Summary
이 연구는 두뇌, 심전도, 근, 로컬 필드 전위의 동시 녹음 하 고 자유롭게 움직이는 쥐의 신호를 호흡 하는 방법을 소개 합니다. 이 기법을 실험 비용 절감 및 데이터 분석을 단순화, 뇌 및 말 초 기관 간의 상호 작용의 이해에 기여할 것입니다.
Abstract
주변 조직과 뇌의 생리 적인 역학을 모니터링 하는 것이 어떻게 뇌 컨트롤 몸 기능 및 내부 장기 리듬 동물 정서적 과제와 변화에 노출 되 면에 대 한 질문의 번호를 주소 지정을 위해 필요한 그들의 생활 환경입니다. 일반적으로 실험, 신호는 뇌와 심장 등 다른 장기에서 데이터 파일을 처리 하기 위한 여러 녹음 장치 및 다른 절차를 필요로 하는 독립적인 녹음 시스템에 의해 기록 됩니다. 이 연구는 동시에 로컬 필드 전위의 수만 포함 하 여 여러 뇌 영역, 심전도 심장 리듬을 나타내는, 나타내는 깨어 근 전기 biosignals를 감시할 수 있는 새로운 방법 설명 / 수 면 관련 근육 수축, 그리고 자유롭게 움직이는 쥐에서 신호를 호흡. 이 방법의 녹음 구성은 대뇌 피 질의 로컬 필드 잠재적인 기록 전극의 수만 수용 된다, 그리고이 전극에서 얻은 신호는 단일 통합에 대 한 기존의 마이크로 드라이브 어레이 기반 전기 보드 동물의 머리에 장착. 여기,이 녹음 시스템은 향상 주변 기관에서 신호는 전기 인터페이스 보드에 전송 됩니다. 단일 수술에서 전극 별도로 적절 한 신체 부위 및 대상 뇌 영역으로 이식 처음입니다. 모든 신호는 단일 전기 보드에 통합 될 수 있도록 모든이 전극의 열린 끝 다음 동물의 머리 위에 전기 보드의 개별 채널을 납땜 된다. 녹음 장치에 연결 하는이 보드 실험 비용 감소와 같은 데이터 파일에 모든 데이터를 처리할 수 있기 때문에 데이터 처리를 간소화 하는 단일 디바이스에 신호의 모든 컬렉션에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 중앙과 주변 기관 사이 협회의 신경 생리학 상호의 이해를 도움이 됩니다.
Introduction
중앙 신경 다양 한 환경 변화에 응답으로 몸 상태를 제어 하 고이 컨트롤은 일반적으로 심장 박동, 호흡 속도 및 근육 수축에 변경으로 표시 됩니다. 그러나, 몇 가지 연구는 어떻게 이러한 주변 생리 적인 요인 대뇌 피 질의 활동와 관련 된 테스트. 이 문제를 해결 하려면 전기 biosignals 중앙 및 주변 조직에서 모니터링 하는 대규모 기록 방법을 필요 하다. 대뇌 피 질에서 로컬 필드 가능성 (LFP) 신호 extracellularly 대뇌 피 질의 조직1,2,3에 삽입 된 전극에 의해 기록 됩니다. 동시에 작은 포유류, 쥐, 쥐 등의 피 질 영역에서 여러 LFP 신호를 기록 하기 위해 다양 한 연구 마이크로 드라이브 라고 하는 주문 품 전극 어셈블리의 다양 한 종류를 개발 했습니다. 기존의 마이크로 드라이브는 금속 나사 전극 (이것은 일반적으로 tetrodes), 나사 및 전극, 수용 코어 바디와 금속 구멍을 수용 하는 전기 인터페이스 보드 (EIB)의 중간 부분에 연결 된 구성 (그림 1, 그림 2및 그림 3) 전극의 열린 끝을 연결 합니다. 이 전극 어셈블리 많은 전극 주, 일의 과정을 통해 두뇌에 삽입의 깊이 제어 하는 연산자를 사용 하 고 동물 다양 한 도전을 신경 활동의 장기 만성 녹음의 실시 수 있습니다. 행동 작업입니다. 주변 장기에 하트 비트 신호 또는 심장 지역4,,56주위에 이식 되는 전극의 쌍으로 심전도 (ECGs)으로 기록 하 고 골격 근육 신호 기록 된다 근 (EMGs) 전극으로 서는 근육 조직7,,89에 삽입 됩니다. 후 각 전구의 전기 신호 및 호흡 (BR) 리듬의 관계는 단일 단위 기록10,11공부 했다. 기존의 시스템에서 다른 조직에서 이러한 신호에 의해 붙잡힌 독립적인 녹음 장치, 즉 추가 실험 시스템에 대 한 이러한 여러 디바이스를 동기화 하는 정확 하 게 하는 데 필요한는 동시 뇌-몸 신호 기록입니다. 이 시스템은이 문제를 극복 하기 위해 개발 되었다. 이 시스템에서 ECGs, EMGs, 및 호흡 리듬을 반영 하는 후 각 전구에서 전기 신호를 포함 하 여 주변 장기에서 기록 된 모든 전기적 신호는 단일 마이크로 드라이브 배열1,2에 통합 ,3, 여기는 통합 마이크로 드라이브 배열 되 나. 이 시스템 필요로 한 멀티 채널 녹음 장치, 그리고 모든 기존의 마이크로 드라이브 배열에 적용 됩니다. 이 기법의 장점은 어떤 특별 한 장치 또는 여러 장치, 기록 시간과 일치 하도록 트리거 신호 필요 하지 않습니다 및 모든 신호에의 유사한 데이터 형식으로 기록 됩니다 때문에 더 편리한 데이터 처리에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 중앙과 주변 기관 사이 협회의 신경 생리학 상호의 이해를 도움이 됩니다. 이 종이 기술과 관련 된 절차를 설명 하 고 쥐에서 얻은 대표적인 데이터 집합을 선물 한다.
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Protocol
동물 주제와 관련 된 절차의 모든 관심과 동물의 사용에 대 한 NIH 지침에 따라 수행 했다.
1. 통합 마이크로 드라이브 배열 준비
- 1,,23다른 설명으로 대뇌 피 질의 LFP 녹음에 대 한 마이크로 드라이브 어레이 만듭니다. 두고 적어도 6 금속 구멍 1.2에 설명 된 대로 bioflex 와이어에 연결 된 ECG/EMG/BR 채널로 사용 전극 인터페이스 보드 (EIB)에 엽니다.
- Bioflex 와이어 길이 5.0 cm. 껍질 소계 (PTFE)에서 6 조각으로 잘라 길이 ~5.0 m m.와 함께 모든 철사 조각의 양쪽의 코팅에 오픈 금속 구멍 (ECG/EMG/BR 채널) 중 하나를 와이어 조각의 각각의 한쪽 끝을 연결 합니다 EIB 골드 핀입니다.
- 두 5.0 cm 조각으로에 나 멜 와이어 컷. EIB (그림 3참조 또한 이전 논문12,13)에 접지/참조 (g/r) 채널에이 철사의 각각의 한쪽 끝을 땜 납.
- ECG 전극의 준비에 대 한 bioflex 와이어 두 16 cm 조각으로 잘라. ~5.0 mm 한쪽 끝 (짧은 말)와 다른 끝 (긴 끝)에 ~ 15 mm의 길이이 철사 조각의 끝의 PTFE 코팅을 벗기다.
- 철사의 긴 끝을 굽 힘 반지의 모양 납땜 하 여 고정을 2.0 m m의 직경을 가진 와이어 고리를 형성 합니다.
- EMG 전극의 준비에 대 한 bioflex 와이어 길이 8 cm. 껍질 길이 ~5.0 m m의이 철사 조각의 양쪽에서 PTFE 코팅에서 2 조각으로 잘라.
- . 솔더 한쪽 끝이 조각의 와이어 머리에 스테인리스 나사 (줄기 직경의 각각의 BR 전극의 준비 컷 길이 6.0 cm. 껍질 길이 ~5.0의이 철사 조각의 양쪽 끝의에 나 멜 코팅에서 2 조각으로 bioflex 와이어에 대 한 미터: 1.0 m m, 길이 줄기: 4.0 m m).
- 접지/참조 (gr) 전극의 준비에 대 한 컷 길이 6.0 cm. 껍질 길이 ~5.0 m m.이 와이어의 양쪽 끝의에 나 멜 코팅에서 2 조각으로에 나 멜 와이어 솔더 조각의이 와이어 머리 스테인리스 st의 각의 한쪽 장 어 스크류 (줄기 직경: 1.4 m m, 줄기 길이: 3.0 m m).
- 가스는 모든 전극 및 스테인리스 나사 소독 하 고 깨끗 한 공간에서 계속.
2. 심전도/근 전도 전극의 주입
참고: 멸 균된 장갑과 압력가 악기를 사용 하 여 무 균 기법으로 모든 수술 단계를 수행 합니다. 절 개의 창조를 포함 하는 모든 단계를 하기 전에, 70% 에탄올으로 피부를 소독 하 고 외과 커튼으로 절 개를 커버.
- 마 취 수정 평면 열 패드에 그것의 뒤에 (1.0-3.0 %isoflurane 가스) 쥐. 진통제로 buprenorphine를 제공 합니다. 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 수의 연 고를 배치 합니다. Betadine를 사용 하 여 피부 표면을 청소.
- 중간 가슴 영역에서 ~2.0 cm의 절 개를 확인 합니다. 가슴 근육을 분리 하 여 있는 근육을 노출 합니다. 있는 근육에 ECG 전극의 고리 봉합
- 열 패드에 동물의 위를 수정 합니다. 등 쪽 목 부분에 ~1.0 cm의 절 개를 확인 합니다.
- 가슴 절 개를 통해 피하 ECG 전극 삽입 합니다. 등 쪽 목 지역에 끝을 밀어 하 고 목 절 개에서 그들을 밖으로 당겨. 가슴 절 개 봉합
- 각 목 절 개를 통해 ~2.0 cm의 길이를 피하 EMG 전극의 한쪽 끝을 삽입 합니다. 봉합 하 여 목 근육 EMG 전극을 해결.
3. 통합 마이크로 드라이브 배열 및 BR 전극의 주입
- Stereotaxic 장치에 쥐를 수정 합니다. 목 부분에 눈 사이 중간에 따라 머리에 ~3.0 cm의 절 개를 확인 합니다. 두개골을 노출 합니다.
- 에 게 0.7-1.0 嗅 앞쪽 11.0 m m와 1 m m 위에 m m의 직경을 가진 두 개의 원형 craniotomies 양자 bregma 고속 드릴. 나사 줄기의 끝은 뇌 표면에 연결 될 때까지 두 BR 전극을 두개골에서 이식.
- 양자 bregma에 0.7-1.0 담당 앞쪽 2.7 m m, 2.7 m m 위에 m m의 직경을 가진 두 개의 원형 craniotomies을 확인 합니다. 나사 줄기의 끝은 뇌 표면에 연결 될 때까지 두 g/r 전극을 두개골에서 이식.
- 큰 craniotomy 주변 지역에서 6 ~ 8 직경 1.0 m m의 구멍을 확인 합니다. 앵커 나사를 이식 (줄기 직경: 1.4 m m, 줄기 길이: 3.0 m m) 두개골에.
- ~2.0 m m m, 3.8 m 후부와 해 마의 위 2.5 m m의 직경을 가진 큰 원형 craniotomy 양자 bregma에 확인 합니다. 같은 드라이브 배열의 정 팁 큰 craniotomy 위에 있는 통합 마이크로 드라이브 배열 배치
- ~ 100 µ L의 두 가지 솔루션, 즉정 팁과 뇌 표면 사이 간격 공간 채우십시오., (질량) 0.5% 나트륨 alginate와 염화 칼슘 (질량) 10%.
참고:이 프로세스 형성 투명 젤 ~ 5 분, 두 가지 솔루션은 두개골에 혼합 후. - 커버 정, BR 전극, g/r 전극, 그리고 두께 0.5 cm. 치과 시멘트 앵커 나사 조심 하지 이 단계에서 시멘트와 BR과 g/r 전극의 열린 끝을 커버.
- 이전에 EIB에 연결 된 개별 와이어 팁 g/r, BR, EMG, ECG 전극의 열린 끝 솔더 (1.2와 1.3 단계 참조).
- 통합 마이크로 드라이브 배열 및 모든 전극 와이어, 치과 시멘트의 하단 부분을 커버. 모든 전극 와이어는 완전히 덮여 쥐 주입 후에 그들을 밖으로 긁어 수 있도록 확인 하십시오.
- Sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 후 동물의 투명 한 유리 야 홈 cag를 반환 하 고 물과 음식에 무료 자체 유지 합니다. 수술 후, 항생제 (gentamicin)로 동물을 취급 합니다.
- 수술 후, 매일 관찰 동물을 모니터링 합니다. 그들은 제대로, 산책 하 고는 그들은 할 하지 찍 찍 거리는 실험 마이크로 드라이브 배열에 닿을 때 확인 하십시오.
4. Vivo에서 녹음
참고: 모든 신호는 증폭, 2 kHz로 샘플링 및 대역 통과 필터링된 (0.1-500 Hz) 단위 활동 (30 kHz로 샘플링 및 대역 통과 필터링된 (500-6 kHz))을 제외 하 고.
- 녹음 장치 headstage에 통합 마이크로 드라이브 배열의 EIB를 연결 합니다.
- 수술 후 몇 주 동안 나사 여는 tetrodes 사전. 일단은 tetrodes 대상 뇌 영역에 인접 한, 안정적인 레코딩 위한 몇 일의 기간 동안 지역으로는 tetrodes를 정착.
- 동물 녹음 실에서 자유롭게 이동 하는 동안 전기 신호를 모니터링 합니다.
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Representative Results
이 방법은 동시에 뇌, 심장 박동, 호흡 리듬, 그리고 골격 근육 수축 (그림 1)의 신경 활동을 대표 하는 여러 기관에서 생체 전기 신호를 캡처할 수 있습니다. 그림 4 는 직사각형 상자 (25 × 40 cm2)에서 자유롭게 구하고 자유롭게 움직이는 쥐에서 대표적인 기록 데이터를 제공 합니다. 예제 데이터 집합 전형적인 행동 전환 이동 하 고 상태를 휴식을 포함 합니다. 파워 스펙트럼 hippocampal LFP 추적에서 웨이 블 릿 분석에 의해 계산 되었다. 嗅의 표면 영역에서 기록 된 BR 신호는 대략 주파수, 탐구 스니핑 동작 중에 발생 하는 호흡에 상대적인 변화를 추정 하 사용 되었다.
그림 1 : 여러 뇌-신체 모니터링을 위한 녹화 시스템의 그림을 자유롭게 움직이는 쥐에서 신호. 모든 생체 전기 신호 (LFP, ECG, EEG, BR 신호) 자유롭게 움직이는 쥐에서 머리에 탑재 하 여 통합 마이크로 드라이브 배열에 수집 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 통합적인 마이크로 드라이브 배열. 화살표에 표시 된 대로 모든 LFP, ECG, EEG, 및 BR 신호는 EIB에 구멍에 전송 됩니다. 점선된 영역 오른쪽 패널에서 확대 되 고 뇌 조직에 삽입 된 마이크로 드라이브 배열에서 튀어나와 tetrodes의 일부를 표시 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 :는 EIB의 상위 뷰. EIB 24 대뇌 피 질의 LFP (LFP)는 tetrodes에 연결 된, ECG 채널 2, 2 EMG 채널, 2 BR 채널 채널과 2 그라운드 (Gr) 채널을 포함 합니다. LFP 채널에 연결 했다를 제외 하 고 모든 채널 절연 전선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Bioelectrical 신호의 동시 다중 채널 기록의 예.
(위에서 아래로) LFP 신호 somatosensory 피 질 (눈금 막대: 250 µ V). LFP hippocampal CA1 영역의 신호 (눈금 막대: 500 µ V). Hippocampal LFP 추적의 색된 파워 스펙트럼. ECG 신호 (대역 통과 필터링 20-200 Hz에서 눈금 막대: 500 µ V). EMG 신호 (대역 통과 필터링 100-500 Hz에서 눈금 막대: 100 µ V). BR 신호 (눈금 막대: 500 µ V). BR 신호의 색된 파워 스펙트럼 호흡 속도에 일시적인 증가 의해 정의 된 동작을 스니핑 나타내는입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
어떻게 두뇌 변조 주변 활동 수준, 그리고 이해에 대 한 반대, 대규모 동시에 여러 신체 영역에서 전기 biosignals 캡처 방법 녹음은 필요 합니다. 수술, 및 대뇌 로컬 필드 전위, 심 박수, 근육 건축 및 사용 되는 레코딩 시스템에 향상 된 호흡 속도의 진도 모니터링을 위한 녹화 시스템을 설명 하는이 연구 뇌 조직에서 세포 외 기록입니다. 이 시스템 통합 마이크로 드라이브 배열에 단일 EIB에 두뇌와 주변 기관에서 전기 신호를 수집합니다. 통합 마이크로 드라이브 배열 준비로 시간이 좀 걸립니다, 수술 전에 적어도 몇 시간 시작 한다. 여기에, 하지만 드라이브 배열 포함 뇌 로컬 필드 전위를 기록 하기 위한 tetrodes 금속 전극, 백 금, 텅스텐 전극, 등의 다른 종류는 EIB에 연결할 수 있습니다이 전극의 끝은 제대로 납땜 하는 경우. 수술 절차는 프로토콜에 따라 때 경험된 경험 2-3 h 내 모든 절차를 완료 하려면 수 있다 수 있습니다.
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계가입니다 특히 심전도 및 EMG 전극에 대 한 조직에 전극의 위치. 여러 훈련 반복 안정적인 녹음을 얻을 해야 할 수도 있습니다. 날짜 하려면, 모든 녹음 되어 안정적인 수술 후 적어도 1 개월. 경험, 기록 된 데이터의 신호 대 잡음 비율 낮은 경우,이 문제는 자주 접지/참조 전극의 느슨한 fixations 또는 부족 한 나의 다른 끝에는 Eib 사이 전선의 끝의 납땜을 주의 해야 한다 전선. 일부 독립 장치를 사용 하 여 기존의 electrophysiological 녹음에 비해,이 방법의 장점은 (1) 그것은 기술적으로 간단 하 게 실시 하 고, 여러 번 훈련 하는 경우, (2) 그것은 동기화 하는 통신 시스템을 요구 하지 않습니다. 여러 장치 (3) it 감소 전반적인 실험 비용 하나만 기록 장치가 필요 하며, (4) 모든 기록 데이터 파일 같은 처리 방법 및 데이터 분석의 효율성을 증가 하는 프로그램에 의해 처리 될 수 있습니다. 또한, 방법론 개념 여러 뇌 영역 및 주변 장기, 호흡기, 순환기, 및 자율 신 경계를 포함 하 여 많은 조합에 적용 됩니다. 또한 어떤 상용 전기 녹음 장치에 적용 됩니다. 조직의 생리 활동 패턴의 모니터링 동시이 메서드를 사용 하 여 도움이 될 것입니다 elucidating 정서적 문제, 외부 감각 변조에 대 한 다양 한 생리 적 상태에서 신경 활동 패턴에 고 병 적인 질병, 뇌-몸 협회 기본 생물 학적 메커니즘의 증가 이해를 선도.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Kaken 안녕에 의해 지원 되었다 (17 H 05939; 17 H 05551), Nakatomi 재단, 그리고 Suzuken 기념 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel | Cooner Wire Company, Chatsworth, CA | AS 633 | Bioflex wire |
| EIB-36-PTB | Neuralynx, Inc., Bozeman, MT | EIB-36-PTB | EIB |
| Cereplex M | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Digital headstage | |
| Cereplex Direct | Blackrock Microsystems, Salt Lake City, UT | Data acquisition system | |
| UEW polyurethane magnet wire | Oyaide.com, Tokyo, Japan | UEW 0.14mm 20m | Enamel wire |
| SD-102 | Narishige, Tokyo, Japan | SD-102 | High-speed drill |
| Minimo ONE SERIES ver.2 | Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan | C2012 | High-peed drill Power Supply |
| Provinice 250 mL | Shofu Inc., Kyoto, Japan | 213620136 | Dental cement |
| Small Animal Anesthetizer | Biomachinery, Chiba, Japan | TK-7 | Anesthetizer |
| Buprenorphine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B7536-1ML | Analgesic |
| Isoflurane | DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan | Isoflu 250mL | |
| Vaseline, White | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 224-00165 | Vet ointment |
| Sodium alginate | Nacalai tesque, Kyoto, Japan | 31131-85 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan | 031-00435 | |
| Stainless steel screw M1.0×4.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617504 | Stainless steel screw for BR electrodes |
| Stainless steel screw M1.4×3.0 | MonotaRO, Hyogo, Japan | 42617687 | Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors |
References
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