben anterior 11,0 mm und 1 mm bilaterale an Bregma mit einem High-Speed-Bohrer. Implantat zwei BR-Elektroden in den Schädel, bis die Spitzen der Schraube Stiele an der Oberfläche des Gehirns verbunden sind.
- Nehmen Sie zwei kreisförmige Kraniotomien mit einem Durchmesser von 0,7-1,0 mm über dem frontalen Kortex anterior 2,7 mm und 2,7 mm Bregma bilateralen. Implantat zwei g/R-Elektroden in den Schädel, bis die Spitze des Stengels Schraube an der Oberfläche des Gehirns verbunden ist.
- Machen Sie sechs bis acht Löcher mit einem Durchmesser von 1,0 mm in der Umgebung der großen Kraniotomie. Implantat-Ankerschrauben (Stamm Durchmesser: 1,4 mm, Länge stammen: 3,0 mm) in den Schädel.
- Nehmen Sie eine große kreisförmige Kraniotomie mit einem Durchmesser von ~2.0 mm über der Hippocampus posterior 3,8 mm und 2,5 mm Bregma bilateralen. Integrative Mikro-Laufwerk-Arrays zu platzieren, so dass der Kanülenspitze des Laufwerk-Arrays über die großen Kraniotomie befindet
- Füllen die Lücke Raum zwischen der Kanülenspitze und der Gehirn-Oberfläche mit ~ 100 µL der beiden Lösungen, d. h.., 0,5 % (durch Masse) Natriumalginat und 10 % (durch Masse) Kalzium-Chlorid.
Hinweis: Dieser Prozess bildet ein transparentes Gel in ~ 5 Minuten, nachdem die beiden Lösungen auf den Schädel gemischt werden. - Decken, der Kanüle, BR-Elektroden, g/R Elektroden und Ankerschrauben mit dental Zement mit einer Dicke von 0,5 cm. vorsichtig nicht um die offenen Enden der BR und g/R Elektroden mit dem Zement bei diesem Schritt zu decken.
- Löten Sie die offenen Enden der EKG, EMG, BR und g/R Elektroden bis zu den einzelnen Draht, die zuvor mit der EIB verbunden waren (siehe die Schritte 1.2 und 1.3).
- Das Unterteil des integrativen Mikro-Laufwerk-Arrays und alle Elektrodenleitungen mit dental Zement zu decken. Stellen Sie sicher, dass alle Elektrodenleitungen vollständig bedeckt sind, so dass die Ratte nicht sie nach der Implantation neu kann.
- Zurückkehren Sie nach Wiederherstellung des ausreichenden Bewusstseins zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen das Tier zu seiner transparenten Plexiglas nach Hause Cag, und halten Sie es allein mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung. Nach der Operation behandeln Sie das Tier mit Antibiotika (Gentamicin).
- Überwachen Sie nach der Operation die Tiere mit täglichen Beobachtung. Überprüfen Sie, dass sie richtig gehen und sie nicht quietschen zu tun, wenn der Experimentator des Mikro-Laufwerk-Arrays berührt.
4. in-Vivo -Aufnahmen
Hinweis: Alle Signale werden verstärkt, bei 2 kHz abgetastet und Bandpass gefiltert (0,1 - 500 Hz) mit Ausnahme von Aktivitäten (bei 30 kHz abgetastet und Bandpass gefiltert (500-6 kHz)).
- Die EIB des integrativen Micro-Drive Arrays an die Headstage von einem Aufnahmegerät anschließen.
- Die Tetroden durch Drehen der Schrauben für ein paar Wochen nach der Operation voraus. Sobald die Tetroden neben den Zielgebieten Gehirn sind, begleichen Sie die Tetroden in den Bereichen über einen Zeitraum von mehreren Tagen für stabile Aufnahmen.
- Die elektrischen Signale zu überwachen, während das Tier bewegt sich frei in einer Aufnahme-Kammer.
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Representative Results
Diese Methode kann gleichzeitig bioelektrische Signale von mehreren Organen erfassen, die die neuronale Aktivität des Gehirns, Herzschlag, Atmung, Rhythmus und skelettartiger Muskel-Kontraktionen (Abbildung 1)darstellen. Abbildung 4 stellt repräsentative Erfassung von Daten aus einem frei beweglichen Ratte, die in einem rechteckigen Feld (25 × 40 cm2) frei auf Futtersuche war. Die Beispiel-Dataset enthält typische Verhaltensstörungen Übergänge zwischen bewegten und ruhenden Staaten. Ein Leistungsspektrum wurde aus einer hippocampal LFP-Ablaufverfolgung von Wavelet-Analyse berechnet. Das BR-Signal von der Fläche von den Riechkolben aufgezeichnet wurde verwendet, um grob schätzen der relativen Veränderung der Atmung Frequenzen, wie beim Schnupfen exploratives Verhalten auftreten.
Abbildung 1 : Darstellung der Recording-System für die Überwachung mehrerer Gehirn-Körper-Signale aus einer frei beweglichen Ratte. Alle bioelektrische Signale (LFP, EKG, EEG, BR Signale) aus einem frei beweglichen Ratte werden gesammelt in das integrative Microdrive-Array auf dem Kopf montiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Eine integrative Micro-Drive Array. Alle LFP, EKG, EEG und BR Signale werden in die Löcher auf der EIB übertragen, wie durch die Pfeile angedeutet. Der gepunktete Bereich wird auf der rechten Seite vergrößert und zeigt einige der die Tetroden ragen aus der Mikro-Laufwerk-Array, die in das Hirngewebe eingefügt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Eine Draufsicht der EIB. Die EIB umfasst 24 kortikalen LFP (LFP) Kanäle, die die Tetroden verbunden sind, 2 ECG-Kanäle, 2 EMG-Kanäle, 2 BR-Kanäle und 2 Boden (Gr)-Kanäle. Alle Kanäle außer dem LFP-Kanäle verbunden waren isolierte Drähte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Ein Beispiel für die gleichzeitige Multi-Kanal-Aufnahme bioelektrische Signale.
(Von oben nach unten) LFP-Signale im somatosensorischen Cortex (Maßstabsleiste: 250 µV). LFP-Signale in der hippocampalen CA1-Region (Maßstabsleiste: 500 µV). Eine farbcodierte Leistungsspektrum der hippocampalen LFP-Ablaufverfolgung. Ein EKG-Signal (Bandpass gefiltert bei 20-200 Hz, Maßstabsleiste: 500 µV). Eine EMG-Signals (Bandpass gefiltert mit 100-500 Hz, Maßstabsleiste: 100 µV). Ein BR-Signal (Maßstabsleiste: 500 µV). Eine farbcodierte Leistungsspektrum des BR-Signals angibt, schnüffeln Verhalten definiert durch ein vorübergehender Anstieg der Atemfrequenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Für das Verständnis, wie das Gehirn moduliert peripheren Bewegungsstufen und Vice Versa, großflächige Aufnahme Methoden zur elektrischen Biosignalen aus mehreren Körperregionen gleichzeitig zu erfassen sind notwendig. Diese Studie beschrieben ein chirurgischer Eingriff und eine Aufnahme-System für die Überwachung der zerebralen lokales Feld Potentiale, Herzfrequenzen, das Ausmaß der Muskelaufbau und Atemfrequenz, der auf eine Aufnahme-System verbessert worden, die für verwendet wird extrazelluläre Aufnahmen im Gehirngewebe. Dieses System sammelt elektrische Signale aus dem Gehirn und die peripheren Organe in einer einzigen EIB auf einem integrativen Mikro-Laufwerk-Array. Die Vorbereitung des integrativen Micro-Drive Arrays sollte mindestens ein paar Stunden vor der Operation begonnen werden, da es einige Zeit dauert. Hier das Laufwerk-Array enthält Tetroden für die Aufzeichnung von Gehirn lokales Feld Potentiale, aber die anderen Arten von Metall-Elektroden, z. B. Platin und Wolfram-Elektroden, können an die EIB angebracht werden, wenn die Enden der diese Elektroden richtig gelötet werden. Beim Anschluss an der chirurgischen Eingriffen im Protokoll, konnten erfahrenen Experimentatoren die Verfahren innerhalb von 2-3 Stunden ausführen.
Ein wichtiger Schritt innerhalb dieses Protokolls ist die Platzierung der Elektroden auf das Gewebe, vor allem für die EKG und EMG-Elektroden. Mehrere Wiederholungen der Ausbildung müssen stabile Aufnahmen zu erhalten. Bisher haben alle Aufnahmen mindestens einen Monat nach der Operation stabil. Experimentatoren sollten beachten, dass, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis der aufgezeichneten Daten zu niedrig werden, dieses Problem häufig aufgrund von losen Fixierungen der Bezugsmasse/Elektroden oder unzureichende Löten von den Enden der Drähte zwischen der EIB oder den anderen Enden der Drähte. Im Vergleich mit einer konventionellen elektrophysiologischen Aufnahme einige unabhängige Geräte verwenden, sind die Vorteile dieser Methode, dass (1) Es ist technisch einfach zu führen, wenn mehrere Male trainiert, (2) Es ist nicht erforderlich, ein Kommunikationssystem zu synchronisieren mehrere Geräte (3) es die insgesamt experimentellen Kosten reduziert, da nur ein Aufnahmegerät erforderlich ist, und (4) alle aufgenommenen Daten Dateien behandelt werden können, durch die gleichen Verarbeitungsmethode und Programm, das erhöht die Effizienz der Datenanalyse. Darüber hinaus gilt das methodische Konzept für viele Kombinationen von mehreren Hirnregionen und peripheren Organe, einschließlich der Atemwege, Herz-Kreislauf-System und vegetative Nervensystem. Es gilt auch für alle im Handel erhältlichen elektrischen Aufnahmegerät. Gleichzeitige Überwachung von systemischen physiologischen Aktivitätsmuster mit dieser Methode werden hilfreich bei der Aufklärung der neuronalen Aktivitätsmuster in verschiedenen physiologischen Zuständen gegen emotionale Herausforderungen, externe sensorische Modulation und pathologischen Krankheiten, was zu einem besseren Verständnis der biologischen Mechanismen, die das Gehirn-Körper-Verband.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Kaken-Hallo (17 H 05939; 17 H 05551), die Nakatomi-Stiftung und der Suzuken Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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