Summary
هذه المقالة ميزات أسلوب اختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية باستخدام تيدرودوتاكسين والقناة تيدرودوتاكسين-مقاومة الصوديوم، ناتشباك.
Abstract
هنا، يتم تطبيق تقنية جديدة تسمى "المقاومة تيتروتوكسين" (ت) إجراء هندسة عكسية ل Synapses السبر (تيربس) لاختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية المستهدفة. يعتمد الأسلوب على التعبير المشارك من المنشط المحورة وراثيا مع قناة الصوديوم تيدرودوتاكسين المقاوم، ناتشباك، في خلية presynaptic محددة. اتصالات مع الشركاء بعد متشابك المفترضة التي تحددها تسجيلات كامل الخلية حضور ت، الذي يمنع النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية التي لا تعبر عن ناتشباك. يمكن تعديل هذا النهج للعمل مع أي منشط أو تصوير الكالسيوم كمراسل للاتصالات. ويضيف تيربس إلى مجموعة متنامية من الأدوات المتاحة لتحديد الاتصال داخل الشبكات. ومع ذلك، تيربس فريدة من نوعها في ذلك تقارير موثوق بها أيضا السائبة أو نقل وحدة التخزين ونقل الفائض.
Introduction
هدفا رئيسيا لعلم الأعصاب خريطة الاتصالات بين الخلايا العصبية لفهم كيفية تدفق المعلومات من خلال الدوائر. أصبحت العديد من النهج والموارد المتاحة لاختبار اتصال وظيفية بين الخلايا العصبية في مجموعة من الأنظمة النموذجية1،2. لإنشاء الرسوم البيانية الأسلاك الأكثر دقة باستخدام الكهربية، من المهم حل سواء كانت اتصالات الملحوظ بين خليتين مونوسينابتيك مقابل بوليسينابتيك وغير المباشرة وغير المباشرة. معيار الذهب لجعل هذا التمييز في الثدييات من الخلايا العصبية لقياس زمن الوصول بين action potentials واحد في الخلايا presynaptic وظهور التيارات بوستسينابتيك ضادات (ابسكس) في الخلايا العصبية الثانية. يجب أن يكون اتصالات مونوسينابتيك الاختفاء قصيرة بضع ميلي ثانية وتقلب منخفضة3. هذا النهج يمكن أن يكون معقداً في اللافقاريات الخلايا العصبية لأنه قد تحدث الاشتباكات العصبية في dendrites بهم بعيداً عن الموقع تسجيل جسدية، مما يؤدي إلى تأخير في الكشف عن سبب مسافات طويلة اليكتروتونيك بين كوندوكتانسيس بوستسينابتيك والتسجيل قطب كهربائي. يمكن إدخال هذه التأخيرات الغموض فيما يتعلق ببولي-مقابل الاشتراكات مونوسينابتيك. بالإضافة إلى ذلك، الأحداث متشابك الصغيرة قد تسوس قبل الوصول إلى الموقع تسجيلات جسدية، وقيادة النشاط presynaptic أقوى، من المرجح أن تجنيد الأحداث بوليسينابتيك.
وقد وضعت تقنيات مختلفة لاختبار اتصالات مونوسينابتيك في اللافقاريات. نهج واحد يستخدم الأيونات الموجبة divalent عالية الحلول (مرحبا دي) التي تحتوي على فائض ملغ++ وكاليفورنيا++. يمنع هذا الحل الاتصالات بوليسينابتيك باحتمال الإفراج عن الحد وزيادة إمكانات العمل عتبة لصالح كشف الإدخال مونوسينابتيك4،5. تحديد نسبة دقة ملغ++ بكاليفورنيا++ المطلوبة، ومع ذلك، ليست تافهة، وقد تستمر الاشتراكات بوليسينابتيك لتحفيز متواضعة حتى6. نهج بديل يسمى "إعادة تشكيل" التجارة والنقل عبر الشركاء متشابك (فهم) يستفيد من القرب بين الأغشية قبل وبوستسينابتيك عثر عليها في نهايات للاستدلال اتصال مونوسينابتيك 7. هنا، وأعرب عن مكون البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في إحدى الخلايا العصبية، ويعبر عن جزء مكمل للجزيء بشريك بوستسينابتيك المفترضة. وجود الأسفار يشير إلى أن الخلايا العصبية اثنين في قرب قريبة ما يكفي للسماح بإعادة تشكيل جزيء بروتينات فلورية خضراء وينطوي على وجود المشبك. فهم يمكن تقرير نهايات زورا، رغم ذلك، إذا خليتين عن كثب قد الرئيسي يعارضها الأغشية، كما هو الحال في أحد الأعصاب أو كراسة. المتغيرات لفهم القضاء على هذه المغلوطة بالربط الجزء بريسينابتيك من التجارة والنقل مباشرة إلى سينابتوبريفين، مما يتيح إعادة تشكيل فقط في نهايات نشط8. في حين قد ساعدت في تحديد الربط الوظيفي في المورفولوجية CNS فهم وعن المتغيرات، بعض قد لا إجراء اتصالات مرئية بفهم إذا كانت المسافات بين الشركاء قبل وبوستسينابتيك كبيرة نسبيا. وهذا ذات الصلة لا سيما في تقييم نقل وحدة التخزين المرتبطة نيورومودوليشن9 أو تثبيط جابايرجيك10.
هنا، هو أظهر تقنية تكميلية ورواية لاختبار اتصالات مونوسينابتيك مباشرة في المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي. يعمل هذا الأسلوب، تسمى "المقاومة تيدرودوتاكسين إجراء هندسة عكسية" لسبر سينابسيس (تيربس)، حسب تعبير المشاركين عن تيدرودوتاكسين (ت)-قناة مقاومة الصوديوم، ناتشباك، ومنشط أوبتوجينيتيك في خلية presynaptic أثناء التسجيل من المفترضة الشركاء بوستسينابتيك9. حضور ت، يتم منع جميع إمكانات العمل بوساطة النشاط في الخلايا غير تلك التي تعرب عن ناتشباك. قناة ناتشباك بشكل انتقائي يعيد استثارة في الخلايا المستهدفة presynaptic، تسمح بانتقال متشابك أثارت الضوء. هذا الأسلوب يسمح التنشيط قوية من الخلايا العصبية presynaptic، مثل أن اتصالات يمكن أن تحلها بوستسينابتيكالي تسجيل جسدية مع الحد من احتمال توظيف الدوائر بوليسينابتيك. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يسمح بدراسة حجم الإرسال ويكشف عن انتشار الإرسال صدر من خلية واحدة في جميع أنحاء دائرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكشف عن تيربس الطبيعة الكيميائية للاتصال من خلال الأدوية التقليدية. تيربس غير مناسبة للاستخدام في أي نموذج النظام يتيح التعبير المحورة وراثيا من قنوات الصوديوم ت غير متحسسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الذباب والمروج GAL4 تحديد خطوط
- حدد خط مروج GAL4 وعبوره مع الذباب يحمل التحوير UAS-ناتشباك والتحوير أوبتوجينيتيك للتنشيط.
ملاحظة: يتم تحديد UAS-كشريمسون11 بسبب الموصلية عالية، والسهولة التي ينشط ناتشباك بوساطة إمكانات العمل. تتوفر UAS-ناتشباك وكشريمسون UAS من "مستودع مخزون بلومينغتون". - إعداد الشبكية عبر كل كحل أسهم في الإيثانول (35 ملم)، وتخزين الحل في الثلاجة عند-20 درجة مئوية.
- ميليلتر 28 مزيج من هذا المخزون إلى حوالي 5 مل من امهاء البطاطا تقشر الغذاء وأضف هذا الخليط إلى الجزء العلوي من قنينة متوسطة المورفولوجية التقليدية.
- رفع الذباب الكبار إذ تعرب عن كشريمسون على الأغذية التي تحتوي على 0.2 مم كل-ترانس-الشبكية لمدة 1 – 3 أيام11.
2-إعداد الأوراق المالية ت
- إنشاء حل أسهم 1 مم تتكس في الماء المقطر أو منزوع. تخزين هذا الحل في ثلاجة مختبر لعدة أشهر. تدقيق سياسات المؤسسات فيما يتعلق بتخزين ت تصنيف العديد من المؤسسات ت كمادة خطرة أو السيطرة عليها.
3-إعداد الذباب للكهربية
- جمع يوم 1 – 3 الذباب الكبار القديمة التي تثار على الطعام مع كل-ترانس-الشبكية.
ملاحظة: تشير إلى مورثي وتيرنر في عام 2013 لوصف مفصل للتصحيح لقط المورفولوجية الخلايا العصبية،من1213. - وضع الذباب في قنينة زجاج التﻷلؤ. مكان القنينة على الجليد لمدة 1 دقيقة شل الذباب.
- استخدام الملقط الخشنة لإدراج يطير إلى دائرة تسجيل مصنوعة خصيصا. وتتكون الغرفة 3 ½ "دائرة ليزر قطع من اﻷكريليك 1/16". قص حفرة ¾ "داخل المركز حيث تم إرفاق إحباط مخصصة مع الإيبوكسي الجزء 2. إحباط يحتوي على الثلاثي على شكل الأمل في أن يتم إدراج الطاير.
- تطبيق الشمع أو الإيبوكسي الأشعة فوق البنفسجية الشفاء حول الحيوان لضمان الحصول عليها بشدة داخل قاعة تسجيل.
- إلقاء الضوء على الإعداد مع ألياف ضوئية gooseneck للتصور تحت ستيريوميكروسكوبي. مجموعة ألياف gooseneck لإنارة منحرف بضبط لهم ذلك لإلقاء الضوء على الطاير مباشرة من الجانب.
- ضبط مستوى الضوء إلى أدنى الإعداد الممكنة التي ما زال يسمح التصور الواضح ذبابة. سوف تختلف هذه الكثافة الخفيفة عبر التجارب الفردية.
ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول باستخدام في الدماغ الموقع explant الأسلوب14. - استرداد التسجيل الخارجي المالحة. يحتوي على المياه المالحة في مم: 103 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل و 5 حامض الميثيل-2-أمينوثاني-سولفونيك ن-تريس (هيدروكسيميثيل)، تريهالوسي 8، الجلوكوز 10, 26 ناكو3، 1 نة2بو4، 1.5 كاكل2و 4 مجكل2 (المعدل إلى mΩ 270-275). هو bubbled المحلول الملحي مع 95% O2%5 CO2 (كاربوجين) وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 7.315.
- ضع 4-6 قطرات من المحلول الملحي التسجيل خارج الخلية على إعداد الذبابة. عند هذه النقطة، زيادة مستوى الضوء في مجهر تشريح لرؤية أفضل.
- شحذ سلك تنغستن استخدام التحليل الكهربائي. جعل الأسلاك، تعد حلاً مشبعة كنو3 وتطبيق ما يقارب 20 "الخامس للتيار المتردد" الحالي حين غمس غيض الأسلاك في حل 20 مرة لكل 100 مللي ثانية حتى يتم شحذ التلميح. استخدام سلك التنغستن شحذ لإزالة بشرة على رأسه الطاير ومما يعرض في الدماغ.
- كذلك كشف الدماغ بإزالة القصبة الهوائية والهيئات الدهون التي تحيط بها. إذا كان الوصول إلى الفصوص باللوامس، استخدام سلك التنغستن بنت أو أداة مماثلة لشد بلطف هوائيات تحت إحباط تسجيل الدائرة زيادة وضوح الرؤية. استخدام الملقط حادة للدموع بلطف بعيداً اﻷغماد الدبقية تغطي مجال الاهتمام حيث سيجري إعداد تسجيلات.
- نقل غرفة تسجيل لتلاعب الكهربية. فورا bubbled نضح ابدأ مع تسجيل خارجي المحلول الملحي مع كاربوجين للحفاظ على الدماغ. ويوضع فوق المرحلة مجهر خزان المحلول الملحي وهو الجاذبية للإعداد. استخدام خط فراغ وقارورة Erlenmeyer ل 2 لجمع المياه المالحة النفايات.
4-الحصول على تسجيل كامل الخلية
- سحب الماصات التصحيح ساحبة ماصة تجارية. راجع الدليل لإعدادات لتحقيق ماصة مناسبة مع مقاومة نصيحة قرب 7 mΩ.
- إضافة 4 ميليلتر من تسجيل الداخلية حل إلى ماصة تصحيح. المياه المالحة الداخلية يتكون من 140 البوتاسيوم اسبارتاتي وحبيس 10، مجاتب 4، 0.5 غ3أنشئ، عطا 1 و 1 بوكل في مم.
- إعداد تصحيح المشبك مكبر للصوت لتسجيل كامل الخلية. صفر الإزاحة في مكبر للصوت ومكبر للصوت توصيل نبضات الاختبار. وهنا، يستخدم صباحا نظم تصحيح المشبك مكبر للصوت 2,400.
- تطبيق الضغط الإيجابي من خلال ماصة والاقتراب من الخلية. استخدام ميكرومانيبولاتور للمباشرة الماصة، والاتصال بالخلية. الإفراج عن الضغط الإيجابي. مجموعة القدرة القابضة للغشاء إلى-60 أم. وينبغي أن تشكل ماصة ختم جيجاوهم مع غشاء الخلية كما يدل على ذلك انخفاض sub-بيكوامب عقد الحالية.
ملاحظة: إذا استخدام بروتينات فلورية خضراء تسترشد استهداف الخلية، في محاولة للتقليل من استخدام الضوء ابيفلوريسسينت لمنع التنشيط ChR2 والاكتئاب متشابك المحتملة. أيضا الانتظار لبضع دقائق قبل تطبيق الخطوة 5. - تعيين مكبر للصوت توصيل نبضات الاختبار من-50 أم إلى-60 أم. هذا الإعداد المعيار على التصحيح-المشبك مكبرات الصوت. وستكشف البقول اختبار عابرة capacitative كبيرة تمثل الحالية اللازمة لشحن ماصة التصحيح. إزالة capacitative العابرين بضبط المقابض تعويضاً قدرة على الساعة 2400 أو مماثلة مكبر للصوت.
- تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي تمزق غشاء الخلية والحصول على تكوين كامل الخلية.
ملاحظة: تكوين خلية كاملة من الملاحظ عندما تكون هناك زيادة كبيرة في العابرين capacitative عرض السعة للخلايا العصبية. المرجح أن يلاحظ أيضا زيادة صغيرة في عقد الحالية (خط الأساس). تعيين مكبر للصوت لوضع المشبك الحالي وضبط يمكن للخلية أن من-50 إلى-60 أم.
5-اختبار اتصال متشابك
- تكوين نظام حيازة (دق) البيانات لتشغيل برنامج تشغيل الصمام لتوليد نبضات الضوء. هنا، يتم استخدام نظام "دق الصكوك الوطنية" مع مطلب لتوصيل إشارة تمثيلية إلى برنامج تشغيل الصمام. يتم ضبط كثافة الصمام عن طريق الإشارات التناظرية إلى برنامج التشغيل. الصمام 620 630 الطول موجي نانومتر الصمام.
- ضع LED الحمراء رفيع المستوى مباشرة تحت التحضير. ضبط شدة الضوء بحيث تصل إلى 0.238 ميغاواط/مم2 الطاير.
- تنشيط الخلايا العصبية presynaptic أثناء التسجيل من الخلية بوستسينابتيك للفائدة. تحقيق خلية التنشيط أوبتوجينيتيكالي، فارماكوجينتيكالي، أو عن طريق تحفيز الأعصاب. وهنا، يتم تطبيق كشريمسون ونبضات قصيرة من الضوء الأحمر.
ملاحظة: يمكن رصد اتصالات متشابك في المشبك الحالية ابسبس أو المشبك الجهد ابسكس. ينبغي أن يكون اتصال متشابك مرئية قبل تطبيق ت ردا على 40 نبضة خفيفة. إذا لوحظ أي اتصال، فإنه من غير المحتمل أن الخلايا العصبية سينابتيكالي متصلة أما مونو-أو بوليسينابتيكالي. يمكن تعديل عقد محتمل للتأكيد على اتصالات ضادات أو المثبطة تبعاً لذلك. - إذا كان اتصال من الملاحظ في المحلول الملحي العادي، أضف ت إلى نظام التروية لتحقيق تركيز نهائي من 1 ميكرومتر. استخدام مضخة تعمل لالتقاط وإعادة استخدام المياه المالحة للمحافظة على ت. مضخة تمعجية سيتم استخلاص المحلول الملحي من الحمام وإعادته إلى الخزان المالحة.
- ضبط سرعة المضخة توفير فراغ ثابتة قوية تسمح بأن مستوى الملوحة في الحمام صعود وهبوط.
ملاحظة: ينبغي أن يؤدي تطبيق ت وقف النتوءات النشاط في الخلايا العصبية التي تتم مراقبته في كل خلية. وهذا يؤكد أن ما يكفي ت المضاف إلى المياه المالحة. - تطبيق نبضات قصيرة من الضوء الأحمر (40 مللي ثانية لكل نبضة) مرة أخرى. ومن المرجح في هذه المرحلة، أي اتصال متشابك الذي ما زال مونوسينابتيك. إضافة الخصوم الدوائية لتدوير المياه المالحة لاختبار الطبيعة الكيميائية اتصالات متشابك التي تظل في تتكس.
ملاحظة: عند الجمع بين أوبتوجينيتيكس ونيون استهداف الخلايا العصبية، قد يكون من المهم عدم استمرار تفعيل السكان بريسينابتيك من الخلايا العصبية أثناء محاولة الحصول على تسجيل. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الاكتئاب متشابك، ويجعل من الصعب على راجع اتصالات. بسبب كشريمسون عصابة إثارة طويل الذي يمتد على نطاق واسع في مجموعة البروتينات الفلورية الخضراء، فلوروفوري أحمر يمكن استخدامها لتمثيل الخلايا العصبية و channel2rhodopsin (Ch2R) يمكن استخدامها لإثارة السكان الخلية. ويتطلب القيام بذلك علم الوراثة محددة ومكعب عامل تصفية مخصص. لتوليد الذباب مناسبة، تجعل الذباب التي تعبر عن فلوروفوري الأحمر (طلب تقديم العروض أو مشري) تحت نظم التعبير الثنائي نظام ليزا أو Q. وهذه ستحتاج إلى تكون متقاطعة مع الذباب معربا عن مروج Gal4 وجينات المستجيب UAS-Ch2R وناتشباك UAS. سوف المكعب المرشح الأمثل ابيفلوريسسينسي مجموعة إثارة ضيقة تثير fluorophore أحمر، ولكن لا تثير Ch2R. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تشمل تعيين عامل التصفية عامل تصفية انبعاثات تمريره طويلة لجمع الكثير من الضوء المنبعثة. قمنا باستخدام عامل تصفية مخصص من صفاء التي شملت جزء أرقام et580/25 x و t600lpxr (من مجموعة 49306)، ولكن مع عامل تصفية حاجز/انبعاثات et610lp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تيربس يستخدم للتمييز بين مونو والاشتراكات بوليسينابتيك في متشابك الاتصالات بين الخلايا العصبية. بينما يمكن استخدام التحفيز ضعيفة خلية لاختبار اتصالات مباشرة، يقود أكبر نشاط presynaptic غالباً المجندين اتصالات بوليسينابتيك (الشكل 1A). تيربس يعمل من خلال المشترك معربا عن قناة الصوديوم غير متحسسة ت ناتشباك ومنشط أوبتوجينيتيك، واختبار اتصالات حضور ت للقضاء على بوليسينابتيك اتصالات (الشكل 1B). فعالية كتل ت إمكانات العمل في الدماغ المورفولوجية ، يجعلها إعداد مناسبة تيربس (الشكل 2A). التعبير المحورة وراثيا من قناة الصوديوم ناتشباك ينقذ استثارة في الخلايا العصبية، والنتائج في هضبة كبيرة محتملة (الشكل 2).
إينتيرنيورونس المحلي (LN) في الفص باللوامس تظهر استجابات قوية لتحفيز حاسة الشم (الشكل 3A). ومع ذلك، لأن ابسبس الفردية لا يسهل حلها في سوما LN، يظل من غير الواضح إذا كانت هذه الردود تنشأ مباشرة من مستقبلات الشم العصبية الإدخال (اورن) أو الإدخال غير مباشر عن طريق إسقاط الخلايا العصبية (PN) (الشكل 3B). باستخدام تيربس، أورنس هو موضح هنا، بل على إجراء اتصالات متشابك مباشرة مع لنس (الشكل 3).
ميزة فريدة من نوعها من تيربس هو قدرته على حل انتقال متشابك خارج وحدة التخزين التي قد تحدث مع GABA أو نيورومودولاتورس مثل السيروتونين على وجه التحديد. نتائج التحفيز لخلية هرمون السيروتونين (CSDn) في الفص باللوامس المورفولوجية في مزيج من الإثارة وتثبيط في إينتيرنيورون محلية (الشكل 4A و 4B الشكل). الإثارة هو التأمل أستيل الإرسال عليه وهو سبب التثبيط السيروتونين (الشكل 4 و الشكل 4). يمكن استخدام تيربس لتحديد ما إذا كانت الاتصالات مونوسينابتيك بإزالة اتصالات بوليسينابتيك (4E الشكل). في ت، يحتفل تثبيط قوية لا تزال في قانون الجنسية، مما يوحي بأن يصل من مباشرة من تنشيط خلية هرمون السيروتونين محددة (4F الشكل و الشكل 4). منع هذا الاتصال بواسطة methysergide مضاد السيروتونين. وكان القضاء المشبك ضادات توسط أستيل في ت، مما يوحي بأنها نشأت من مصادر بوليسينابتيك.
الشكل 1 : تيربس ويزيل اتصالات بوليسينابتيك ويعزل المدخلات مونوسينابتيك. (أ)-رسم تخطيطي تظهر أن زيادة النشاط presynaptic ويمكن توظيف اتصالات بوليسينابتيك. (ب)-رسم تخطيطي يوضح كيفية إزالة تيربس بوليسينابتيك الاشتراكات باستخدام ت للقضاء على نشاط التشويك في الخلايا العصبية. يتم استعادة استثارة حصرا في السكان واحدة من الخلايا العصبية التي يمكن ثم أوبتوجينيتيكالي متحمس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : ناتشباك يعيد استثارة الخلايا العصبية في المورفولوجية الخلايا العصبية. (أ) تطبيق 1 ميكرومتر ت يلغي النتوءات في الخلايا العصبية المورفولوجية . يتم القضاء على النشاط العفوي وتثبيط أثارت رائحة في ت. يتم التعبير عن ناتشباك (ب) وكشريمسون في CSDn ويتعرض الدماغ ت. التحفيز كشريمسون ديبولاريزيس CSDn وبعد عبور عتبة، هناك كبيرة غير الخطية زيادة في الجهد غشاء CSDn. ويشكل هذا depolarization السريع محتملة مثل هضبة (داخلي). كل لون عبر كثافات محاكاة يناظر بنفس اللون في تدرج الجهد. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ و 2016 غودري9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تيربس ويكشف اتصالات مونوسينابتيك بين أورنس ولنس- (أ) ألف عينة تسجيل عرض استجابة رائحة في LN. قد تكون هذه الاستجابة مونو-أو بوليسينابتيك في الطبيعة. ويمكن اختبار تيربس (ب) في اورن إلى المشبك LN. ويستخدم لعرقلة إمكانات العمل واستثارة في كافة الخلايا في الإعداد ت. يتم استعادة استثارة حصرا في أورنس عبر قناة الصوديوم ناتشباك. ثم يمكن أن يكون متحمس في أورنس مع تشانيلرهودوبسين للحصول على إطلاق سراح متشابك. وتقاس أحداث متشابك بوستسينابتيكالي باستخدام تسجيلات كامل الخلية. تيربس (ج) يكشف عن أن اورن إلى المشبك LN مونوسينابتيك. يمكن أيضا الجمع بين تيربس مع علم الصيدلة لإظهار أن المشبك اتروبين وسدت طريق ميكاميلاميني خصم مستقبلات النيكوتين (200 ميكرومتر). شريط رمادي الرأسي يشير إلى توقيت اورن التحفيز. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ وغودري في عام 20169. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تيربس حساس للإفراج عن انتقال وحدة التخزين أو الجزء الأكبر من الخلايا العصبية مودولاتوري. (أ) الحث على نتائج CSDn في بإمكانيات العمل من LN مسجل في الفص باللوامس المورفولوجية . (ب) "قانون الجنسية" هو هايبربولاريزيد حيث أن التحفيز CSDn النتائج في نشاط سوبثريشولد على. رد LN يتكون من depolarization سريعة متبوعاً فرط الاستقطاب أبطأ. الشريط الرمادي يدل على وقت التحفيز CSDn. ميثيسيرجيدي (50 ميكرومتر)، خصم مستقبلات 5-HT واسعة، كتل فرط الاستقطاب بطيئة ولكن ليس له تأثير على ديبولاريزيشن. ميكاميلاميني كتل depolarization سريعة مما يوحي بأنها ذات طابع اتروبين. يمكن استخدام تيربس (ج) حل هي مكونات كيميائية CSDn إلى المشبك LN مونو-مقابل بوليسينابتيك. (د) CSDn هو حفز حضور ت وبوستسينابتيك LN الاستجابات وتقاس في تسجيلات كامل الخلية. فرط الاستقطاب استمرت في ت مما يوحي بأنها مونوسينابتيك في الطبيعة. هذا فرط الاستقطاب أيضا سدت methysergide، تمشيا مع انتقال هرمون السيروتونين. Depolarization الموجزة التي لا تزال في ت المرجح أن توسط الفجوة الكهربائية اقتران، كما أنها لا سدت الخصوم النيكوتين. لقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغ وغودري في عام 20169. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الملف التكميلي 1: إحباط المورفولوجية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: دائرة الفيزيولوجيا. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل تيربس تكمل التقنيات الحالية المستخدمة لحلبة تكسير بتمكين الكشف عن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية التي تم تحديدها. على وجه التحديد، النهج الذي يكشف عن اتصالات مونوسينابتيك بإسكات إمكانات العمل مع تتكس على نطاق واسع أثناء استعادة استثارة في عدد سكان تحديد الخلايا العصبية مع قناة الصوديوم تتكس غير متحسسة ناتشباك. هو أثارت متشابك الإفراج عن طريق التحفيز أوبتوجينيتيك بينما يتم رصد الأحداث بوستسينابتيك مع تسجيلات كامل الخلية. تيربس يميز نفسه من النهج الأخرى مثل الإلمام بالحساسية بالجملة أو انتقال حجم أثارت في مسافات أطول والقدرة على أداء المعالجات الدوائية. الأسلوب بسيط نسبيا لتوظيف ويتطلب تسجيل واحد فقط القطب ومصدر ضوء للتحفيز أوبتوجينيتيك، التي أكثر جدوى من الحصول على تسجيلات كامل الخلية المزدوجة على أجزاء كل ما قبل وما بعد متشابك من المشبك. شرط أساسي تيربس أن إمكانات العمل مسدودة قبل ت بسهولة في النظام قيد الدراسة. ولكن، نظراً لأن الأعمال تتكس في الخلايا العصبية عبر طائفة واسعة من يعج التصنيفية، فمن المحتمل أن تيربس يمكن أن تطبق على نطاق واسع لكلا النظامين نموذج الثدييات واللافقريات.
تيربس يمكن تعديلها بسهولة في عدد من الآداب لتسهيل أما تحفيز السكان presynaptic المفترضة، أو لتسجيل من أهداف بوستسينابتيك. هنا، تم استخدام أداة أوبتوجينيتيك لحفز السكان المستهدفين، على الرغم من التنشيط بواسطة مجموعة متنوعة من الآليات الممكنة. تحفيز العصب من محاور عصبية حسية، على سبيل المثال، روتينية في الدراسات المتعلقة بانتقال العدوى من العصب باللوامس في المورفولوجية16 وهو مناسب في النظم الحسية الأخرى، بما في ذلك الأعصاب الطرفية التي تحتوي على الخلايا العصبية ميتشانوسينسوري. وأعرب نهجاً مماثلاً لاختبار الاتصال الفنية في المورفولوجية جكامب الكالسيوم مؤشرات السكان واحدة من الخلايا العصبية أثناء القيادة النشاط في عدد آخر من السكان عن طريق إيونوتروبيك بورينوسيبتور P2X2 و ATP التطبيق2. هذا النهج ينبغي أن يكون متوافقاً مع تيربس ببساطة شارك الإعراب عن التحوير ناتشباك مع مستقبلات P2X2 في إحدى الخلايا العصبية وجكامب في السكان آخر لأسلوب خالية تماما من التصحيح. ومع ذلك، يجب توخي الحذر مع النهج تسبب ديبولاريزيشنز أبطأ، مثل مستقبلات مصمم المسكارينيه على أساس تفعيلها حصرا17،المخدرات مصمم (دريدس)18. يمكن أن يؤدي depolarization بطيئة للمنظمة ناتشباك قبل جيل إمكانات العمل.
وقد استخدمت أساليب مماثلة إلى تيربس في نظم الثدييات. تقنيات مثل الجمع بين تتكس وتشاننيلرهودوبسين لتحديد الاتصال بين الخلايا العصبية. تشاننيلرهودوبسين التنشيط وحدها عموما لا ديبولاريزي الخلايا العصبية بما فيه الكفاية، وهكذا يتم تطبيق مانع قناة البوتاسيوم 4-وكالة اسوشييتد برس مع تتكس للحصول على الإفراج عن19،،من2021. بينما يعمل هذا في العديد من نقاط الاشتباك العصبي، قد لا تعمل في بعض الاشتباكات العصبية ميتابوتروبيك إذا كان الهدف المتلقين للمعلومات من مستقبلات قناة بوتاسيوم حساسة 4-AP. على سبيل المثال، يعتمد التعديل هرمون السيروتونين استجابة حاسة الشم في العث مباشرة على تحوير تلك 4-AP الحساسة ك+ الحالي (IA)22. لا يعمل هذا النهج أيضا في CSDn إلى المشبك LN (البيانات لا تظهر). وهكذا، تيربس فائدة التي تقتضي التدخل الدوائي أقل مقارنة بالأساليب الأخرى المستخدمة عادة وقد تعمل على نطاق أوسع أو نقاط الاشتباك العصبي.
وهناك عدد قليل من القيود إلى تيربس التي ينبغي النظر فيها. أولاً، قد تكون الآثار الجانبية المحتملة من التعبير المزمن على قناة ناتشباك في التنمية. يمكن تأكيد الجمعية حلبة السليم والدالة بمقارنة نشاط الخلايا العصبية بين مراقبة الذباب التي تفتقر إلى بنية ناتشباك والذباب مع البناء في غياب تتكس. لتجنب أي مشاكل من هذا القبيل، يمكن التحكم التعبير عن التحوير ناتشباك وقتيا عن طريق التعبير عن قامع GAL4 حساسة للحرارة، GAL8023. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان من الملاحظ المشبك فقط بطريقة تعتمد على الدولة، من المتصور أن قمع نشاط الشبكة مع ت قد تخفي اتصال من هذا القبيل. من المهم أن نؤكد على أن اتصال إيجابي لوحظ مع تيربس المحتمل يمثل اتصال أحادية متشابك حقيقية، بينما نتيجة سلبية ليس دليلاً على عدم وجود اتصال.
بينما تيربس يمكن أن تكشف عن قدرة الإرسال إطلاق سراح من العصبية واحد يؤثر على الشريك بوستسينابتيك ومن الواضح أن ديناميات قناة بطيئة ناتشباك وإمكانات الهضبة المرتبطة تفعيل جعله أقل تنطبق على دراسة كلاسيكية كبيرة. نهج واحد لتغيير تيربس لأسرع، سوف تكون أكثر طبيعية من الإفراج عن الإرسال للتعبير عن صيغة معدلة تتكس غير متحسسة للذاتية المورفولوجية الصوديوم قناة الفقرة بدلاً من ناتشباك. هذا التغيير سيؤدي إلى نشاط التشويك طبيعي في الخلية presynaptic وتسمح بتحليل أكثر تقليدية لانتقال متشابك في غياب نشاط الشبكة. وهذا سيكون لإمكانات كبيرة لإجراء دراسات لمعدل الترميز الاشتباكات العصبية، في أي التماس طائفة واسعة من النشاط presynaptic دون توظيف شبكات بوليسينابتيك سيكون من المستصوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر جوشوا سنجر، جوناثان شينك، فضلا عن المراجعين مدروس للتعليقات على المخطوطة. كما نود أن نشكر بن الأبيض وهارولد الجريدة للمناقشات بشأن الأسلوب. شينك جوناثان توفر البيانات الشكل 3A. أيد هذا العمل على منحة من مؤسسة وايت هول و R21 المعاهد الوطنية للصحة إلى قج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
