Summary
Denne artikel indeholder en metode til at teste de monosynaptic forbindelser mellem neuroner ved hjælp af tetrodotoxin og tetrodotoxin-resistente natrium kanalen, NaChBac.
Abstract
Her, er en ny teknik, der kaldes Tetrotoxin (TTX) udviklet resistens over for sondering synapser (TERPS) anvendt til at teste for monosynaptic forbindelser mellem target neuroner. Metoden bygger på fælles udtryk for en transgene aktivator med tetrodotoxin-resistente natrium kanalen, NaChBac, i en bestemt præsynaptiske neuron. Forbindelser med formodede post synaptic partnere bestemmes af hele-celle optagelser i overværelse af TTX, som blokerer for elektriske aktivitet i neuroner, der ikke udtryk NaChBac. Denne tilgang kan ændres for at arbejde med alle aktivator eller calcium imaging som en reporter af forbindelser. TERPS tilføjer til den voksende sæt af værktøjer til rådighed til bestemmelse af tilslutningsmuligheder inden for netværk. TERPS er imidlertid unik, idet den rapporterer også pålideligt bulk eller mængde transmission og spillover transmission.
Introduction
Et vigtigt mål for neurovidenskab er at knytte forbindelser mellem neuroner til at forstå, hvordan information flyder gennem kredsløb. Adskillige strategier og ressourcer er blevet tilgængelig til test af funktionelle forbindelsen mellem neuroner i en række model systemer1,2. For at generere de mest præcise ledningsdiagrammer ved hjælp af Elektrofysiologi, er det vigtigt at løse om observerede forbindelser mellem to celler er direkte og monosynaptic versus indirekte og polysynaptic. En guld standard for at gøre denne skelnen i pattedyr neuroner er at måle latenstiden mellem enkelt action potentials i de præsynaptiske celler og udbrud af excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs) i den anden neuron. Monosynaptic forbindelser skal have kort ventetid for et par millisekunder og lav variabilitet3. Denne tilgang kan være kompliceret i hvirvelløse neuroner, fordi synapser kan forekomme i deres dendritter langt fra webstedet somatiske optagelse, forårsager forsinkelser i registrering på grund af lange electrotonic afstande mellem postsynaptiske conductances og optagelsen elektrode. Sådanne forsinkelser kan indføre tvetydighed med hensyn til poly-versus monosynaptic bidrag. Derudover små synaptic begivenheder kan henfalde før de når webstedet somatiske optagelser, og køre stærkere præsynaptiske aktivitet, er tilbøjelige til at ansætte polysynaptic begivenheder.
Forskellige teknikker er blevet udviklet for at teste for monosynaptic forbindelser i hvirvelløse dyr. Én fremgangsmåde bruger høje divalent kation løsninger (Hi-Di) indeholdende overskydende Mg++ og Ca++. Denne løsning blokerer polysynaptic forbindelser ved at reducere sandsynligheden for udgivelse og stigende aktionspotentialet tærsklen til at favorisere påvisning af monosynaptic input4,5. Bestemmelse af det præcise forhold mellem Mg++ til Ca++ kræves, men er ikke trivielt og polysynaptic bidrag kan vare ved selv beskedne stimulation6. En alternativ metode kaldet normal god landbrugspraksis rekonstitution på tværs af Synaptic partnere (greb) udnytter nærhed mellem præ- og postsynaptiske membraner fundet på synapser at udlede en monosynaptic forbindelse 7. Her, en del af grøn fluorescerende proteiner (NGL) udtrykkes i en neuron, og den supplerende fragment af molekylet er udtrykt i en formodede postsynaptiske partner. Tilstedeværelsen af fluorescens viser, at de to neuroner er tæt nok på til at tillade rekonstituering af normal god landbrugspraksis molekyle og antyder eksistensen af en synapse. GREB kan rapportere synapser fejlagtigt, dog, hvis to celler har tæt apposed membraner, som i en nerve eller fascicle. Varianter af greb fjerne sådanne falske positiver af tethering den præsynaptiske fragment af normal god landbrugspraksis direkte til synaptobrevin, således at rekonstitution kun på aktive synapser8. Mens greb og dens varianter har været medvirkende til bestemmelse af funktionelle connectivity i Drosophila CNS, kan nogle forbindelser ikke gøres synlig ved greb hvis afstande mellem præ- og postsynaptiske partnere er relativt stor. Dette er særligt relevant i vurderingen af volumen transmission tilknyttet Neuromodulationsbehandling9 eller GABAergic hæmning10.
Her, er en supplerende og roman teknik påvist for at teste direkte monosynaptic forbindelser i Drosophila CNS. Denne metode, kaldet Tetrodotoxin manipuleret modstand for sondering synapser (TERPS), anlæg af co udtryk af tetrodotoxin (TTX)-resistente natrium kanal, NaChBac og en optogenetic activator i en præsynaptiske celle mens optagelse fra formodede postsynaptiske partnere9. I nærværelse af TTX, er alle aktionspotentialet-medieret aktivitet undertrykt i cellerne end de giver udtryk for NaChBac. NaChBac kanalen gendanner selektivt ophidselse i den målrettede præsynaptiske celler, tillader lys-fremkaldte synaptisk transmission. Denne metode tillader stærk aktivering af de præsynaptiske neuroner, således at forbindelser kan løses postsynaptically af somatiske optagelse samtidig reducere sandsynligheden for rekruttering polysynaptic kredsløb. Vigtigst, denne teknik tillader undersøgelse af volumen transmission og afslører spredning af senderen frigivet fra en enkelt neuron i et kredsløb. Derudover kan TERPS afsløre den kemiske natur for forbindelsen gennem konventionelle farmakologi. TERPS er egnet til brug i enhver modelsystem, der tillader den transgene udtryk for TTX-ufølsom natrium kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered fluer og identificere GAL4 promotor linjer
- Vælg en GAL4 promoter linje og krydse den med fluer bærer både UAS-NaChBac transgenet og en optogenetic transgen til aktivering.
Bemærk: UAS-CsChrimson11 er valgt på grund af sin høje ledningsevne og den lethed, hvormed det aktiverer NaChBac-medieret handling potentialer. UAS-NaChBac og UAS-CsChrimson er tilgængelige fra Bloomington bestandene lagringsstedet. - Forberede all-trans retinal som en stamopløsning i ethanol (35 mM) og gemme løsningen i fryser ved-20 ° C.
- Mix 28 µL af denne bestand i ca. 5 mL rehydreret kartoffel flage mad og tilføje denne blanding til toppen af et hætteglas med konventionelle Drosophila medium.
- Hæve voksne fluer at udtrykke csChrimson på fødevarer, der indeholder 0,2 mM all-trans-retinal for 1-3 dage11.
2. klargør TTX lager
- Oprette en stamopløsning af 1 mM TTX i destilleret eller deioniseret vand. Gemme denne løsning i lab køleskab i flere måneder. Kontrollere institutioner politikker vedrørende opbevaring af TTX, som mange institutioner klassificere TTX som en farlig eller kontrolleret stof.
3. Forbered fluer for Elektrofysiologi
- Indsamle 1 – 3 dages gamle voksne fluer, der er rejst på maden med all-trans-retinal.
Bemærk: Henvise til Murthy og Turner i 2013 for en detaljeret beskrivelse af programrettelse fastspænding Drosophila neuroner12,13. - Sætte fluer i et glas scintillation hætteglas. Placere hætteglasset på isen for 1 min til at immobilisere fluer.
- Bruge grove pincet til at indsætte en flue i en skræddersyet optagelse kammer. Salen består af en 3 ½" cirkel laser skåret fra 1/16" akryl. Snit en ¾" hul er ind til centrum, hvor en brugerdefineret folie er forbundet med 2-delt epoxy. Folien indeholder en trekantet formet håb om, at fluen er indsat i.
- Anvend voks eller UV helbredes epoxy omkring dyr til at fastgøre den fast i optagelse kammeret.
- Belyse forberedelse med en svanehals optisk fiber til visualisering under et stereomikroskop. Indstille svanehals fibre til skrå belysning ved at justere dem, så at de belyse flyve direkte fra siden.
- Justere lys til lavest mulige indstilling, der tillader stadig klart visualisering af fluen. Denne lysintensitet varierer på tværs af individuelle eksperimenter.
Bemærk: Denne protokol kan tilpasses ved hjælp af en in situ hjernen explant metode14. - Hente ekstern optagelse saltvand. Saltvand indeholder i mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethane-sulfonsyre syre, 8 trehalose, 10 glukose, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2og 4 MgCl2 (justeret til 270-275 MΩ). Saltvand er boblede med 95% O2/5% CO2 (carbogen) og har en pH-værdi justeres til 7,315.
- Sted 4-6 dråber af ekstracellulære optagelse saltvand over den flyve forberedelse. På dette punkt, øge lysniveau på dissektion mikroskop for bedre synlighed.
- Skærpe en wolfram tråd ved hjælp af elektrolyse. For at gøre wiren, forberede en mættet opløsning af KNO3 og anvende ca 20 V af AC nuværende mens dyppe spidsen af wire i løsning 20 gange for 100 ms, indtil spidsen er skærpet. Bruge skærpet wolfram tråd til at fjerne neglebånd på hovedet af i farten og dermed udsætte hjernen.
- Yderligere udsætte hjernen ved at fjerne luftrøret og fedt organer, der omgiver den. Hvis adgang til de antennal fliger, bruge en bøjet wolfram wire eller lignende værktøj til forsigtigt tuck antenner nedenunder folien optagelse kammer for at øge synligheden. Brug skarpe tang til at forsigtigt rive den glial beklædningen, der dækker området af interesse hvor optagelser vil blive foretaget.
- Overfør optagelsen kammer til Elektrofysiologi riggen. Omgående start perfusion med ekstern optagelse saltvand boblede med carbogen at bevare hjernen. At saltvandsopløsning reservoir er placeret over stadiet mikroskop og er tyngdekraft-fodret til forberedelsen. Brug en vakuum linje og en 2 L Erlenmeyerkolbe for at indsamle affald saltvand.
4. opnå hele-celle optagelse
- Trække patch pipetter på en kommerciel pipette puller. Se i manualen til indstillinger for at opnå en passende pipette med en spids modstand nær 7 MΩ.
- Tilføj 4 µL af optagelse fra intern kilde løsning i en patch pipette. Den interne saline består af 140 kalium aspartat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA og 1 KCl i mM.
- Oprette patch klemme forstærker til hele-celle optagelse. Nul forstærkerens forskydning og angive forstærker til at levere testimpulser. Her bruges en AM systemer Patch klemme forstærker 2.400.
- Anvende overtryk gennem pipetten og tilgang i cellen. Bruge en micromanipulator til direkte pipetten og kontakte cellen. Frigive overtryk. Sæt bedrift potentiale af membran til -60 mV. Pipetten bør danne en gigaohm forsegling med cellemembranen som det fremgår af en lav sub-picoamp holding aktuelle.
Bemærk: Hvis du bruger normal god landbrugspraksis styret celle målretning, forsøge at minimere brugen af epifluorescerende lys til at forhindre ChR2 aktivering og potentielle synaptic depression. Også vente et par minutter før du anvender trin 5. - Indstille forstærkeren kan levere testimpulser fra -50 mV til -60 mV. Denne indstilling er standard på patch-clamp forstærkere. Testimpulser vil afsløre en stor capacitative forbigående repræsenterer den aktuelle nødvendige at oplade patch pipette. Fjerne capacitative transienter ved at justere kapaciteten kompensation drejeknapper på AM 2400 eller lignende forstærker.
- Anvende korte pulser af negativt pres at briste cellemembranen og få hele-celle konfiguration.
Bemærk: En hel celle konfiguration er observeret, når der er en stor stigning i de capacitative transienter viser kapacitans af neuron. En lille stigning i bedriften nuværende (baseline) vil sandsynligvis også overholdes. Indstille forstærkeren til nuværende klemme mode og justere cellens potentiale til -50 til -60 mV.
5. test synaptisk forbindelse
- Konfigurere dataoptegningssystem (DAQ) for at udløse en LED-driver for at generere lysimpulser. Her bruges en nationale instrumenter DAQ system med Matlab til at levere et analogt signal til en LED-driver. LED-intensitet reguleres via det analoge signal til driveren. LED er en 620-630 nm bølgelængde LED.
- Placer den high-powered røde LED direkte under forberedelse. Justere lysstyrken, således at 0.238 mW/mm2 når fluen.
- Aktivere præsynaptiske neuroner mens optagelse fra den postsynaptiske celle af interesse. Opnå celle aktivering optogenetically, pharmacogentically, eller via nervestimulation. Her, anvendes csChrimson og korte pulser af rødt lys.
Bemærk: Synaptiske forbindelser kan overvåges, enten i nuværende klemme som EPSPs eller spænding klemme som EPSCs. En synaptisk forbindelse bør være synlige før du anvender TTX som svar på en 40 ms lys puls. Hvis ingen forbindelse er observeret, er det usandsynligt at neuronerne er synaptically forbundet enten mono - eller polysynaptically. Bedriften potentielle kan justeres for at understrege excitatoriske eller hæmmende forbindelser i overensstemmelse hermed. - Hvis en forbindelse er observeret i normal saltvand, tilføje TTX perfusion systemet for at opnå en endelig koncentration på 1 Brug µM. en recirkulerende pumpe til at fange og genbruge saltvand for at bevare TTX. Den peristaltiske pumpe vil drage at saltvandsopløsning badet og returnere den til den saltholdige reservoir.
- Justere pumpehastighed for at give en stærk konstant vakuum, der ikke tillader at saltvand niveau i bad til at stige og falde.
Bemærk: Anvendelse af TTX bør resultere i ophør af spiking aktivitet i neuron, der skal overvåges i hele-celle. Dette bekræfter, at nok TTX er blevet føjet til saltvand. - Anvende korte pulser af rødt lys (40 ms for hver puls) igen. På dette punkt enhver synaptisk forbindelse, der er tilbage er sandsynligvis monosynaptic. Tilføje farmakologiske antagonister til recirkulerende saltvand til at teste den kemiske natur af de synaptiske forbindelser, der forbliver i TTX.
Bemærk: Når du kombinerer optogenetics og fluorescerende målretning af neuroner, kan det være vigtigt ikke at vedvarende aktivere den præsynaptiske befolkning af neuroner forsøget på at opnå en optagelse. Dette kan føre til synaptic depression og gør det vanskeligt at se forbindelser. Fordi csChrimson har en lang excitation band, der strækker sig bredt ind i rækken af grøn fluorescerende proteiner, en rød fluorophore kan bruges til at visualisere neuroner og channel2rhodopsin (Ch2R) kan bruges til at ophidse cellepopulationer. Denne handling kræver specifikke genetik og en brugerdefineret filter kube. For at generere egnet fluer, gøre fluer, der udtrykker den røde fluorophore (RFP eller mCherry) under de LexA eller Q-systemet binære udtryk systemer. Disse skal være krydset med fluer udtrykker en Gal4 promoter og UAS-Ch2R og UAS-NaChBac effektor gener. Optimal filter kuben for epifluorescensmikroskop vil have en smal excitation vifte at ophidse den røde fluorophore, men ikke vække Ch2R. Desuden, filtersæt bør omfatte en lang pass emission filter for at indsamle så meget udsendte lys. Vi brugte et brugerdefineret filter fra Chroma, der omfattede en del numre et580/25 x og t600lpxr (fra 49306 sæt), men med en et610lp barriere/emission filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TERPS bruges til at skelne mellem mono- og polysynaptic bidrag i synaptiske forbindelser mellem neuroner. Mens svage stimulering af en celle kan bruges til at teste direkte forbindelser, rekrutter kørsel større præsynaptiske aktivitet ofte polysynaptic forbindelser (figur 1A). TERPS virker ved co udtrykker TTX-ufølsom natrium-kanalen NaChBac og en optogenetic aktivator, og teste forbindelser i overværelse af TTX at eliminere polysynaptic forbindelser (figur 1B). TTX blokerer effektivt handling potentialer i Drosophila -hjernen, hvilket gør det en hensigtsmæssig klargøring ved TERPS (figur 2A). Transgene udtryk af NaChBac natrium kanalen redder ophidselse i neuroner og resultater i et stort plateau potentiale (figur 2B).
Lokale interneurons (LN) i den antennal lap vise robuste svar til olfaktoriske stimulation (figur 3A). Men fordi enkelte EPSPs ikke er let løst på LN soma, det forbliver uklart, om sådanne svar opstår direkte fra olfaktoriske receptor neuron input (ORN) eller indirekte input via projektion neuroner (PN) (figur 3B). Ved hjælp af TERPS, gør ORNs vist her, faktisk direkte synaptiske forbindelser med LNs (figur 3 c).
En unik egenskab af TERPS er dens evne til at specielt løse ekstra synaptic volumen transmission, der kan opstå med enten GABA eller neuromodulators som serotonin. Stimulering af en serotonerge neuron (CSDn) i Drosophila antennal lap resulterer i en blanding af excitation og hæmning i en lokal interneuron (figur 4A og figur 4B). Excitation er mediterede af excitatoriske senderen acetylcholin og hæmning er forårsaget af serotonin (figur 4 c og figur 4D). TERPS kan bruges til at afgøre, om forbindelserne er monosynaptic ved at fjerne polysynaptic forbindelser (figur 4E). I TTX ses en kraftig hæmning stadig i LN, antyder det ankommer fra direkte fra aktivering af et specifikt serotonerge neuron (figur 4F og figur 4 g). Denne forbindelse er blokeret af serotonin antagonist methysergid. Excitatoriske synapse medieret af acetylcholin blev elimineret i TTX, tyder på, den opstod fra polysynaptic kilder.
Figur 1 : TERPS eliminerer polysynaptic forbindelser og isolerer monosynaptic indgange. (A). en skematisk diagram, der viser, at øge præsynaptiske aktivitet kan rekruttere polysynaptic forbindelser. (B). et diagram illustrerer hvordan TERPS kan fjerne polysynaptic bidrag ved hjælp af TTX for at fjerne spiking aktivitet i neuroner. Ophidselse gendannes udelukkende i en population af neuroner, der kan så være glade optogenetically. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : NaChBac genskaber neuronal ophidselse i Drosophila neuroner. (A) anvendelse af 1 µm TTX afskaffer spiking i Drosophila neuroner. Både spontane aktivitet og lugt-fremkaldte hæmning er elimineret i TTX. (B) NaChBac og csChrimson er udtrykt i CSDn og hjernen er udsat for TTX. csChrimson stimulation depolarizes CSDn og efter en tærskel er overskredet, er der stor ikke-lineære steg i CSDn membran spænding. Denne hurtige depolarisering udgør et plateau-lignende potentiale (indsatser). Hver farve på tværs af simulation intensiteter svarer til den samme farve i spænding indsatser. Dette tal er blevet ændret fra Zhang og Gaudry 20169. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : TERPS afslører monosynaptic forbindelser mellem ORNs og LNs. (A) A prøve optagelse viser en lugt svar i en LN. Dette svar kan være mono - eller polysynaptic i naturen. (B) TERPS kan testes på ORN til LN synapse. TTX bruges til at blokere handling potentialer og ophidselse i alle celler i præparatet. Ophidselse gendannes udelukkende i ORNs via NaChBac natrium kanalen. ORNs kan derefter blive ophidset med channelrhodopsin at fremkalde synaptic frigivelse. Synaptic arrangementer måles post-synaptically bruger hele-celle optagelser. (C) TERPS afslører, at ORN til LN synapse er monosynaptic. TERPS kan også kombineres med Farmakologi til at vise, at synapse kolinerge og blokerede af nikotin receptor antagonist mecamylamine (200 µM). Den lodrette grå linje angiver timingen af ORN stimulation. Dette tal er blevet ændret fra Zhang og Gaudry i 20169. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : TERPS er følsomme over for bulk eller mængde transmission frigivelse fra modulerende neuroner. (A) stimulering af CSDn resultater i en handling potentiale fra en indspillet LN i Drosophila antennal lap. (B) den LN er hyperpolarized således at CSDn stimulation resulterer i en subthreshold aktivitet. LN svar består af en hurtig depolarisering efterfulgt af en langsommere hyperpolarisering. Den grå linje angiver tidspunktet for CSDn stimulation. Methysergid (50 µM), en bred 5-HT receptor antagonist, blokerer den langsomme hyperpolarisering men har ingen effekt på depolarisering. Mecamylamine blokerer den hurtige depolarisering tyder på, at det er kolinerge i naturen. (C) TERPS kan bruges til at løse hvilke kemiske komponenter af CSDn til LN synapse er mono-versus polysynaptic. (D) The CSDn stimuleres i overværelse af TTX og postsynaptiske LN svar er målt i hele-celle optagelser. Hyperpolarisering fortsætter i TTX tyder på det er monosynaptic i naturen. Denne hyperpolarisering er også blokeret af methysergid, overensstemmelse med serotonerge transmission. Den korte depolarisering, der forbliver i TTX er sandsynligvis medieret af elektriske gap kobling, som det ikke er blokeret af nicotinsyre antagonister. Dette tal er blevet ændret fra Zhang og Gaudry i 20169. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1: Drosophila folie. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: fysiologi afdeling. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TERPS analyse komplimenter aktuelle teknikker bruges til kredsløb revner ved at aktivere påvisning af synapser mellem identificerede neuroner. Specifikt, afslører tilgangen monosynaptic forbindelser af bredt silencing handling potentialer med TTX mens gendannelse ophidselse i en udvalgt population af neuroner med TTX-ufølsom natrium kanalen NaChBac. Synaptic frigivelse er fremkaldt af optogenetic stimulation mens postsynaptiske begivenheder overvåges med hele-celle optagelser. TERPS adskiller sig fra andre metoder såsom GRASP af er følsomme over for bulk eller mængde transmission fremkaldt på længere distancer og evnen til at udføre farmakologisk manipulationer. Teknikken er relativt let at anvende og kræver kun én optagelse elektrode og en lyskilde til optogenetic stimulation, som er mere realistisk end at opnå dobbelt hele-celle optagelser på både præ- og post synaptic dele af synapser. Et grundlæggende krav i TERPS er, at handling potentialer nemt er blokeret af TTX i systemet ved at blive undersøgt. Men fordi TTX fungerer på neuroner på tværs af en bred vifte af taksonomiske phyla, det er sandsynligt, at TERPS kunne anvendes bredt på begge pattedyr og hvirvelløse modelsystemer.
TERPS kan nemt redigeres i en række manerer at lette enten stimulering af den formodede præsynaptiske befolkning eller til optagelse fra postsynaptiske mål. Her var en optogenetic værktøj bruges til at stimulere målpopulationer, om aktivering af en række mekanismer er muligt. Nervestimulation af sensoriske axoner, for eksempel, er rutine i undersøgelser af overførsel fra den antennal nerve i Drosophila16 og er velegnet i andre sensoriske systemer, herunder perifere nerver indeholdende mechanosensory neuroner. En lignende tilgang til tester funktionelle forbindelser i Drosophila udtrykt GCaMP calcium indikatorer i en population af neuroner under kørslen aktivitet i en anden befolkning via ionotropic purinoceptor P2X2 og ATP program2. Denne tilgang bør være forenelige med TERPS blot udtrykke Co NaChBac transgenet med P2X2 receptoren i en neuron og GCaMP i en anden befolkning til en fuldstændig patch-fri metode. Dog bør udvises forsigtighed med tilgange forårsager langsommere depolarizations, såsom de muskarine-baserede designer receptorer udelukkende aktiveres af en designer stof (DREADDs)17,18. Langsom depolarisering kunne føre til NaChBac inaktivering før aktionspotentialet generation.
Lignende metoder til TERPS har været ansat i pattedyr systemer. Sådanne teknikker kombinere TTX og channelrhodopsin til at kortlægge forbindelsen mellem neuroner. Channelrhodopsin aktivering alene generelt depolarisere ikke neuroner tilstrækkeligt, og dermed kalium kanal blokker 4-AP anvendes med TTX at fremkalde frigivelsen19,20,21. Mens dette virker på mange synapser, kan det ikke arbejde på nogle metabotropic synapser hvis downstream mål af receptor er en 4-AP følsomme kalium kanal. For eksempel, bygger serotonerge graduering af olfaktoriske svar i møl direkte på graduering af sådan en 4-AP følsomme K+ nuværende (IA)22. Denne tilgang også virkede ikke på CSDn til LN synapse (data ikke vist). Således TERPS har en fordel, der kræver mindre farmakologisk intervention sammenlignet med andre almindeligt anvendte metoder og kan arbejde på bredere eller synapser.
Der er et par begrænsninger TERPS, der bør overvejes. Først, der kan være potentielle bivirkninger fra kronisk udtryk for NaChBac kanalen i hele udvikling. Ordentlig kredsløb forsamling og funktion kan bekræftes ved at sammenligne aktiviteten af neuroner mellem kontrol flyver mangler NaChBac konstruktionen og flyver med konstruktion i mangel af TTX. For at undgå sådanne problemer, kunne udtryk af NaChBac transgenet kontrolleres tidsligt via udtryk for temperatur-følsomme GAL4 repressor, GAL8023. Desuden, hvis en synapse er kun observeret i en stat-afhængige måde, er det tænkeligt, at undertrykke netværksaktivitet med TTX kan skjule sådan en forbindelse. Det er vigtigt at understrege, at en positiv forbindelse observeret med TERPS sandsynligvis repræsenterer en ægte mono-synaptisk forbindelse, mens et negativt resultat ikke er bevis på fravær af en forbindelse.
Mens TERPS kan afsløre evne til senderen overgang fra en neuron til at påvirke postsynaptiske partner klart, langsom kanal dynamikken i NaChBac og plateau potentialer forbundet med dens aktivering gøre det mindre relevant i studiet af klassisk neurotransmission. En tilgang til at ændre TERPS for hurtigere, mere naturlig senderen frigivelse vil være at udtrykke en modificeret TTX-ufølsom version af den endogene Drosophila natrium kanalen para i modsætning til NaChBac. Denne ændring ville resultere i naturalistiske spiking aktivitet i cellen præsynaptiske og tillade mere konventionelle analyse af synaptisk transmission i mangel af netværksaktivitet. Dette ville have stort potentiale for studier af sats-kodning synapser, på hvilke fremkalde en bred vifte af præsynaptiske aktivitet uden rekruttering polysynaptic netværk vil være ønskeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Joshua Singer samt Jonathan Schenk og tankevækkende korrekturlæsere for kommentarer på manuskriptet. Vi vil også gerne takke Ben White og Harold Zakon diskussioner om teknikken. Jonathan Schenk fastsatte figur 3Adata. Dette arbejde blev støttet af en Whitehall Foundation Grant og en NIH R21 til QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
