Summary
Cet article propose une méthode pour tester les connexions monosynaptiques entre neurones en employant la tétrodotoxine et canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac.
Abstract
Ici, une nouvelle technique appelée Tetrotoxin (TTX) Engineered résistance des Synapses à sonder (TERPS) est appliquée pour tester la monosynaptiques connexions entre les neurones de la cible. La méthode s’appuie sur la co-expression d’un activateur transgénique avec canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac, dans un neurone présynaptique spécifique. Connexions avec les partenaires post-synaptiques putatifs sont déterminées par cellule entière enregistrements en présence de TTX, qui bloque l’activité électrique dans les neurones qui n’expriment pas de NaChBac. Cette approche peut être modifiée pour fonctionner avec un activateur ou imagerie calcique comme journaliste de connexions. TERPS ajoute à l’ensemble croissant des outils disponibles pour déterminer la connectivité au sein des réseaux. Cependant, les TERPS est unique en ce qu’elle rapporte aussi fiable en masse ou volume et transmission de débordement.
Introduction
Un objectif majeur des neurosciences consiste à mapper les connexions entre les neurones pour comprendre comment l’information circule à travers des circuits. Nombreuses approches et les ressources sont devenues disponibles pour tester la connectivité fonctionnelle entre les neurones dans une gamme de systèmes de modèle1,2. Pour générer les schémas de câblage plus précis à l’aide d’électrophysiologie, il est important de résoudre si connexions observées entre deux cellules sont directs et monosynaptique versus indirecte et polysynaptiques. Un étalon-or pour faire cette distinction dans les neurones chez les mammifères est de mesurer la latence entre unique action potentials dans les cellules présynaptiques et l’apparition de courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) dans le deuxième neurone. Connexions monosynaptiques devraient avoir courts temps de latence de quelques millisecondes et faible variabilité3. Cette approche peut être compliquée dans les neurones d’invertébrés comme les synapses peuvent être chez leurs dendrites loin du site d’enregistrement somatique, provoquant des retards dans la détection en raison des distances longues électrotonique entre conductances postsynaptiques et l’enregistrement électrode. Ces retards peuvent introduire des ambiguïté concernant poly-par rapport aux cotisations monosynaptiques. En outre, petits événements synaptiques peut se désintégrer avant d’atteindre le site d’enregistrements somatique et conduire plus forte activité présynaptique, est susceptibles de recruter des événements polysynaptiques.
Diverses techniques ont été développés pour tester les connexions monosynaptiques chez les invertébrés. Une approche utilise des solutions de haute cation divalent (Hi-Di) contenant des excès de Mg++ et Ca++. Cette solution bloque les connexions polysynaptiques par probabilité de libération réductrice et croissant seuil de potentiel d’action pour favoriser la détection de monosynaptique entrée4,5. Déterminer le rapport précis entre la Mg++ ca++ nécessaire, cependant, n’est pas trivial et polysynaptiques contributions peuvent persister pendant une stimulation même modeste6. Une approche alternative appelée Reconstitution GFP entre partenaires synaptiques (GRASP) profite de la proximité entre les membranes préalables et postsynaptiques trouvé au niveau des synapses d’inférer une connexion monosynaptique 7. Ici, une composante de la protéine fluorescente verte (GFP) s’exprime dans un neurone, et le fragment complémentaire de la molécule est exprimé dans un partenaire postsynaptique putatif. La présence de fluorescence indique que les deux neurones sont très suffisamment proches pour permettre la reconstitution de la molécule GFP et implique l’existence d’une synapse. GRASP peut signaler les synapses faussement, cependant, si deux cellules ont étroitement accolées des membranes, comme dans un nerf ou fascicules. Variantes du GRASP éliminent ces faux positifs en attachant le fragment présynaptique de GFP directement à synaptobrévine, permettant ainsi la reconstitution qu’au synapses actives8. Tandis que le GRASP et ses variantes ont grandement contribués à établir la connectivité fonctionnelle chez la drosophile CNS, certaines connexions ne peuvent pas rendues visibles par emprise si les distances entre les partenaires de pré- et post-synaptiques est relativement importante. Ceci est particulièrement pertinent dans l’évaluation de la transmission de volume associée à la neuromodulation9 ou de l’inhibition GABAergique10.
Ici, une technique nouvelle et complémentaire est démontrée pour tester les connexions directes de monosynaptiques chez la drosophile CNS. Cette méthode, appelée tétrodotoxine Engineered résistance pour sonder Synapses (TERPS), fonctionne par la co-expression de la tétrodotoxine (TTX)-canal sodique résistant, NaChBac et un activateur d’optogenetic dans une cellule présynaptique pendant l’enregistrement de putatif partenaires postsynaptique9. En présence de TTX, toute l’activité induite par le potentiel d’action est supprimée dans les cellules autres que celles exprimant NaChBac. Le canal de NaChBac restaure sélectivement excitabilité dans les cellules présynaptiques ciblées, permettant la transmission synaptique évoquée par la lumière. Cette méthode permet de forte activation des neurones présynaptiques, telles que les connexions peuvent être résolues postsynaptique par somatique enregistrement tout en réduisant la probabilité de recrutement circuits polysynaptiques. Ce qui est important, cette technique permet l’étude de la transmission de volume et révèle la propagation du transmetteur libéré d’un neurone unique tout au long d’un circuit. En outre, les TERPS peut révéler la nature chimique de la connexion par le biais de pharmacologie traditionnelle. TERPS est adapté pour une utilisation dans n’importe quel système de modèle qui permet l’expression transgénique des canaux de sodium insensibles à la TTX.
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Protocol
1. préparer les mouches et identifier GAL4 promoteur lignes
- Sélectionnez une ligne de promoteur de GAL4 et traversez-la avec mouches transporter le transgène SAMU-NaChBac et un transgène d’optogenetic pour l’activation.
Remarque : SAMU-CsChrimson11 est sélectionné en raison de sa conductivité élevée et la facilité avec laquelle il active les potentiels d’action induite par le NaChBac. Les SAMU-NaChBac et SAMU-CsChrimson sont disponibles depuis le référentiel de Stocks de Bloomington. - Préparer le rétinal all-trans comme une solution dans l’éthanol (35 mM) et de conserver la solution dans le congélateur à-20 ° C.
- Mix 28 µL de ce stock dans environ 5 mL de pomme de terre réhydraté nourriture de flocon et ajouter ce mélange à la partie supérieure d’un flacon de milieu conventionnel de drosophile .
- Augmenter les mouches adultes exprimant le csChrimson de l’alimentation humaine contenant 0,2 mM tout-trans-rétinal pour 1 à 3 jours,11.
2. préparer le Stock TTX
- Créer une solution de 1 mM TTX dans l’eau distillée ou désionisée. Conserver cette solution dans un réfrigérateur de laboratoire pendant plusieurs mois. Vérifiez les politiques des institutions concernant le stockage de TTX comme classent les nombreuses institutions TTX comme une substance dangereuse ou contrôlée.
3. préparer les mouches pour l’électrophysiologie
- Recueillir des jour 1 – 3 mouches adultes vieux qui sont déclenchés sur la nourriture avec all-trans-rétinal.
Remarque : Reportez-vous à Murthy et Turner en 2013 pour une description détaillée du patch serrage Drosophila neurones12,13. - Mettre les mouches dans un flacon en verre de scintillation. Placer le flacon sur la glace pendant 1 min immobiliser les mouches.
- Grosses pinces permet d’insérer une mouche dans une chambre d’enregistrement sur mesure. La chambre se compose d’un 3 ½" cercle découpées au laser de 1/16" en acrylique. Découpez un trou de ¾" est dans le centre où il est attachée une feuille personnalisée avec 2 parties époxy. La grille contient une triangulaire en forme d’espoir que la mouche est insérée dans.
- Appliquer une cire ou époxy durcissable UV autour de l’animal pour le fixer solidement au sein de la chambre d’enregistrement.
- Illuminer la préparation avec une fibre optique à col de cygne pour la visualisation sous un stéréomicroscope. Réglez les fibres du col de cygne pour éclairage oblique en ajustant leur afin qu’ils illuminent la volée directement sur le côté.
- Ajuster le niveau de luminosité plus faible réglage possible qui permet encore une visualisation claire de la mouche. Cette intensité lumineuse varieront d’expériences individuelles.
Remarque : Ce protocole peut être adapté à l’aide d’un in situ cerveau explantation méthode14. - Récupérer un enregistrement externe saline. La solution saline contient en mM : 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxyméthyl) l’acide méthyl-2-aminoéthanethiol-sulfonique, tréhalose 8, glucose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2et 4 MgCl2 (270-275 mΩ ajustée). La solution saline est propagée avec 95 % O25 % CO2 (carbogen) et a un pH ajusté à 7,315.
- Recouvrir la préparation mouche de 4 à 6 gouttes de solution saline enregistrement extracellulaire. À ce stade, augmenter le niveau de lumière au microscope la dissection pour une meilleure visibilité.
- Aiguiser un fil de tungstène par électrolyse. Pour rendre le fil, préparer une solution saturée de KNO3 et appliquer environ 20 volts de courant tout en trempant l’extrémité du fil dans la solution 20 fois pour chaque 100 ms jusqu'à ce que la pointe est aiguisée. Utilisez le fil de tungstène affûté pour supprimer la cuticule sur la tête de la mouche et exposant ainsi le cerveau.
- Exposer davantage le cerveau en supprimant la trachée et les corps gras qui l’entourent. Si accédant les lobes antennaires, utiliser un fil de tungstène courbé ou un outil similaire pour rentrer doucement antennes sous la feuille d’enregistrement chambre pour augmenter la visibilité. Forte pince permet d’arracher délicatement l’enveloppe gliale couvrant la zone d’intérêt où les enregistrements seront fera.
- Transfert de la chambre d’enregistrement au banc d’essai électrophysiologie. Immédiatement le début de perfusion avec du sérum physiologique enregistrement externe barboter avec carbogen pour préserver le cerveau. Le réservoir de solution saline est placé au-dessus de la platine du microscope et est alimenté par gravité à la préparation. Utiliser une ligne vide et une fiole d’Erlenmeyer de 2 L pour recueillir la déchets saline.
4. obtention de l’enregistrement de la cellule entière
- Tirer les pipettes de patch sur un extracteur de pipette commerciale. Consulter le manuel des paramètres atteindre une pipette appropriée avec une résistance à la pointe près de 7 mΩ.
- Ajouter 4 µL de solution d’enregistrement interne dans une pipette de patch. La solution saline interne se compose de 140 aspartate de potassium, 10 HEPES, MgATP 4, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA et 1 KCl en mM.
- Mis en place l’amplificateur pince patch pour l’enregistrement de la cellule entière. Zéro de décalage de l’amplificateur et configurer l’amplificateur afin de fournir les impulsions d’essai. Ici, un amplificateur de pince AM systèmes Patch 2 400 est utilisé.
- Appliquez une pression positive par le biais de la pipette et approche de la cellule. Utilisez un micromanipulateur pour diriger la pipette et contacter la cellule. Relâcher la pression positive. Ensemble le potentiel de maintien de la membrane à -60 mV. La pipette doit former un joint de gigaohm avec la membrane de la cellule comme en témoigne une basse sub-picoamp tenant actuel.
NOTE : Si à l’aide de GFP guidé ciblant les cellules, essayer de minimiser l’utilisation de la lumière épifluorescente prévient-on ChR2 activation et potentielle synaptique dépression. Aussi, attendez quelques minutes avant d’appliquer l’étape 5. - Configurer l’amplificateur afin de fournir les impulsions d’essai de -50 mV à -60 mV. Ce paramètre est standard sur les amplificateurs de patch clamp. Impulsions de test révélera un grand transitoire capacitif qui représente le courant nécessaire pour recharger la pipette. Enlever capacitif transitoires en ajustant les boutons de compensation de capacité sur l’AM 2400 ou amplificateur similaire.
- Appliquer de brèves impulsions de pression négative pour rupture de la membrane cellulaire et obtenir la configuration cellule entière.
Remarque : Une configuration cellule entière est observée lorsqu’il y a une forte augmentation dans les transitoires capacitif montrant la capacitance du neurone. Une légère augmentation de l’exploitation actuelle (de base) sans doute aussi on remarquera. Régler l’amplificateur à l’actuel mode de pince et potentiel de la cellule de -50 à -60 mV.
5. Testez la connectivité synaptique
- Configurer le système d’acquisition (DAQ) de données pour déclencher un pilote de LED pour générer des impulsions de lumière. Ici, un système DAQ de National Instruments est utilisé avec Matlab pour fournir un signal analogique à un conducteur de LED. L’intensité des LED est réglée via le signal analogique pour le conducteur. La LED est 620-630 nm longueur d’onde LED.
- Positionner la haute puissance LED rouge directement sous la préparation. Régler l’intensité lumineuse afin que 0,238 mW/mm2 atteigne la volée.
- Activer les neurones présynaptiques pendant l’enregistrement de la cellule postsynaptique d’intérêt. Atteindre la cellule d’activation optogenetically, pharmacogentically, ou par l’intermédiaire de la stimulation nerveuse. Ici, csChrimson et brèves impulsions de lumière rouge sont appliquées.
NOTE : Les connexions synaptiques peuvent être surveillées en pince ampèremétrique comme EPSPs ou bride de tension comme EPSCs. Une connexion synaptique devrait être visible avant d’appliquer le TTX en réponse à une impulsion lumineuse de 40 ms. Si aucune connexion n’est observée, il est peu probable que les neurones sont synapses connectés soit mono - ou polysynaptically. Le potentiel de maintien peut être ajusté pour mettre l’accent sur des connexions excitatrices ou inhibitrices en conséquence. - Si une connexion est observée dans un soluté physiologique, TTX s’ajoute le système de perfusion pour obtenir une concentration finale de 1 µM. utiliser une pompe de recirculation pour capturer et réutiliser la solution saline pour conserver la TTX. La pompe péristaltique va tirer la solution saline de la baignoire et remettez-le dans le réservoir de solution salin.
- Ajuster la vitesse de la pompe pour fournir un vide constant fort qui ne permet pas à ce niveau de sérum physiologique dans le bain pour montent et descendent.
Remarque : L’application de TTX devrait entraîner la cessation de l’activité dans le neurone qui est surveillé à germes entiers de fortification. Cela confirme qu’assez TTX a été ajouté à la solution saline. - Appliquez de nouveau brèves impulsions de lumière rouge (40 ms pour chaque impulsion). À ce stade, toute connexion synaptique qui reste est probablement monosynaptiques. Ajouter antagonistes pharmacologiques à la saline de recirculation pour tester la nature chimique des connexions synaptiques qui restent dans la TTX.
Remarque : Lors de la combinaison optogenetics et fluorescent ciblant des neurones, il peut être important de ne pas activer constamment la population présynaptique des neurones tout en essayant d’obtenir un enregistrement. Cela peut conduire à la dépression synaptique et il est difficile de voir les connexions. Parce que csChrimson a une bande longue excitation qui s’étend largement dans la gamme de protéine fluorescente verte, un fluorophore rouge peut être utilisé pour visualiser les neurones et channel2rhodopsin (Ch2R) peut être utilisé pour exciter les populations cellulaires. Cela requiert génétique spécifique et un cube de filtre personnalisé. Pour générer des mouches appropriés, faire des mouches qui expriment le fluorophore rouge (DP ou mCherry) sous les systèmes d’expression binaire système LexA ou Q. Ceux-ci devront être croisé avec mouches exprimant un promoteur Gal4 et gènes effecteurs SAMU-Ch2R et SAMU-NaChBac. Le cube filtre optimal pour épifluorescence aura une gamme étroite d’excitation pour exciter le fluorophore rouge, mais pas exciter la Ch2R. en outre, l’ensemble du filtre devrait inclure un filtre d’émission longue passe pour collecter autant de lumière émise. Nous avons utilisé un filtre personnalisé de chrominance qui comprenait la partie numéros et580/25 x et t600lpxr (à partir de l’ensemble 49306), mais avec un filtre d’émission/barrière d’et610lp.
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Representative Results
TERPS sert à distinguer les mono - et polysynaptiques contributions dans les connexions synaptiques entre les neurones. Alors que la stimulation faible d’une cellule peut être utilisée pour tester les connexions directes, une plus grande activité présynaptique de conduite souvent recrute polysynaptiques connexions (Figure 1 a). TERPS travaille en exprimant conjointement canal sodique insensibles à la TTX NaChBac et un activateur d’optogenetic et en testant les connexions en présence de TTX d’éliminer polysynaptiques connexions (Figure 1 b). TTX bloque efficacement les potentiels d’action dans le cerveau de la drosophile , ce qui en fait une préparation convenable pour TERPS (Figure 2 a). Une expression transgénique du canal sodique NaChBac sauve excitabilité dans les neurones et les résultats dans un potentiel grand plateau (Figure 2 b).
Interneurones les (LN) du lobe antennaire réagir de manière robuste à la stimulation olfactive (Figure 3 a). Cependant, parce que les PPSE individuels n’est pas facilement résolus à la soma de LN, on ignore si de telles réactions découlent directement de l’entrée de neurones récepteurs olfactifs (ORN) ou indirectement d’entrée par l’intermédiaire de neurones de projection (PN) (Figure 3 b). En utilisant le TERPS, Orn montré ici, font en effet des connexions synaptiques directes avec LNs (Figure 3).
Une caractéristique unique du TERPS est sa capacité de résoudre précisément transmission synaptique extra volume pouvant survenir avec GABA ou neuromodulateurs tels que la sérotonine. La stimulation d’un neurone sérotoninergique (le RPSC) dans le lobe antennaire de drosophile se traduit par un mélange d’excitation et d’inhibition dans un interneurone local (Figure 4 a et 4 b de la Figure). L’excitation est médité par l’acétylcholine, un transmetteur excitateur et l’inhibition est due à la sérotonine (Figure 4 et Figure 4). TERPS peut servir à déterminer si les connexions sont monosynaptiques en éliminant polysynaptiques connexions (Figure 4E). Dans TTX, on observe toujours une forte inhibition dans le LN, suggérant qu'il arrive de directement à partir de l’activation d’un neurone sérotoninergique spécifique (Figure 4F et Figure 4). Cette connexion est bloquée par le méthysergide antagoniste de la sérotonine. La synapse excitatrice, médiée par l’acétylcholine a été éliminée en TTX, suggérant que de sources polysynaptiques, il se pose.
Figure 1 : TERPS élimine les connexions polysynaptiques et isole les entrées monosynaptiques. (A). un diagramme schématique montrant qu’augmenter l’activité présynaptique peut recruter connexions polysynaptiques. (B). un schéma illustrant comment les TERPS pouvez supprimer polysynaptiques contributions en utilisant TTX pour éliminer l’activité de fortification dans les neurones. Excitabilité revient exclusivement dans une population de neurones qui peuvent ensuite être excité optogenetically. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : NaChBac rétablit l’excitabilité neuronale dans Drosophila neurones. (A) l’application de 1 µm que TTX abolit de fortification dans les neurones de la drosophile . Activité spontanée et l’inhibition induite sur les odeurs sont éliminés TTX. (B) NaChBac et csChrimson sont exprimées dans le RPSC et le cerveau est exposé à la TTX. csChrimson stimulation dépolarise le RPSC et après un seuil est franchi, il y a gros a augmenté la tension de membrane RPSC non linéaire. Cette dépolarisation rapide constitue un potentiel de semblables à des plateaux (en médaillon). Chaque couleur dans l’ensemble des intensités de simulation correspond à la même couleur dans le médaillon de tension. Ce chiffre a été modifié par Zhang et 2016 Gaudry9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : TERPS révèle les connexions monosynaptiques entre Orn et LNs. (A) A enregistrement de l’échantillon montrant une réponse d’odeur dans un LN. Cette réponse peut être mono - ou polysynaptiques dans la nature. (B) TERPS peuvent être testés à l’ORN à synapse LN. TTX est utilisé pour bloquer les potentiels d’action et d’excitabilité dans toutes les cellules dans la préparation. Excitabilité revient exclusivement à l’Orn via le canal de sodium NaChBac. L’Orn peut ensuite être excités avec channelrhodopsin pour obtenir la libération synaptique. Événements synaptiques sont mesurés en post-synaptically en utilisant des enregistrements de cellules entières. (C) TERPS révèle que l’ORN à synapse LN est monosynaptique. TERPS peut également être associé en pharmacologie pour montrer que la synapse est cholinergique et bloqués par le récepteur nicotinique antagoniste mécamylamine (200 µM). La barre grise verticale indique le moment de stimulation ORN. Ce chiffre a été modifié par Zhang et Gaudry en 20169. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : TERPS est sensible à la libération de transmission en masse ou le volume des neurones modulateurs. (A) la stimulation du RPSC provoque un potentiel d’action d’une LN enregistré dans le lobe antennaire de drosophile . (B) The LN est hyperpolarisé afin que RPSC stimulation entraîne une activité subthreshold. La réponse de LN se compose d’une dépolarisation rapide suivie d’une hyperpolarisation plus lente. La barre grise désigne le temps de stimulation RPSC. Méthysergide (50 µM), un antagoniste des récepteurs 5-HT large, bloque l’hyperpolarisation lente mais n’a aucun effet sur la dépolarisation. Mécamylamine bloque la dépolarisation rapide, ce qui suggère qu’il est cholinergique dans la nature. (C) TERPS peut être utilisée pour résoudre quels composants chimiques de la RPSC à synapse LN sont mono-versus polysynaptiques. (D) The RPSC est stimulée en présence de TTX et postsynaptiques LN réactions sont mesurées dans des enregistrements de cellules entières. L’hyperpolarisation persiste à TTX suggérant que c’est monosynaptique dans la nature. Cette hyperpolarisation est également bloquée par le méthysergide, compatible avec la transmission sérotoninergique. La dépolarisation brève qui reste dans le TTX est probablement véhiculée par écart électrique couplage, telle qu’elle a ne pas bloqués par des antagonistes nicotiniques. Ce chiffre a été modifié par Zhang et Gaudry en 20169. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : feuille de Drosophila. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : physiologie chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Analyse de la TERPS complimente les techniques actuelles utilisées pour circuit fissuration en permettant la détection des synapses entre les neurones. Plus précisément, l’approche indique monosynaptiques connexions par largement faire taire les potentiels d’action avec TTX tout en rétablissant l’excitabilité dans une population de sélectionner des neurones avec canal sodique insensibles à la TTX NaChBac. Libération synaptique est induite par la stimulation de l’optogenetic, tandis que les événements postsynaptiques sont surveillés avec des enregistrements de cellules entières. TERPS se distingue d’autres approches telles que la portée en étant sensible en vrac ou transmission volume obtenue à des distances plus longues et la possibilité d’effectuer des manipulations pharmacologiques. La technique est relativement simple à utiliser et nécessite qu’un seul enregistrement électrode et une source de lumière pour la stimulation d’optogenetic, qui n’est plus faisable qu’obtention d’enregistrements de germes entiers doubles sur les parties de la synapse préalables- et post-synaptiques. Une exigence fondamentale de la TERPS, c’est que les potentiels d’action sont facilement bloqués par TTX dans le système à l’étude. Mais, étant donné que TTX agit sur les neurones dans un large éventail de phyla taxonomique, il est probable que TERPS pourrait s’appliquer largement aux deux systèmes de modèle chez les mammifères et les invertébrés.
TERPS sont facilement modifiables dans un certain nombre de manières de faciliter soit la stimulation de la population présynaptique putative ou pour l’enregistrement de cibles postsynaptiques. Ici, un outil d’optogenetic a été utilisé pour stimuler les populations cibles, si l’activation par une variété de mécanismes est possible. La stimulation nerveuse des axones sensoriels, par exemple, est courante dans les études de transmission des nerfs antennaires dans drosophile16 et convient dans d’autres systèmes sensoriels, y compris les nerfs périphériques contenant des neurones mécanosensoriels. Une approche similaire au test de la connectivité fonctionnelle chez la drosophile ont exprimé GCaMP indicateurs de calcium dans une population de neurones en conduisant l’activité dans une autre population via l’ionotropiques purinocepteur P2X2 et ATP application2. Cette approche devrait être compatible avec la TERPS en simplement co exprimant le transgène de NaChBac avec le récepteur P2X2 dans un neurone et GCaMP dans une autre population pour une méthode complètement sans timbre. Toutefois, prudence doit être prise avec approches causant des dépolarisations plus lentes, tels que les récepteurs concepteur muscariniques axée exclusivement activés par une drogue (DREADDs)17,18. Dépolarisation lente pourrait conduire à l’inactivation de NaChBac avant la génération de potentiels d’action.
Des méthodes similaires à TERPS ont été employées dans les systèmes mammaliens. Ces techniques combinent TTX et channelrhodopsin à cartographier la connectivité entre les neurones. Activation de Channelrhodopsin seule généralement ne pas dépolariser neurones suffisamment, et donc le bloqueur du canal potassium 4-AP est être appliquées avec TTX pour obtenir la libération19,20,21. Bien que cela fonctionne aux nombreuses synapses, il peut ne pas fonctionner à certaines synapses métabotropique si la cible en aval du récepteur est un canal potassique sensible 4-AP. Par exemple, modulation sérotoninergique de réponse olfactif chez les papillons nocturnes s’appuie directement sur la modulation de ces un 4-AP sensible K+ courant (Ibis)22. Cette approche ne fonctionnait pas aussi au RPSC à synapse LN (données non présentées). Ainsi, les TERPS a un avantage d’exiger moins d’intervention pharmacologique par rapport aux autres méthodes couramment utilisées et peut fonctionner au plus large éventail ou synapses.
Il y a quelques limitations à TERPS qui devraient être considérés. Tout d’abord, il peut y avoir des effets secondaires potentiels d’expression chronique du canal NaChBac au cours du développement. Fonction et assemblage de circuits appropriés peuvent être confirmées en comparant l’activité des neurones entre contrôle mouches manque la construction NaChBac et vole avec la construction en l’absence de TTX. Pour éviter de tels problèmes, expression du transgène NaChBac pourrait être contrôlée dans le temps par l’expression du répresseur de GAL4 thermosensibles, GAL8023. En outre, si une synapse est observée uniquement en fonction de l’État, il est concevable que réprimer l’activité de réseau avec TTX pourrait cacher une telle connexion. Il est important de souligner qu’une connexion positive observée avec TERPS probable représente une connexion de mono-synaptique vraie, alors qu’un résultat négatif n’est pas une preuve de l’absence d’une connexion.
Alors que le TERPS peut révéler la capacité de l’émetteur de sortie d’un neurone d’affecter postsynaptique partenaire de toute évidence, la dynamique de la voie lente de NaChBac et les potentiels en plateau associés à son activation le rendent moins applicables à l’étude des classiques neurotransmission. Une approche pour modifier TERPS pour les plus rapides, plus naturel émetteur publication sera d’exprimer une version modifiée d’insensibles à la TTX de l’endogène Drosophila sodium canal para par opposition à NaChBac. Cette modification entraînerait naturaliste activité de fortification dans la cellule présynaptique et permettre une analyse plus traditionnelle de la transmission synaptique en l’absence d’activité réseau. Cela aurait de grandes possibilités pour l’étude des synapses de codage, à laquelle suscitant un large éventail d’activité présynaptique sans recrutement réseaux polysynaptiques serait souhaitable.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Joshua Singer, Jonathan Schenk, ainsi que réfléchies évaluateurs pour commentaires sur le manuscrit. Nous tenons également à remercier Ben White et Harold Zakon pour des discussions sur la technique. Jonathan Schenk a fourni les données de la Figure 3 a. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de Whitehall et une R21 NIH au QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
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