Summary
Эта статья имеет метод для тестирования monosynaptic связей между нейронами, используя Тетродотоксин и устойчивостью Тетродотоксин натриевых каналов, NaChBac.
Abstract
Здесь новый метод называется Tetrotoxin (TTX) инженерии сопротивления для зондирования синапсов (TERPS) применяется для проверки на monosynaptic связей между нейронами целевой. Метод основан на совместное выражение трансгенных активатор с каналом Тетродотоксин стойкие натрия, NaChBac, в конкретных Пресинаптический нейрон. Соединения с предполагаемым пост синаптических партнерами определяются поклеточного записи присутствии TTX, который блокирует электрической активности нейронов, которые не выражают NaChBac. Этот подход может быть изменен для работы с любой активатор или кальция изображений как репортер соединений. TERPS добавляет растущий набор инструментов для определения подключения в сети. Однако TERPS является уникальным в том, что он также достоверно сообщает, сыпучих или объем передачи и распространения передачи.
Introduction
Одной из основных целей нейронауки является сопоставление связей между нейронами, чтобы понять, как информация течет через схемы. Многочисленные подходы и ресурсы стали доступны для тестирования для функциональной связи между нейронами в диапазоне моделей систем1,2. Для генерации наиболее точных электросхемы с помощью электрофизиологии, важно решить, являются ли наблюдаемые соединения между двумя ячейками прямой и monosynaptic против косвенной и полисинаптические. Золотой стандарт для изготовления это различие в млекопитающих нейронов является измерить задержку между одной action potentials в пресинаптическом клеток и начала возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs) в второй нейрон. Monosynaptic соединения должны иметь короткие задержки несколько миллисекунд и низкой изменчивости3. Этот подход может быть сложным в беспозвоночных нейронов, потому что синапсы могут возникнуть в их дендритов далеко от соматических записи сайта, вызывая задержки в обнаружения благодаря давно electrotonic расстояния между постсинаптических проводимости и запись электрод. Такие задержки могут внести неясность в отношении поли-против monosynaptic взносов. Кроме того небольшие синаптических события могут распадаться до достижения соматических записи сайта и вождения сильнее Пресинаптический деятельности, вероятно, привлечь полисинаптические события.
Различные методы были разработаны для проверки для monosynaptic соединений в беспозвоночных. Один подход использует высокий двухвалентной катион растворы (Hi-ди), содержащие избыток мг++ и Ca++. Это решение блокирует полисинаптические соединения путем уменьшения вероятности выпуска и увеличение порога потенциал действия в пользу обнаружения monosynaptic ввода4,5. Определение точного соотношения мг++ ЦС++ требуется, однако, не является тривиальным и полисинаптические взносов может сохраняться даже скромные стимуляции6. Альтернативный подход, называемый GFP восстановление через Synaptic партнеров (ГРАСП) принимает преимущество близости между предварительной и постсинаптической мембраны, найдены на синапсы вывести monosynaptic подключения 7. Здесь компонент зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) выражается в один нейрон, и дополнительный фрагмент молекулы выражается в предполагаемый постсинаптических партнера. Наличие флуоресценции указывает, что две нейроны находятся в достаточно тесной близости разрешить восстановление GFP молекулы и подразумевает существование синапса. ХВАТКА может сообщить синапсы ложно, хотя, если две клетки тесно соединенный мембраны, как нерв или брошюре. Варианты ГРАСП ликвидации таких ложных срабатываний, привязывая Пресинаптический фрагмент GFP непосредственно к Синаптобревин, таким образом позволяя восстановление только на активных синапсы8. В то время как ХВАТКА и его варианты играют важную роль в определении функциональной связи у дрозофилы ЦНС, некоторые соединения могут не быть сделаны видимыми ГРАСП если расстояния между предварительной и постсинаптических партнеров относительно большой. Это особенно актуально в оценке объема передачи, связанные с neuromodulation9 или ингибирования ГАМК10.
Здесь взаимодополняющими и Роман метод показан для тестирования прямой monosynaptic соединений в дрозофилы ЦНС. Этот метод, называемый Тетродотоксин инженерии сопротивления для зондирования синапсов (TERPS), работает совместно выражением Тетродотоксин (TTX)-устойчивые натриевых каналов, NaChBac и активатор optogenetic в пресинаптической клетке во время записи от предполагаемого 9постсинаптических партнеров. Присутствии TTX вся деятельность, потенциал действия опосредованной подавляется в клетках отличных выражения NaChBac. NaChBac канал выборочно восстанавливает возбудимости в пресинаптическом целевой ячейки, разрешительные свет вызвала синаптической передачи. Этот метод позволяет сильный активации нейронов пресинаптическом, таким образом, что подключения могут быть решены что соматические записи при одновременном снижении вероятности вербовки полисинаптические цепей. Важно отметить, что эта техника позволяет исследование объема передачи и раскрывает распространения передатчика, освобождены от одного нейрона всей цепи. Кроме того TERPS может выявить химической природы связи через обычные фармакологии. TERPS подходит для использования в любой системе модель, которая позволяет трансгенных выражение TTX-нечувствительным натриевых каналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовьте мух и идентифицировать GAL4 промоутер линии
- Выберите строку промоутер GAL4 и крест с мухами, перевозящих трансген бла-NaChBac и optogenetic трансген для активации.
Примечание: Уан-CsChrimson11 выбирается из-за его высокой проводимости и легкость, с которой он активирует NaChBac опосредованной потенциалы действия. Из репозитория запасов Блумингтон бла-NaChBac и бла-CsChrimson. - Подготовить все транс-ретиналь как Стоковый раствор в этаноле (35 мм) и хранить решение в морозильной камере при температуре-20 ° C.
- Mix 28 мкл этот запас около 5 мл Регидратированные картофеля древесно-еда и добавьте эту смесь к верхней части флакона обычных средних дрозофилы .
- Поднимите взрослых мух, выражая csChrimson на продукты питания, содержащие 0,2 мм все транс ретиналь для 1-3 дня11.
2. подготовить TTX фондовой
- Создание запасов решения 1 мм TTX в дистиллированной или деионизированной водой. Храните это решение в холодильнике лаборатории в течение нескольких месяцев. Проверка учреждений политики в отношении хранения TTX, как многие учреждения классифицируют TTX как опасные или контролируемые вещества.
3. подготовить мух для электрофизиологии
- Соберите 1-3 день, когда старый взрослых мух, выращиваются на питание с полностью транс ретиналь.
Примечание: Обратитесь к Мурти и Тернер в 2013 году для подробного описания патч зажима дрозофилы нейронов12,13. - Положите мух в пузырек сцинтилляционные стекла. Поместите ампулу на льду за 1 мин для иммобилизации мух.
- Использование грубой щипцы для вставки муха в камеру на заказ записи. Камера состоит из 3 ½" круг лазерной резки от 1/16" акрил. Вырезать отверстие ¾" находится в центре, где фольги прилагается с 2-х частей эпоксидной. Фольга содержит треугольной формы надежду, что лету вставляется в.
- Применение воска или УФ излечимых эпоксидная вокруг животного, чтобы закрепить его в пределах записи камеры.
- Освещать подготовку с гусиная шея оптического волокна для визуализации под стереомикроскопом. Установите гусиная шея волокон для наклонного освещения, регулируя их таким образом, чтобы они освещают лету прямо со стороны.
- Отрегулируйте уровень света низкие возможной настройку, которая по-прежнему позволяет четкие визуализации летать. Эта интенсивность света будут различаться в разных индивидуальных экспериментов.
Примечание: Этот протокол может быть адаптирована с помощью в situ мозга explant метод14. - Получить внешние записи физиологического раствора. Солевой раствор содержит в мм: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-трис (гидроксиметил) метил-2-аминоэтан сульфонольно кислоты, 8 Трегалоза, 10 глюкозы, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2и 4 MgCl2 (с учетом mΩ 270-275). Солевой раствор пропускается с 95% O2/5% CO2 (Карбоген) и скорректировала рН 7.315.
- Место 4-6 капель внеклеточного записи физраствора над fly подготовки. На данный момент Увеличьте уровень освещенности на вскрытие микроскоп для лучшей видимости.
- Точить Вольфрамные проволоки с помощью электролиза. Чтобы сделать провод, подготовить насыщенного раствора KNO3 и применять примерно 20 V переменного тока во время погружения кончик проволоки в раствор 20 раз для 100 мс до тех пор, пока кончик заостренные. Используйте заточенные Вольфрамовая проволока для удаления кутикул на лету и таким образом подвергая мозга.
- Далее подвергайте мозга путем удаления трахеи и жир тела, которые его окружают. Если доступ усиков лопастями, используйте изогнутых Вольфрамные проволоки или аналогичный инструмент аккуратно уложить антенн под фольгой, запись камеры для повышения наглядности. Используйте острые щипцы аккуратно оторвать глиальных обшивка, охватывающих области интересов, где будет производиться запись.
- Запись камеры передавать электрофизиологии Рог. Сразу же начала перфузии с внешней записи солевых кипела с Карбоген для сохранения мозга. Солевой раствор водохранилище находится выше микроскопа и тяжести подается в подготовке. Используйте вакуумные линии и колбу Эрленмейера 2 Л для сбора отходов физиологического раствора.
4. получить поклеточного запись
- Вытяните патч пипетки на коммерческих пипеткой съемник. Обратитесь к инструкции для настройки для достижения соответствующей пипетки с кончика сопротивление около 7 mΩ.
- Мкл 4 внутренних запись решения в патч пипетки. Внутреннего физиологического раствора состоит из 140 калия аспартата, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 НС3ГТФ, 1 EGTA и 1 KCl в мм.
- Установите патч зажим усилителя для записи всего клеток. Нулевое смещение усилителя и установите усилитель для доставки испытательных импульсов. Здесь используется AM систем патч зажим усилителя 2400.
- Применить положительным давлением через пипетку и подходить к ячейке. Используйте микроманипулятор для прямого пипетки и связаться ячейки. Выпуск под положительным давлением. Набор холдинга потенциал мембраны к -60 МВ. Дозатор должны образовывать gigaohm печать с клеточной мембраны, о чем свидетельствует низкий суб picoamp проведения текущей.
Примечание: При использовании GFP ориентации клетки, стараются свести к минимуму использование света epifluorescent для предотвращения ChR2 активации и потенциальных синаптических депрессии. Также, подождите несколько минут перед применением шаг 5. - Установите усилитель для доставки испытательных импульсов от -50 МВ -60 МВ. Этот параметр является стандартным патч зажим усилители. Испытательных импульсов покажет большой емкостной преходящее, представляющие текущие необходимые для зарядки патч пипеткой. Удаление емкостной транзиентов, регулируя мощность компенсации ручки на AM 2400 или аналогичных усилитель.
- Примените краткий импульсы отрицательное давление разрыва мембраны клетки и получить поклеточного конфигурации.
Примечание: Конфигурация клеточных наблюдается, когда существует значительное увеличение емкостной транзиентов, показаны емкость нейрона. Небольшое увеличение в проведении текущей (базовый) скорее всего будут также соблюдаться. Установить текущий режим зажим усилителя и скорректировать потенциал клеток от -50 до -60 МВ.
5. Проверка синаптических подключения
- Настройка данных система сбора (DAQ) для запуска светодиодный драйвер для создания световых импульсов. Здесь доставить светодиодный драйвер аналогового сигнала с Matlab используется система национальных инструментов DAQ. Светодиод интенсивность настраивается через аналоговый сигнал водителю. Светодиод горит 620-630 Нм волны светодиод.
- Положение мощными красный светодиод непосредственно под подготовки. Отрегулируйте интенсивность света, так что 0,238 МВт/мм2 достигает лету.
- Активируйте Пресинаптический нейронов во время записи от постсинаптической клетке интерес. Достижения optogenetically активации клеток, pharmacogentically, или через стимулирование нерва. Здесь csChrimson и краткий импульсов красного света применяются.
Примечание: Синаптических связей может контролироваться в текущем зажим как EPSPs или напряжение зажим как EPSCs. Синаптической связи должен быть виден до применения TTX в ответ на 40 мс светового импульса. Если наблюдается никакой связи, маловероятно, что нейроны синаптически связаны либо моно - или polysynaptically. Холдинг потенциал может быть скорректирована соответственно подчеркнуть возбуждающим или тормозящее соединения. - Если подключение наблюдается в нормальное saline, добавить TTX перфузии системы для достижения конечной концентрации 1 µM. Используйте рециркуляционный насос для сбора и повторного использования физиологического раствора для сохранения TTX. Перистальтический насос подготовит физиологический раствор из ванны и вернуть его к физиологическим водохранилище.
- Отрегулируйте скорость насоса для обеспечения сильной постоянный вакуум, который не позволяет что физиологический уровень в ванне для взлета и падения.
Примечание: Применение TTX должно привести к прекращению пики активности в нейронах, который отслеживается в целом клеток. Это подтверждает, что достаточно TTX был добавлен к Салине. - Снова применить краткий импульсов красного света (40 мс для каждого импульса). На данный момент, скорее всего синаптической связи, что остается monosynaptic. Добавьте фармакологические антагонисты рециркуляционный физиологического раствора для тестирования химической природы синаптических связей, которые остаются в TTX.
Примечание: При объединении Оптогенетика и флуоресцентные ориентации нейронов, это может быть важно, чтобы не активировать упорно Пресинаптический населения нейронов при попытке получить запись. Это может привести к синаптических депрессии и делает ее трудно увидеть соединения. Поскольку csChrimson имеет длинный возбуждения полоса, которая широко распространяется в диапазон зеленого флуоресцентного белка, красный Флюорофор может использоваться для визуализации нейронов и channel2rhodopsin (Ch2R) может использоваться для возбуждения клеточных популяций. Это требует конкретных генетики и настраиваемого фильтра куб. Для создания подходящих мух, сделайте мух, которые выражают красный Флюорофор (ППП или mCherry) под системы двоичные выражения Лекса или Q. Это нужно будет скрещивали с мух, выражая Gal4 промоутер и бла-Ch2R и бла-NaChBac эффектор генов. Фильтр оптимального куб для эпифлуоресцентного будет иметь ряд узких возбуждения возбуждают красный Флюорофор, но не волновать Ch2R. Кроме того, набор фильтров должна включать фильтр выбросов длинный пас, собирать столько испускаемого света. Мы использовали настраиваемый фильтр от насыщенности цвета, которая включена часть номера et580/25 x и t600lpxr (из 49306 набора), но с фильтром барьер/выбросов et610lp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TERPS используется для различения между моно - и полисинаптические взносов в синаптических связей между нейронами. Хотя слабые стимуляции ячейки могут быть использованы для проверки прямых соединений, вождение более Пресинаптический деятельности часто новобранцев полисинаптические соединения (рис. 1A). TERPS работает путем совместного выражения TTX-нечувствительным натриевых каналов NaChBac и активатор optogenetic и тестирование соединения присутствии TTX для ликвидации полисинаптические соединения (рис. 1B). TTX эффективно блокирует потенциалы действия в дрозофилы мозга, что делает его подходящим подготовки для TERPS (рисунок 2A). Трансгенные выражение натриевых каналов NaChBac спасает возбудимости нейронов и результаты в больших плато потенциал (рис. 2B).
Местные интернейронов (LN) в усиков доле Показать надежные ответы на обонятельной стимуляции (рис. 3A). Однако потому что не отдельные EPSPs легко разрешаются на сома LN, остается неясным, если такие реакции возникают непосредственно из входной нейрон обонятельного рецептора (ORN) или косвенно ввод через проекции нейронов (PN) (рисунок 3B). С помощью TERPS, ORNs, показанный здесь, действительно сделать прямой синаптических связей с LNs (рис. 3 c).
Уникальной особенностью TERPS является его способность конкретно решить экстра синаптических объем передачи, что может произойти с ГАМК или neuromodulators таких как серотонина. Стимуляция серотонинергической нейрона (CSDn) в доле усиков дрозофилы приводит к смеси возбуждения и торможения в местных межнейронного (рис. 4A и 4B рисунок). Возбуждение размышлял по возбуждающим передатчик ацетилхолина и ингибирование вызвана серотонина (Рисунок 4 c и 4 d на рисунке). TERPS может использоваться для определения, если соединения monosynaptic, устраняя полисинаптические соединения (Рисунок 4E). В TTX по-прежнему наблюдается сильное торможение LN, предполагая, что он прибыл из непосредственно от активации конкретного серотонинергической нейрона (4F рисунок и Рисунок 4 g). Эта связь блокируется methysergide антагонист серотонина. Возбуждающим синапса, посредничестве ацетилхолина был ликвидирован в TTX, предполагая, что оно возникло от полисинаптические источников.
Рисунок 1 : TERPS устраняет полисинаптические соединения и изолирует monosynaptic входов. (A). Схематическая диаграмма, показывающая, что увеличение Пресинаптический активности можно набирать полисинаптические соединения. (B). Диаграмма, иллюстрирующая как TERPS можно удалить полисинаптические взносов с помощью TTX, чтобы устранить пики активности нейронов. Возбудимость исключительно восстанавливается в одной популяции нейронов, которые затем могут быть рады optogenetically. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : NaChBac восстанавливает возбудимости нейронов в Дрозофилы нейроны. (A) приложения 1 мкм, TTX отменяет пики в дрозофилы нейронов. Спонтанная активность и запах вызывало ингибирование устраняются в TTX. (B) NaChBac и csChrimson выражаются в CSDn и мозг подвергается TTX. csChrimson стимуляция depolarizes CSDn и после порогового, есть большой нелинейной увеличение напряжения CSDn мембраны. Этот быстрой деполяризации представляет собой плато как потенциал (Отступ). Каждый цвет через моделирование интенсивности соответствует тот же цвет в врезные напряжения. Эта цифра была изменена с Чжан и 2016 Годри9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : TERPS показывает monosynaptic соединения между ORNs и LNs. (A) A образец записи показаны запах ответ в LN. Эта реакция может быть моно - или полисинаптические в природе. (B) TERPS может испытываться на Орн в LN синапса. TTX используется для блокировки потенциалы действия и возбудимости во всех клетках в подготовке. Возбудимость исключительно восстанавливается в ORNs через NaChBac натриевых каналов. ORNs может затем быть взволнованным с channelrhodopsin вызывают синаптических выпуска. Синаптических события измеряются post-synaptically помощью поклеточного записей. (C) TERPS показывает, что Орн в синапсе пер monosynaptic. TERPS могут также сочетаться с фармакологии, чтобы показать, что синапсе холинэргические и заблокированных, антагонист mecamylamine никотиновых рецепторов (200 мкм). Вертикальная серая полоса указывает время Орн стимуляции. Этот показатель был изменен с Чжан и Годри в 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : TERPS чувствителен к навалом или объем выпуска передачи от модулирующее нейронов. (A) стимуляции CSDn результаты в потенциал действия из записанных LN в доле дрозофилы усиков. LN (B) является hyperpolarized так что CSDn стимуляции приводит в действие подпороговых. LN ответ состоит из быстрой деполяризации, следуют медленнее гиперполяризации. Серая полоса обозначает время CSDn стимуляции. Methysergide (50 мкм), антагонистом широкого 5-HT рецепторов, блокирует медленные гиперполяризации, но не влияет на скорость деполяризации. Mecamylamine блокирует быстрой деполяризации, предполагая, что это холинергических в природе. (C) TERPS может использоваться для решения, какие химические компоненты CSDn для LN СИНАПС являются моно-против полисинаптические. (D) CSDn стимулируется присутствии TTX и постсинаптических LN ответы измеряются в целом ячейки записи. Гиперполяризации упорно TTX, предполагая, что это monosynaptic в природе. Этот гиперполяризации заблокирован methysergide, в соответствии с серотонинергической передачи. Краткий деполяризации, который остается в TTX вероятно опосредовано электрические разрыв, муфты, как он не блокируется никотиновой антагонистов. Этот показатель был изменен с Чжан и Годри в 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный файл 1: фольга дрозофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Палата физиологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TERPS анализ дополняет текущие методы, используемые для цепи, растрескивание, позволяя обнаружения синапсов между выявленными нейронов. В частности подход показывает monosynaptic соединения широко глушителей потенциалы действия с TTX при восстановлении возбудимости в совокупность нейронов с TTX-нечувствительным натриевых каналов NaChBac. Синаптических выпуска вызвало optogenetic стимуляция хотя постсинаптических события контролируются с поклеточного записей. TERPS отличает себя от других подходов, таких как ГРАСП, будучи чувствительным для массового или объем передачи вызвал на большие расстояния и способности выполнять манипуляции фармакологическом. Техника является относительно простым, нанимать и требует только одну запись электрода и источником света для стимуляции optogenetic, который является более реальным, чем получение двойной поклеточного записи на пред- и пост синаптических частей синапсе. Основное требование TERPS является, что потенциалы действия легко блокируются TTX в изучаемой системе. Но, потому что TTX действует на нейроны в широком спектре таксономических типы, вполне вероятно, что TERPS может применяться широко для обеих систем модель млекопитающих и беспозвоночных.
TERPS могут быть легко изменены в ряде манеры, чтобы облегчить либо стимуляции предполагаемого Пресинаптический населения или для записи от постсинаптических целей. Здесь optogenetic инструмент был использован для стимулирования целевых групп населения, хотя возможна активация различных механизмов. Нерва стимуляции чувств аксонов, например, обычной в исследованиях передачи от усиков нерва в дрозофилы16 и подходит в другие сенсорные системы, включая периферических нервов, содержащие mechanosensory нейронов. Аналогичный подход к тестированию функциональных подключения у дрозофилы выразил GCaMP кальция показателей в одной популяции нейронов во время вождения деятельности другого населения через ИОНОТРОПНЫХ purinoceptor P2X2 и АТФ приложения2. Этот подход должен быть совместим с TERPS просто совместно выразить трансген NaChBac с P2X2 рецепторами в один нейрон и GCaMP в другой населения для метода патч, полностью. Однако следует проявлять осторожность с подходами, вызывая медленнее depolarizations, таких как мускариновых основе дизайнер рецепторов, исключительно активированную дизайнер наркотиков (DREADDs)17,18. Медленная скорость деполяризации может привести к инактивации NaChBac до поколения потенциал действия.
Аналогичные методы для TERPS были заняты в mammalian системами. Такие методы сочетают TTX и channelrhodopsin составить карту вне связи между нейронами. Channelrhodopsin активации только вообще не depolarize нейронов достаточно, и таким образом калия канала блокатор 4-AP применяется с TTX, чтобы добиться освобождения19,,2021. Хотя это работает на многих синапсы, она не может работать на некоторых Метаботропные синапсы если течению цель рецептора канал 4-AP чувствительных калия. Например серотонинергической модуляции обонятельных реакции в подсемейства опирается непосредственно на модуляции такой 4-AP чувствительных К+ ток (IA)22. Этот подход также не работает на CSDn в синапсе LN (данные не показаны). Таким образом TERPS имеет преимущество меньше по сравнению с другими часто используемые методы фармакологического вмешательства и могут работать на более широкий круг или синапсы.
Существует несколько ограничений для TERPS, которые должны быть рассмотрены. Во-первых могут быть потенциальные побочные эффекты от хронической выражение NaChBac канала на протяжении развития. Надлежащей схемы сборки и функции могут быть подтверждены сравнивая активность нейронов между управления мухи не хватает NaChBac конструкцию и мух с помощью конструкции в отсутствие TTX. Чтобы избежать подобных проблем, проявление NaChBac трансген может контролироваться височно через выражение репрессор GAL4 чувствительных к температуре, GAL8023. Кроме того если синапса наблюдается только в зависимости от государства, это мыслимо, что подавление сетевой активности с TTX может скрывать такую связь. Важно подчеркнуть, что позитивные связи, наблюдается с TERPS вероятно представляет собой истинный моно синаптических подключение, в то время как отрицательный результат не является доказательством отсутствия подключения.
Хотя TERPS можно выявить способность передатчика освобождение от один нейрон влияют на постсинаптических партнер явно, динамика медленного канала NaChBac и плато потенциалов, связанных с ее активации сделать его менее применимы к изучению классической синапсах. Один из подходов к изменяя TERPS для быстрее, более естественный передатчик релиз будет выразить TTX-нечувствительным модифицированная эндогенного дрозофилы натрия канал пункт в отличие от NaChBac. Это изменение приведет к натуралистической пики активности в пресинаптической клетке и позволяют более традиционный анализ синаптической передачи в отсутствие сетевой активности. Это будет иметь большие возможности для исследования скорость кодирования синапсы, в которых выявление желательно широкий спектр Пресинаптический деятельности без набора полисинаптические сетей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Джошуа певица, Джонатан Шенк, а также продуманный рецензентам для комментариев по рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить Бен Уайт и Гарольд закон для обсуждения вопроса о технике. Джонатан Шенк представила данные на рисунке 3A. Эта работа была поддержана грантом фонда Уайтхолла и NIH R21 на QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
