Summary
이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.
Abstract
여기, 새로운 기술은 불린다 Tetrotoxin (TTX) 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS) 대상 뉴런 간의 monosynaptic 연결에 대 한 테스트에 적용 됩니다. 메서드는 특정 연 접 신경에서 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac, 유전자 변형 활성기의 공동 식에 의존합니다. 상 상속 후 시 냅 스 파트너와 연결 TTX, NaChBac을 표현 하지 않는 뉴런의 전기 활동을 차단 존재 전체 세포 기록에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 활성 또는 연결의 기자로 서 칼슘 이미징 작업을 수정할 수 있습니다. TERPS 성장 네트워크에서 연결을 결정 하는 데 사용할 수 있는 도구 집합을 추가 합니다. 그러나, TERPS는 독특한에 또한 안정적으로 대량 또는 볼륨 전송 및 전송 일 좀 보고.
Introduction
신경 과학의 주요 목표는 정보 회로 통해 흐르는 하는 방법을 이해 하는 뉴런 사이의 연결을 매핑합니다. 수많은 접근 및 자원 모델 시스템1,2의 범위에서 신경 사이의 기능적 연결을 위한 테스트를 사용할 수 있게 있다. 전기 생리학을 사용 하 여 가장 정확한 배선 다이어그램을 생성 하기 위해 두 셀 사이의 관찰된 연결 인지 직접 및 간접 및 polysynaptic monosynaptic를 해결 하기 위해 중요 하다. 포유류 뉴런에이 구별을 만들기 위한 황금 표준 연 접 세포에서 단일 action potentials와 두 번째 뉴런 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)의 발병 사이의 대기 시간을 측정 하는 것입니다. Monosynaptic 연결 몇 밀리초 및 낮은 다양성3의 짧은 대기 시간을 가져야 한다. 이 방법은 복잡할 수 있다 무척 추 동물 신경 세포에 시 냅 스 탐지 postsynaptic conductances와 녹음 사이 긴 electrotonic 거리 때문에 지연을 일으키는 체세포 녹음 사이트까지 그들의 dendrites에서 발생할 수 있기 때문에 전극입니다. 이러한 지연을 모호성에 관한 많은-monosynaptic 기여 대 발생할 수 있습니다. 또한, 작은 시 냅 스 이벤트 체세포 녹음 사이트에 도달 하기 전에 부패 수 있습니다 하 고 polysynaptic 이벤트를 모집 하는 강한 연 접 활동, 운전.
무척 추 동물에 monosynaptic 연결에 대 한 테스트를 다양 한 기법 개발 되었습니다. 한 가지 방법은 초과 ++ Mg 및 Ca+ +를 포함 하는 높은 divalent 양이온 솔루션 (안녕-디)를 사용 합니다. 이 솔루션 줄이는 릴리스 확률 및 monosynaptic 입력된4,5의 탐지를 증가 활동 전위 임계값에 의해 polysynaptic 연결을 차단 합니다. 하지만 필요한 ca ++ ++ Mg의 정확한 비율을 결정, 사소한 이며 polysynaptic 기부금도 겸손 자극6지속 될 수 있습니다. GFP 재구성에서 시 냅 스 파트너 (이해) 라는 다른 접근은 monosynaptic 연결 7을 유추 시 냅 스에서 발견 하는 사전 및 postsynaptic 막 간의 근접 합니다. 여기, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구성 요소는 하나의 신경에 표현 하 고 분자의 상호 보완적인 조각 putative postsynaptic 파트너에 표시 됩니다. 형광의 존재 두 개의 뉴런 충분히 가까이에 GFP 분자의 재구성을 허용 하는 한 시 냅 스의 존재를 의미 나타냅니다. 이해 수 보고 시 냅 스 거짓, 하지만, 두 세포 막, 신경 또는 잘라냅니다 apposed 밀접 하 게 해야 하는 경우. 이해의 변종 활성 시 냅 스8에 재구성 되므로 synaptobrevin 직접 GFP의 연 접 부분을 밧줄로 매 여 이러한 가양성을 제거 합니다. 이해 및 그 변종 초파리 CNS 기능 연결을 결정 하는 수단이 되어, 하는 동안 일부 연결 하지 만들 수 있습니다 보이는 파악 하 여 사전 및 postsynaptic 파트너 사이의 거리는 비교적 큰 경우. 이것은 neuromodulation9 또는 GABAergic 억제10와 관련 된 볼륨 전송의 평가에 특히 관련입니다.
여기, 보완 및 새로운 기술은 초파리 CNS에에서 직접 monosynaptic 연결 테스트에 대 한 시연입니다. 테트로도톡신 (TTX)의 공동 식으로 작동 하는이 메서드를 테트로도톡신 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS),-저항 나트륨 채널, NaChBac, 및 상 상속에서 녹음 하는 동안 연 접 세포에서 optogenetic 활성 postsynaptic 파트너9. TTX, 존재 모든 활동 전위 중재 활동 NaChBac 표현 된 셀에 표시 되지 않습니다. NaChBac 채널 선택적으로 허용 하는 시 냅 스 전송 빛 갖는 대상된 연 접 셀에 흥분을 복원 합니다. 이 메서드는 연결 postsynaptically polysynaptic 회로 채용의 가능성을 줄이면서 체세포 녹음 하 여 해결할 수 연 접 신경의 강한 활성화를 허용 합니다. 중요 한 것은,이 기술은 볼륨 전송의 연구를 허용 하 고 회로 통해 하나의 신경에서 발표 하는 송신기의 확산을 보여준다. 또한, TERPS 기존의 약리학 통해 연결의 화학 본질을 밝힐 수 있다. TERPS는 TTX 구분 나트륨 수로의 유전자 변형 식 수 있도록 어떤 모델 시스템에 사용 하기 위해 적합 이다.
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Protocol
1. 파리와 식별 GAL4 발기인 라인 준비
- GAL4 발기인 라인을 선택 하 고 파리 UAS-NaChBac transgene과 활성화를 위한 optogenetic transgene 크로스.
참고: UAS-CsChrimson11 는 그것의 높은 전도도 및 NaChBac 중재 활동 전위를 활성화는 쉽게 선택 됩니다. UAS-NaChBac 및 UAS-CsChrimson 블루밍턴 주식 저장소에서 사용할 수 있습니다. - 에탄올 (35mm)에서 재고 솔루션으로 모든 trans 망막을 준비 하 고-20 ° c.에 냉장고에서 솔루션을 저장
- Rehydrated 감자의 약 5 mL에이 주식의 믹스 28 µ L 음식 찌 질 하 고 기존의 초파리 매체의 유리병의 상단에이 혼합물을 추가.
- 1-3 일110.2 m m 모든-trans-망막을 포함 하는 음식에 csChrimson을 표현 하는 성인 파리를 올립니다.
2. 준비 TTX 주식
- 증류수 또는 이온을 제거 된 물에서 1mm TTX의 재고 솔루션을 만듭니다. 몇 달 동안 실험실 냉장고에이 솔루션을 저장 합니다. 많은 기관 분류 유해 또는 제어 물질 TTX TTX의 저장에 관한 기관 정책 확인.
3. 전기 생리학에 대 한 파리 준비
- 1-3 일 오래 된 성인 파리 발생 하는 모든-trans-망막에와 함께 음식에 수집 합니다.
참고: 패치 초파리 신경12,13클램핑에 대 한 자세한 설명에 대 한 2013 년에 목요일와 터너를 참조 하십시오. - 유리 섬광 유리병에 파리를 넣어. 파리를 무력화를 1 분 동안 얼음에 유리병을 놓습니다.
- 굵은 집게를 사용 하 여 비행 주문 품 기록 챔버에 삽입. 3 ½"원형 레이저 1/16" 아크릴에서 잘라 챔버에 의하여 이루어져 있다. 사용자 지정 호 일 2 부분 에폭시를 장착 하는 센터에 컷 ¾"구멍 이다. 호 일 포함는 삼각형 모양의 비행에 삽입 되는 희망 합니다.
- 왁 스 또는 UV 경화 에폭시 단단히 챔버 내에 기록 그것을 확보 하 여 동물의 주위에 적용 됩니다.
- 시각화는 stereomicroscope 아래 목이 광섬유와 대비를 밝게. 간접 조명에 대 한 목이 섬유 그렇게 그들은 측면에서 직접 비행을 밝히는 그들을 조정 하 여 설정 합니다.
- 가장 낮은 가능한 설정의 명확한 시각화 수 있습니다 가벼운 수준을 조정 합니다. 이 빛의 강도 개별 실험에 걸쳐 달라 집니다.
참고:이 프로토콜 적응 시킬 수 있다 방법14explant에서 원래의 뇌 를 사용 하 여. - 외부 기록 식 염 수를 검색 합니다. M m에는 염 분 포함: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-트리 스 (hydroxymethyl) 메 틸-2-aminoethane-sulfonic 산, 8 트 레 할 로스, 포도 당 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2포4, 1.5 CaCl2및 4 MgCl2 (270-275 m ω를 조정). 염 분 95% O2/5% CO2 (carbogen) 버블링 됩니다 하 고 pH 7.315조정 했다.
- 장소 세포 외 기록 염 분의 4-6 방울 비행 준비. 이 시점에서, 더 나은 시정을 위한 해 부 현미경에서 가벼운 수준을 높입니다.
- 전기 분해를 사용 하 여 텅스텐 와이어에 선명 하 게. 통신을 하려면 알 것3 의 포화 솔루션을 준비 하 고 끝은 날카롭게 때까지 20 번 각 100 ms 대 한 솔루션으로 와이어의 끝을 찍기 동안 약 20 V의 교류 전류를 적용 합니다. 날카롭게 텅스텐 와이어를 사용 하 여 비행 하 고 따라서 뇌를 노출의 머리에 표 피를 제거 하.
- 더욱 기도 그것을 둘러싸고 있는 지방 시체를 제거 하 여 뇌를 노출 합니다. 더듬이 돌출부를 액세스 하는 경우 부드럽게 가시성을 높이기 위해 챔버를 기록 하는 호 일 아래 안테나 턱 구부러진된 텅스텐 와이어 또는 유사한 도구를 사용 합니다. 날카로운 집게를 사용 하 여 부드럽게 찢 어 떨어져 녹음 만들 수 관심의 영역을 다루는 glial 넣기.
- 전기 생리학 장비에 기록 챔버를 전송 합니다. 즉시 외부 기록 식 염 수와 시작 관류 carbogen 두뇌를 보존 하와 버블링. 염 저수지 현미경 무대 위에 배치 되 고 중력-먹이로 준비. 진공 라인과 2 L 삼각 플라스 크를 사용 하 여 폐기물 염 분을 수집.
4. 얻을 전체 세포 기록
- 상업적인 피펫은 끌어당기는 패치 펫을 당겨. 7 m ω 근처 팁 저항 적절 한 피 펫을 달성 하기 위해 설정에 대 한 설명서를 참조 하십시오.
- 패치 피 펫에 내부 기록 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다. 내부 식 염 수로 구성 되어 140 칼륨 aspartate 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 나3GTP, 1 EGTA, 1 m m에서 KCl.
- 전체 세포 기록에 대 한 패치 클램프 앰프를 설정 합니다. 앰프의 오프셋 0 고 테스트 펄스를 제공 하는 앰프를 설정 합니다. 여기, 오전 시스템 패치 클램프 증폭기 2400 사용 됩니다.
- 피펫으로 통해 긍정적인 압력을 적용 하는 셀. 피펫으로와 셀 문의 micromanipulator를 사용 합니다. 긍정적인 압력을 릴리스 합니다. 설정-60 막의 지주 잠재력 mV. 피펫으로 낮은 하위 피코 현재 들고 알 수 있듯 셀의 막과 gigaohm 물개를 형성 한다.
참고: 경우 GFP를 사용 하 여 셀을 대상으로 안내, ChR2 활성화 및 잠재적인 시냅틱 우울증을 방지 하기 위해 epifluorescent 빛의 사용을 최소화 하십시오. 또한 5 단계를 적용 하기 전에 몇 분 동안 기다립니다. - -50에서 테스트 펄스를 제공 하는 앰프 설정 mV-60 ~ mV. 이 설정은 패치 클램프 앰프에 표준입니다. 테스트 펄스는 큰 capacitative 과도 대표 현재 필요한 패치 피펫으로 충전을 발표할 예정 이다. 2400 오전에 용량 보상 손잡이 조정 하 여 capacitative 과도 또는 유사한 앰프를 제거 합니다.
- 세포 막 파열 하 고 전체 셀 구성에 부정적인 압력의 짧은 펄스를 적용 합니다.
참고: 모든 셀 구성 신경의 커패시턴스를 보여주는 capacitative 과도 있는 큰 증가 있을 때 관찰 됩니다. 현재 지주 (초기)에 작은 증가 또한 관찰 가능성이 됩니다. 전류 클램프 모드를 앰프를 설정 하 고 조정-60-50 하 셀의 잠재력 mV.
5. 시 냅 스 연결 테스트
- 광 펄스를 생성 하는 LED 드라이버를 방 아 쇠를 데이터 수집 (DAQ) 시스템을 구성 합니다. 여기, 내쇼날인스트루먼트 DAQ 시스템 Matlab와 LED 드라이버는 아날로그 신호를 제공 하는 데 사용 됩니다. LED 휘도 아날로그 신호는 드라이버를 통해 조정 됩니다. LED는 620-630 nm 파장 LED입니다.
- 고성능 적색 LED 직접 준비 아래 위치. 0.238 mW/m m2 에 도달 하면 즉시 빛의 강도 조정 합니다.
- 연 접 신경 postsynaptic 세포의 관심에서 녹음 하는 동안 활성화 됩니다. 셀 활성화 optogenetically, pharmacogentically, 달성 또는 신경 자극을 통해. 여기, csChrimson 및 빨간 빛의 짧은 펄스 적용 됩니다.
참고: EPSPs로 전류 클램프 또는 EPSCs로 전압 클램프에 시 냅 스 연결을 모니터링할 수 있습니다. 시 냅 스 연결 40 ms 빛 펄스 응답에 TTX를 적용 하기 전에 표시 됩니다. 연결을 관찰 하는 경우에, 그것은 가능성이 그 뉴런 synaptically 연결 중 모노-또는 polysynaptically. 잠재적인 들고 따라 흥분 성의 또는 금지 연결을 강조 하 고 조정할 수 있다. - 연결 1의 최종 농도 달성 하기 위해 관류 시스템에 TTX를 추가 정상적인 염 분에서 관찰 되는 경우 µ M. 사용 recirculating 펌프를 캡처하고 TTX를 보존 하기 위해 염 분을 다시 사용 합니다. 연동 펌프는 목욕에서 염 분 해결책을 그릴 하 고 염 분이 저수지에 반환.
- 상승 및 하강에 목욕에서 염 분 수준을 허용 하지 않는 강한 일정 한 진공을 제공 하는 펌프의 속도 조정 합니다.
참고: TTX의 응용 프로그램 전체 셀에서 모니터링 되 고 신경에 활동 급상승의 발생 한다. 이 충분 한 TTX는 식 염 수에 추가 된 확인 합니다. - 빨간 불 (40 ms 각 펄스에 대 한)의 짧은 펄스를 다시 적용 합니다. 이 시점에서 남아 있는 어떤 시 냅 스 연결 높습니다 monosynaptic. TTX에 남아 있는 시 냅 스 연결의 화학 본질을 테스트 하는 반복 식 염 수를 약리 길 항 제를 추가 합니다.
참고: optogenetics 및 형광 타겟팅 뉴런의 결합 때 수 있습니다 지속적으로 활성화 녹음을 얻기 위해 노력 하는 동안 신경의 연 접 인구 수는 없습니다. 이 시 냅 스 우울증으로 이어질 수 있다 고 어려운 연결을 볼 수 있습니다. 빨간색 fluorophore 신경 및 channel2rhodopsin 시각화를 사용할 수 있는 csChrimson 긴 여기 밴드 녹색 형광 단백질의 범위를 광범위 하 게 확장 하는, 때문에 (Ch2R) 세포 인구를 흥분 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 특정 유전학 및 사용자 지정 필터 큐브 필요 합니다. 적당 한 파리를 생성 하려면 LexA 또는 Q 시스템 이진 식 시스템에서 빨간 fluorophore (RFP 또는 mCherry)를 표현 하는 파리를 확인 합니다. 이들은 파리 Gal4 발기인와 UAS-Ch2R 및 UAS-NaChBac 이펙터 유전자와 교차 해야 합니다. Epifluorescence에 대 한 최적의 필터 큐브 것입니다 빨간 fluorophore를 자극 하지만 하지 자극 Ch2R. 또한 좁은 여기 범위, 필터 세트 다량 방출된 빛을 수집 하는 긴 패스 방출 필터를 포함 해야 합니다. 우리 크로마 포함 부품 번호 et580/25 x와 (49306 세트)에서 t600lpxr에서에서 설정 사용자 지정 필터를 사용 하지만 et610lp 장벽/방출 필터.
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Representative Results
TERPS는 모노-및 뉴런 간의 시 냅 스 연결에 polysynaptic 기여 사이 구별 하는 데 사용 됩니다. 셀의 약한 자극 직접 연결을 테스트 하는 데 사용 될 수 있습니다, polysynaptic 연결 (그림 1A) 보충 자주 큰 연 접 활동을 운전 한다. TERPS 공동 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac와 optogenetic 활성기를 표현 하 고 polysynaptic 연결 (그림 1B)를 제거 하는 TTX의 연결을 테스트 하 여 작동 합니다. TTX는 TERPS (그림 2A)에 대 한 적절 한 준비 하기가 초파리 뇌의 활동 전위를 효과적으로 차단 합니다. NaChBac 나트륨 채널의 유전자 변형 식 구출 뉴런에 흥분 하며 큰 고원 잠재력 (그림 2B).
더듬이 엽에서 로컬 수 (LN) 후 각 자극 (그림 3A)에 강력한 반응을 보여줍니다. 그러나, 개별 EPSPs LN 소마에서 쉽게 해결 하지 않기 때문에 이러한 응답 후 각 수용 체 신경 입력 (온)에서 직접 발생 또는 직접 하지 프로젝션 뉴런 (PN) (그림 3B)를 통해 입력 하는 경우에 불분명 남아 있습니다. TERPS를 사용 하 여 여기에 표시 하는 ORNs 실제로 LNs (그림 3C)와 직접 시 냅 스 연결 할 합니다.
TERPS의 독특한 특징은 그것의 해결 능력을 구체적으로 GABA 또는 neuromodulators 세로토닌 등 발생할 수 있는 여분의 시 냅 스 볼륨 전송 이다. 초파리 의 더듬이 엽에서 serotonergic 신경 (CSDn)의 자극 흥분 및 억제 로컬 interneuron (그림 4A , 그림 4B)에서 혼합물에서 발생합니다. 여기 흥분 성의 송신기 아 세 틸 콜린으로 묵상 하 고 억제는 기인한 다 세로토닌 (그림 4C 와 그림 4D). TERPS 결정 하는 연결 monosynaptic polysynaptic 연결 (그림 4E)을 제거 하 여 사용할 수 있습니다. TTX, 강한 금지는 (그림 4 층 및 그림 4G) 특정 serotonergic 뉴런의 활성화에서 직접에서 도착 하는 것을 건의 하는 LN에서 아직도 관찰 됩니다. 이 연결은 세로토닌 길 항 제 methysergide에 의해 차단 됩니다. 아 세 틸 콜린에 의해 중재 흥분 성의 냅 polysynaptic 소스에서 발생 하는 것을 건의 하는 TTX에서 탈락 했다.
그림 1 : TERPS polysynaptic 연결을 제거 하 고 monosynaptic 입력 분리. (A). 연 접 활동 증가 polysynaptic 연결을 모집 할 수 있는 보여주는 회로도. (B). 어떻게 TERPS TTX를 사용 하 여 신경에서 스파이크 활동을 제거 하 여 polysynaptic 기여를 제거할 수 있습니다 보여주는 다이어그램. 흥분 성 신경 흥분된 optogenetically 수 있는 다음의 한 인구에 독점적으로 복원 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : NaChBac 복원에 신경 흥분 초파리 신경. (A) 1 µ m TTX 말살 초파리 신경에 있는 급상승의 응용 프로그램. 자발적인 활동 및 냄새 갖는 저해 TTX에서 제거 됩니다. (B) NaChBac와 csChrimson는 CSDn에서 표현 되 고 두뇌 TTX에 노출 됩니다. csChrimson 자극 depolarizes는 CSDn 이며 후 임계값, 큰 비-선형 CSDn 막 전압에 있는 증가. 이 급속 한 도발은 고원 같은 잠재력 (인세트)를 구성합니다. 시뮬레이션 농도 걸쳐 각 색 같은 색 전압 삽입에 해당합니다. 이 그림은 장 및 Gaudry 20169에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : TERPS ORNs 및 LNs 사이 monosynaptic 연결을 보여준다. (A) A 샘플 녹음에는 ln. 냄새 응답을 보여주는 이 응답 수 있습니다 모노-또는 자연에서 polysynaptic. (B) TERPS LN 냅에 온에서 테스트할 수 있습니다. TTX는 활동 전위 및 준비에 있는 모든 셀에서 흥분을 차단 하는 데 사용 됩니다. 흥분은 독점적으로 NaChBac 나트륨 채널을 통해 ORNs에 복원 됩니다. 다음 시 냅 스 출시를 유도 하는 ORNs channelrhodopsin로 흥분 수 있습니다. 시 냅 스 이벤트 post-synaptically 전체 셀 녹음을 사용 하 여 측정 됩니다. (C) TERPS LN 냅에 온 monosynaptic을 나타냅니다. TERPS는 또한 시 냅 스는 해 고 nicotinic 수용 체 길 항 제 mecamylamine (200 µ M)에 의해 차단 된 보여 약리학과 결합할 수 있습니다. 회색 세로 막대 온 자극의 타이밍을 나타냅니다. 이 그림은 20169장 및 Gaudry에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : TERPS modulatory 뉴런에서 대량 또는 볼륨 전송 릴리스는. (A) 초파리 의 더듬이 엽에 기록 된 LN에서 활동 전위는 CSDn의 자극. (B)는 LN CSDn 자극 subthreshold 활동 결과 hyperpolarized입니다. 뒤에 느린 hyperpolarization 빠른 도발은 LN 응답에 의하여 이루어져 있다. 회색 막대는 CSDn 자극의 시간을 나타냅니다. Methysergide (50 µ M), 넓은 5-HT 수용 체 길 항 제, 느린 hyperpolarization 차단 했으나는 도발은에 영향을 주지 않습니다. Mecamylamine 차단 빠른 도발은 자연에 해 다는 것을 제안 합니다. (C) TERPS LN 냅을 CSDn의 화학 구성 요소는 모노-polysynaptic 대를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다. (D)는 CSDn TTX의 자극 그리고 postsynaptic LN 응답 전체 세포 기록에서 측정 됩니다. hyperpolarization 자연에서 monosynaptic 그것을 제안 하는 TTX에서 지속 합니다. 이 hyperpolarization 또한 methysergide, serotonergic 전송 일치에 의해 차단 됩니다. TTX에 남아 있는 간단한 도발은 가능성이 전기 갭 커플링, nicotinic 길 항 근에 의해 차단 되지 그것은 의해 중재 됩니다. 이 그림은 20169장 및 Gaudry에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 1: 초파리 호. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일 2: 생리학 실. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
TERPS 분석 회로 확인 된 신경 세포 사이의 시 냅 스의 검출 함으로써 크래킹에 사용 되는 현재 기술을 칭찬. 특히, 접근 선택 인구 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac 신경의 흥분을 복원 하는 동안 TTX와 활동 전위를 광범위 하 게 입을 여 monosynaptic 연결을 보여준다. 시 냅 스 릴리스 postsynaptic 이벤트는 전체 셀 녹음과 모니터링 하는 동안 optogenetic 자극에 의해 elicited입니다. TERPS 대량 민감한 되 고 또는 더 긴 거리 및 약리 조작을 수행할 수 있는 능력에 elicited 볼륨 전송에 의해 파악 등 다른 접근 방식에서 자체를 구별. 기술은 고용 비교적 간단 하 고 시 냅 스의 사전 및 사후 시 냅 스 부분에 듀얼 전체 셀 녹음을 얻기 보다 더 가능 optogenetic 자극에 대 한 하나만 기록 전극과 광원을 요구 한다. TERPS의 기본적인 요구가 이다 활동 전위 되 고 시스템에 TTX에 의해 쉽게 차단 됩니다. 하지만, TTX 분류학 문의의 광범위 한 범위에 걸쳐 신경에 작용, 때문에 TERPS 수 모두 포유류 및 무척 추 동물 모델 시스템을 광범위 하 게 적용 될 가능성이 높습니다.
TERPS 수정할 수 있습니다 쉽게 다양 한 방법 중 하나를 촉진 하기에 상 상속의 연 접 또는 postsynaptic 대상에서 기록에 대 한 자극. 여기, 다양 한 메커니즘에 의해 활성화가 가능 하지만 대상 인구를 자극 하는 optogenetic 도구 사용 되었다. 예를 들어 감각 축 삭의 신경 자극 전송 초파리16 더듬이 신경에서의 연구에 루틴 이며 mechanosensory 뉴런을 포함 하는 주변 신경 등 다른 감각 시스템에 적합. 초파리 에 기능 연결을 테스트 하는 유사한 접근 방식을 표현 GCaMP 칼슘 표시기는 ionotropic purinoceptor P2X2와 ATP 응용 프로그램2를 통해 다른 인구에서 활동을 운전 하는 동안 신경의 한 인구. 이 방법은 단순히 공동 하나의 뉴런에 P2X2 수용 체와 완전히 패치 무료 방법에 대 한 또 다른 인구에 있는 GCaMP NaChBac transgene 표현 하 여 TERPS 호환 이어야 한다. 그러나, 주의 접근 muscarinic-기반 디자이너 수용 체 디자이너 약물 (DREADDs)17,18에 의해 독점적으로 활성화 같은 느린 depolarizations를 일으키는 취해야 한다. 느린 도발은 활동 전위 생성 하기 전에 NaChBac 비활성화 될 수 있습니다.
TERPS에 유사한 메서드는 포유류 시스템에서 고용 되었다. 이러한 기술을 결합 TTX와 channelrhodopsin 뉴런 간의 연결에 밖으로 지도. Channelrhodopsin 활성화 혼자 일반적으로 않습니다 하지 depolarize 신경 충분히, 그리고 따라서 칼륨 채널 차단기 4 AP 출시19,,2021유도 TTX 적용 이다. 동안이 많은 시 냅 스에서 수용 체의 다운스트림 대상이 4 AP 민감한 칼륨 채널 경우 일부 metabotropic 시 냅 스에서 하지 작동 수 있습니다. 예를 들어, 나 방 후 각 응답의 serotonergic 변조 같은는 4 AP 민감한 K+ 전류 (IA)22의 변조에 직접 의존합니다. 이 방법은 또한 LN 냅 (데이터 표시 되지 않음)를 CSDn에서 작동 하지 않았다. 따라서, TERPS 다른 일반적으로 사용 되는 방법에 비해 적은 약리학 내정간섭 요구의 이점이 및 넓은 범위 또는 시 냅 스에서 작동 수 있습니다.
TERPS 고려해 야 하는 몇 가지 제한이 있다. 첫째, 만성 식 개발에 걸쳐 NaChBac 채널에서에서 잠재적인 부작용 있을 수 있습니다. 적절 한 회로 어셈블리 및 기능 제어 뉴런의 활동 NaChBac 구문 부족 한 파리를 TTX의 부재에 구조와 비교 하 여 확인할 수 있습니다. 이러한 문제를 방지 하려면 식 NaChBac transgene의 온도 민감한 GAL4 진압, GAL8023의 표현을 통해 일시적으로 제어할 수 수 있습니다. 또한,는 시 냅 스만 상태 종속적 방식에서 관찰, 경우 생각할 수 있는 TTX 네트워크 활동을 억제 같은 연결을 숨길 수 있습니다. 그것은 부정적인 결과 연결 부재의 증거가 되지 않습니다 동안 관찰 TERPS 가능성이 긍정적인 연결 나타내는 진정한 모노 시 냅 스 연결을 강조 하는 것이 중요.
TERPS 송신기의 능력을 계시 할 수 있다 하는 동안 postsynaptic 파트너를 명확 하 게, 영향을 미치는 하나의 뉴런에서 NaChBac의 느린 채널 역학 놓고 고원 잠재력의 활성화와 관련 된 렌더링 덜의 연구에 적용 neurotransmission입니다. 위한 TERPS를 빠르게 변경 하는 한 가지 방법은, 더 자연 스러운 송신기 릴리스는 생 초파리 나트륨 채널 파라 NaChBac에 반대의 수정된 TTX 구분 버전 표현 될 것입니다. 이 변경 연 접 세포에서 자연 급격히 활동 귀 착될 것 이며 네트워크 활동의 부재에서 더 많은 기존의 분석 시 냅 시스 전송의 허용. 이 속도 코딩 시 냅 스, 어느 도출에 바람직한 것 polysynaptic 네트워크를 모집 하지 않고 연 접 활동의 광범위의 연구에 대 한 큰 잠재력이 있을 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 의견에 대 한 사려깊은 검토 뿐만 아니라 여호수아가 수, 조나단 Schenk, 원고에 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 벤 화이트와 해 롤 드 Zakon는 기술에 대 한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 조나단 Schenk 그림 3A에 대 한 데이터를 제공합니다. 이 작품은 Whitehall 재단 보조금과 QG NIH R21에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
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