Summary
Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.
Abstract
Hier ist eine neue Technik, genannt Tetrotoxin (TTX) Engineered Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN) angewendet, um monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen Ziel zu testen. Die Methode beruht auf Co Ausdruck einer transgenen Aktivator mit dem Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac, in ein bestimmtes präsynaptischen Neuron. Verbindungen mit vermeintlichen postsynaptischen Partner richten sich nach ganzen Zelle Aufnahmen im Beisein von TTX, die elektrischen Aktivität in Nervenzellen blockiert, die nicht NaChBac ausdrücken. Dieser Ansatz kann geändert werden, um mit Aktivator oder Kalzium Imaging als Reporter der Verbindungen arbeiten. Terpen verleiht den wachsenden Satz von Werkzeugen für die Bestimmung der Konnektivität innerhalb von Netzwerken zur Verfügung. WARFTEN ist jedoch eindeutig, dass es auch zuverlässig Masse oder Volumen Übertragung und Spillover Übertragung meldet.
Introduction
Ein wesentliches Ziel der Neurowissenschaften ist, ordnen Sie die Verbindungen zwischen den Neuronen zu verstehen, wie Informationen über Schaltkreise fließt. Zahlreiche Ansätze und Ressourcen haben, um funktionelle Verknüpfung zwischen den Neuronen in einer Reihe von Modell-Systeme1,2Testen verfügbar. Um die genauesten Schaltpläne mit Elektrophysiologie zu erzeugen, ist es wichtig, zu lösen, ob beobachtete Verbindungen zwischen zwei Zellen direkt und monosynaptischen versus indirekte und polysynaptische sind. Ein Gold-Standard für die Herstellung dieser Unterscheidung in Säugetier-Neuronen ist die Wartezeit zwischen den einzelnen Action potentials in den präsynaptischen Zellen und dem Beginn der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in der zweiten Nervenzelle messen. Monosynaptische Verbindungen sollten kurze Wartezeiten von ein paar Millisekunden und geringe Variabilität3haben. Dieser Ansatz kann in Wirbellosen Neuronen kompliziert sein, denn Synapsen in ihre Dendriten weit von der somatische Aufnahme Website, was zu Verzögerungen in der Erkennung durch lange electrotonic Abstände zwischen postsynaptischen maßgearbeitet und der Aufnahme auftreten können Elektrode. Solche Verzögerungen können Unklarheiten bezüglich Poly-im Vergleich zu monosynaptischen Beiträge vorstellen. Darüber hinaus kleine synaptische Ereignisse kann vor Erreichen der somatischen Aufnahmen Website zerfallen, und fahren stärker präsynaptischen Aktivität wird voraussichtlich polysynaptische Veranstaltungen zu rekrutieren.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um für monosynaptischen Verbindungen bei Wirbellosen zu testen. Ein Ansatz setzt hohe zweiwertigen kationen (Hi-Di) mit überschüssigem Mg++ und Ca++. Diese Lösung blockiert polysynaptische Verbindungen durch reduzierende Release Wahrscheinlichkeit und zunehmende Aktionspotential Schwelle, Erkennung von monosynaptischen Eingang4,5zu bevorzugen. Bestimmung der genauen Verhältnis von Mg++ bis ca.++ erforderlich, jedoch ist nicht trivial und polysynaptische Beiträge können selbst bescheidene Stimulation6anhalten. Ein alternativer Ansatz namens GFP Rekonstitution über Synaptic Partner (GRASP) nutzt die Nähe zwischen Prä- und postsynaptischen Membranen gefunden an den Synapsen, einem monosynaptischen Verbindung 7abzuleiten. Hier eine Komponente des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) äußert sich in einer Nervenzelle und der ergänzenden Fragment des Moleküls drückt sich in einem vermeintlichen postsynaptischen Partner. Das Vorhandensein der Fluoreszenz zeigt, dass die zwei Neuronen sind in der Nähe genug, Rekonstitution des GFP-Moleküls zu gestatten und setzt die Existenz einer Synapse. Griff kann Synapsen falsch, jedoch melden, wenn zwei Zellen eng Membranen, wie in einem Nerv oder Faszikel apposed haben. Varianten von GRASP beseitigen solche Fehlalarme durch begrenzen der präsynaptischen Fragments der GLP direkt an Synaptobrevin, wodurch Rekonstitution nur bei aktiven Synapsen8. Während Griff und seine Varianten Bestimmung funktionelle Verknüpfung bei der Drosophila CNS beigetragen haben, können einige Verbindungen nicht sichtbar gemacht werden durch Verständnis wenn die Abstände zwischen Prä- und postsynaptischen Partner ist relativ groß. Dies ist besonders relevant bei der Bewertung der Lautstärke Übertragung Neuromodulation9 oder GABAergen Hemmung10zugeordnet.
Hier zeigt sich eine ergänzende und neuartige Technik zum Testen monosynaptischen Direktverbindungen in Drosophila CNS. Diese Methode, genannt Tetrodotoxin entwickelt Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN), funktioniert durch Co Ausdruck von Tetrodotoxin (TTX)-resistenten Natrium-Kanal, NaChBac und Aktivator optogenetische in einer präsynaptischen Zelle während der Aufnahme von vermeintlichen postsynaptischen Partner9. In Anwesenheit von TTX wird alle Aktionspotential-vermittelte Aktivität in den Zellen als die mit dem Ausdruck NaChBac unterdrückt. Der NaChBac-Kanal wird selektiv Erregbarkeit in die gezielte präsynaptischen Zellen bei schönem Licht-evozierten synaptische Übertragung wiederhergestellt. Diese Methode ermöglicht starke Aktivierung der präsynaptischen Neuronen, so dass Verbindungen postsynaptically durch somatische Aufnahme und reduziert die Wahrscheinlichkeit von recruiting polysynaptische Schaltungen gelöst werden können. Wichtig ist, diese Technik erlaubt die Untersuchung der Volumen-Übertragung und zeigt die Verbreitung des Senders aus ein einzelnes Neuron in einer Schaltung entlassen. Darüber hinaus können Terpen die chemische Natur der Verbindung durch konventionelle Pharmakologie offenbaren. Terpen eignet sich für den Einsatz in jedem Modellsystem, das die transgenen Ausdruck der TTX-unempfindliche Natriumkanäle ermöglicht.
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Protocol
1. bereiten Sie fliegen und identifizieren GAL4-Promotor-Linien
- Wählen Sie eine GAL4-Promotor-Linie und überqueren sie mit fliegen, die Durchführung des Transgens UAS-NaChBac und ein optogenetische Transgen für die Aktivierung.
Hinweis: FH-CsChrimson11 aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und die Leichtigkeit, mit der NaChBac-vermittelten Aktionspotentialen aktiviert, ausgewählt ist. FH-NaChBac und FH-CsChrimson sind aus dem Bloomington Bestände Repository verfügbar. - Bereiten Sie All-Trans Retinal als eine Stammlösung in Ethanol (35 mM) und speichern Sie die Lösung im Gefrierschrank bei-20 ° C.
- Mix-28 µL von diesem Bestand in etwa 5 mL konzentrierter Kartoffel Essen blättert nicht ab und fügen Sie diese Mischung an die Spitze der ein Fläschchen mit konventionellen Drosophila -Medium.
- Fliegen mit dem Ausdruck CsChrimson auf Lebensmittel, die 0,2 mM All-Trans-Retinal für 1 – 3 Tage11zu erhöhen.
2. bereiten Sie TTX Lager
- Erstellen Sie eine Stammlösung 1 mm TTX in destilliertem oder entionisiertem Wasser. Diese Lösung für mehrere Monate im Labor Kühlschrank aufbewahren. Überprüfen Sie die Institutionen Richtlinien in Bezug auf die Speicherung von TTX, wie viele Institutionen TTX als gefährlich oder kontrollierte Substanz einzustufen.
3. bereiten Sie fliegen für Elektrophysiologie
- Sammeln Sie 1 – 3 Tage alten Erwachsenen fliegen, die ausgelöst werden, auf das Essen mit All-Trans-Retinal.
Hinweis: Siehe Murthy und Turner im Jahr 2013 für eine detaillierte Beschreibung der Patch spannen Drosophila Neuronen12,13. - Legen Sie die fliegen in eine Glasflasche funkeln. Legen Sie das Fläschchen auf Eis für 1 min um die fliegen zu immobilisieren.
- Verwenden Sie grobe Zange um eine Fliege in eine maßgeschneiderte Aufnahme Kammer einzufügen. Die Kammer besteht aus einem 3 ½" Kreis Laser Schnitt von 1/16" Acryl. Schnitt ein Loch ¾" ist in der Mitte, wo eine benutzerdefinierte Folie mit 2-Komponenten-Epoxy befestigt ist. Die Folie enthält eine dreieckige geformte Hoffnung, die die Fliege eingefügt ist.
- Wenden Sie Wachs oder UV heilbar Epoxy rund um das Tier, um es innerhalb der Aufnahme Kammer zu befestigen an.
- Die Vorbereitung mit einem Schwanenhals-Lichtleiter für Visualisierung unter einem Stereomikroskop zu beleuchten. Legen Sie die Schwanenhals-Fasern für Schrägbeleuchtung sie so angepasst, dass sie fliegen direkt von der Seite beleuchten.
- Passen Sie die Lichtintensität auf die niedrigste mögliche Einstellung, noch klare Visualisierung der Fliege ermöglicht. Diese Lichtintensität variiert in einzelnen Experimente.
Hinweis: Dieses Protokoll kann angepasst werden durch eine in Situ Gehirn explant Methode14. - Rufen Sie externe Aufnahme Kochsalzlösung. Die Kochsalzlösung enthält in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-Tris (Hydroxymethyl)-Methyl-2-Aminoethane-Sulfo-Säure, 8 Trehalose, 10 Glukose, 26 Nahco33, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2und 4 MgCl2 (eingestellt auf mΩ 270-275). Die Kochsalzlösung wird mit 95 % O25 % CO2 (Carbogen) übergeben und hat ein pH-Wert 7,315angepasst.
- Platzieren Sie 4-6 Tropfen von extrazellulären Aufnahme Kochsalzlösung über die Fliege Vorbereitung. An diesem Punkt erhöhen Sie die Beleuchtungsstärke am Dissektion Mikroskop für bessere Sichtbarkeit.
- Ein Wolframdraht mit Elektrolyse zu schärfen. Um den Draht zu machen, Vorbereiten einer gesättigten Lösung von KNO3 und ca. 20 V AC Strom nicht anzuwenden, wenn die Spitze des Drahtes in die Lösung 20 Mal für 100 ms eintauchen, bis die Spitze geschärft ist. Verwenden Sie die geschärften Wolframdraht, entfernen die Nagelhaut auf den Kopf der Fliege und damit das Gehirn aussetzen.
- Weiter aussetzen des Gehirns durch Entfernen von Luftröhre und Fett stellen, die sie umgeben. Wenn die Riechzentrum Lappen zugreifen, verwenden Sie eine gebogene Wolframdraht oder ähnliches Werkzeug, sanft tuck Antennen unter der Folie Aufnahme Kammer um die Sichtbarkeit zu erhöhen. Verwenden Sie scharfe Pinzette sanft losreißen der Glia Ummantelung mit einer Fläche von Interesse, wo Aufnahmen gemacht werden.
- Übertragen Sie die Aufnahme-Kammer auf die Elektrophysiologie-Rig. Sofort sprudelte Start Perfusion mit externen Aufnahme Kochsalzlösung mit Carbogen, das Gehirn zu bewahren. Die Kochsalzlösung Reservoir wird über den Mikroskoptisch gesetzt und ist Schwerkraft-gefütterten zur Vorbereitung. Verwenden einer Vakuumleitung und eine 2 L-Erlenmeyerkolben, um die Abfälle Kochsalzlösung zu sammeln.
4. erhalten Sie Whole-Cell Aufnahme
- Ziehen Sie Patch Pipetten auf einem kommerziellen Pipette Abzieher. Konsultieren Sie das Handbuch für Einstellungen, um einen geeigneten Pipette mit einem Tipp-Widerstand in der Nähe von 7 mΩ zu erreichen.
- Fügen Sie 4 µL interne Aufnahme-Lösung in einer Patch-Pipette. Die interne Kochsalzlösung besteht aus 140 Kalium Aspartat-, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA und 1 KCl in mM.
- Patch Clamp Verstärker für die gesamte Zelle Aufnahme eingerichtet. Des Verstärkers Offset Null und legen Sie den Verstärker Testimpulse liefern. Hier wird AM Systeme Patch Clamp Verstärkers 2.400 verwendet.
- Positiver Druck durch die Pipette und nähern sich die Zelle. Verwenden Sie einen Mikromanipulator leiten die Pipette und wenden Sie sich an die Zelle. Entlasten Sie positiven Druck. Satz der Holding-Potenzial der Membran zu-60 mV. Die Pipette sollte eine Gigaohm Dichtung mit der Zellmembran wie durch eine niedrige Sub-Picoamp Haltestrom zu bilden.
Hinweis: Wenn mit GFP Zelle Ausrichtung geleitet, versuchen Sie, Einsatz von Epifluorescent Licht auf ChR2 Aktivierung und potenzielle synaptische Depression verhindern zu minimieren. Auch für ein paar Minuten vor dem Auftragen Schritt 5 warten. - Festlegen den Verstärker liefern Testimpulse von-50 mV bis-60 mV. Diese Einstellung ist standardmäßig in Patch-Clamp-Verstärker. Prüfimpulse zeigen eine große kapazitative transiente repräsentieren die aktuellen notwendig, laden Sie die Patch-Pipette. Entfernen Sie kapazitative Transienten durch Anpassung der Kapazität Entschädigung Knöpfe auf der AM 2400 oder ähnlichen Verstärker.
- Wenden Sie kurze Impulse von Unterdruck, Ruptur der Zellmembran und erhalten ganz-Zell Konfiguration an.
Hinweis: Eine ganze Zelle Konfiguration wird beobachtet, wenn gibt es eine große Zunahme der kapazitative Transienten zeigt die Kapazität des Neurons. Eine geringe Erhöhung der Haltestrom (Baseline) wird wahrscheinlich auch beobachtet werden. Den Verstärker zu aktuellen Klemme Modus einstellen und anpassen der Zelle Potential,-50 bis-60 mV.
5. Testen Sie die synaptischen Konnektivität
- Konfigurieren Sie das Datenerfassungssystem (DAQ) um einen LED-Treiber um die Lichtimpulse erzeugen auszulösen. Hier wird eine nationale Instrumente DAQ-System mit Matlab verwendet, um ein analoges Signal auf einen LED-Treiber liefern. Die LED-Intensität wird über das analoge Signal an den Fahrer angepasst. Die LED ist ein 620-630 nm Wellenlänge LED.
- Positionieren Sie die High-Power LED direkt unterhalb der Vorbereitung. Passen Sie die Intensität des Lichts, sodass 0.238 mW/mm2 im Handumdrehen erreicht.
- Aktivieren Sie die präsynaptischen Neuronen während der Aufnahme aus der postsynaptischen Zelle von Interesse. Zelle Aktivierung Optogenetically, Pharmacogentically, zu erreichen oder über Nervenstimulation. Hier sind CsChrimson und kurze Impulse von rotem Licht angewendet.
Hinweis: Synaptische Verbindungen können entweder in Stromzange als EPSPs oder Spannung Klemme als EPSCs überwacht werden. Eine synaptische Verbindung sollte sichtbar sein, bevor Sie in Reaktion auf einen Lichtpuls 40 ms TTX anwenden. Wenn keine Verbindung zu beobachten ist, ist es unwahrscheinlich, dass die Nervenzellen synaptisch verbunden entweder Mono- oder polysynaptically. Im Betrieb möglichen kann angepasst werden, um erregenden oder hemmenden Anschlüsse entsprechend zu betonen. - Wenn eine Verbindung in normalen Kochsalzlösung beobachtet wird die Perfusion System, eine Endkonzentration von 1 zu erreichen TTX hinzufügen verwenden µM eine Umwälzpumpe zu erfassen und Wiederverwenden von Kochsalzlösung um TTX zu sparen. Die peristaltische Pumpe wird Salzlösung aus dem Bad zu ziehen und an der saline Reservoir zurück.
- Passen Sie die Pumpe Geschwindigkeit um ein starkes Vakuum konstant bereitzustellen, das nicht, dass Kochsalzlösung Ebene in der Badewanne zulässt zu steigen und fallen.
Hinweis: Die Anwendung der TTX sollte die Einstellung der Spick Aktivität in der Nervenzelle, die ganze Zelle überwacht wird führen. Dies bestätigt, dass die Kochsalzlösung genug TTX hinzugefügt wurde. - Kurze Impulse von rotem Licht (40 ms bei jedem Impuls) erneut anwenden. An dieser Stelle synaptische Verbindung, die bleibt ist wahrscheinlich monosynaptischen. Die umlaufenden Kochsalzlösung testen die chemische Natur der synaptischen Verbindungen, die bleiben in TTX fügen Sie pharmakologische Antagonisten hinzu.
Hinweis: Bei der Kombination von Optogenetik und fluoreszierende Ausrichtung der Neuronen kann es wichtig, nicht zu anhaltend aktivieren die präsynaptischen Bevölkerung der Neuronen bei dem Versuch, eine Aufnahme zu erhalten sein. Dies kann zu synaptische Depression führen und erschwert es, Verbindungen zu sehen. Da CsChrimson eine lange Erregung Band, die weitgehend in den Bereich des grün fluoreszierenden Proteins erstreckt hat, kann eine rote Fluorophor verwendet werden, um Neuronen und channel2rhodopsin visualisieren (Ch2R) kann verwendet werden, um Zellpopulationen zu begeistern. Dies erfordert spezielle Genetik und einen benutzerdefinierten Filter-Cube. Um geeignete fliegen zu erzeugen, machen Sie fliegen, die die rote Fluorophor (RFP oder mCherry) ausdrücken unter die LexA oder Q-System binärer Ausdruck Systeme. Diese müssen mit der Fliege Gal4 Förderer und FH-Ch2R und FH-NaChBac-Effektor-Gene auszudrücken überquert werden. Der optimale Filter-Cube für Epifluoreszenz haben eine Reihe von schmalen Erregung zu begeistern die rote Fluorophor, aber nicht begeistern Ch2R. zusätzlich, die Filter-Set sollte einen langen Pass Emission Filter, um möglichst viel emittierte Licht zu sammeln. Wir verwendeten einen benutzerdefinierten Filter set von Chroma, die Teil-Nummern et580/25 X und t600lpxr (aus dem 49306 Satz), enthalten aber mit einem et610lp Barriere/Emission Filter.
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Representative Results
Terpen dient zur Unterscheidung zwischen Mono- und polysynaptische Beiträge in synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen. Während schwache Stimulation einer Zelle verwendet werden, um direkte Verbindungen zu testen, Rekruten fahren größeren präsynaptischen Aktivität oft polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1A). Terpen funktioniert durch die TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac und Aktivator optogenetische Co zum Ausdruck zu bringen, und testen Verbindungen in Gegenwart von TTX polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1 b) zu beseitigen. TTX blockiert effektiv Aktionspotentiale in Drosophila Gehirn, so dass es eine geeignete Vorbereitung auf WARFTEN (Abbildung 2A). Transgene Ausdruck des Natrium-Kanals NaChBac rettet Erregbarkeit in Neuronen und Ergebnisse in einem großen Plateau-Potential (Abb. 2 b).
Lokalen Interneuronen (LN) in das Riechzentrum Lappen zeigen robuste Antworten auf olfaktorische Reize (Abb. 3A). Da einzelne EPSPs nicht leicht bei der LN-Soma gelöst sind, bleibt jedoch unklar, ob solche Reaktionen ergeben sich direkt aus olfaktorischen Rezeptor Neuron Eingang (ORN) oder indirekt über Projektion Neuronen (PN) (Abb. 3 b) Eingang. Mithilfe von WARFTEN machen ORNs abgebildet, in der Tat direkte synaptische Verbindungen mit LNs (Abbildung 3).
Eine Besonderheit der WARFTEN ist seine Fähigkeit, speziell Volumen extra synaptische Übertragung zu lösen, die mit GABA oder Neuromodulatoren wie Serotonin auftreten können. Stimulation von einer serotonergen Neuron (CSDn) in der Drosophila Riechzentrum Lappen resultiert in einer Mischung aus Erregung und Hemmung in ein lokales Interneuron (Abbildung 4A und Abbildung 4 b). Die Erregung wird durch die exzitatorischen Transmitter Acetylcholin meditierte und die Hemmung wird durch Serotonin (Abbildung 4 und Abbildung 4). Terpen können verwendet werden, um festzustellen, ob die Verbindungen monosynaptischen sind durch den Wegfall von polysynaptischer Verbindungen (Abb. 4E). In TTX ist eine starke Hemmung noch beobachtet, in der LN, was darauf hindeutet, dass es aus direkt durch die Aktivierung eines bestimmten serotonergen Neurons (Abbildung 4F und Abbildung 4) ankommt. Diese Verbindung wird durch die Serotonin-Antagonist Methysergid blockiert. Die erregenden Synapse vermittelt durch Acetylcholin schied in TTX, was darauf hindeutet, dass es aus polysynaptische Quellen entstanden.
Abbildung 1 : Terpen beseitigt polysynaptische Verbindungen und isoliert monosynaptischen Eingänge. (A). ein schematisches Diagramm zeigt, dass die Erhöhung der präsynaptischen Aktivität polysynaptische Verbindungen rekrutieren kann. (B). ein Diagramm zur Veranschaulichung, wie Terpen polysynaptische Beiträge entfernen können, mithilfe von TTX spiking Aktivität in Nervenzellen zu beseitigen. Erregbarkeit ist ausschließlich in einer Population von Neuronen wiederhergestellt, die dann aufgeregt Optogenetically sein kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : NaChBac stellt neuronale Erregbarkeit in Drosophila Neuronen. (A) die Anwendung von 1 µm TTX abschafft Spick in Drosophila Neuronen. Spontane Aktivität und Geruch-evozierten Hemmung werden in TTX eliminiert. (B) NaChBac und CsChrimson sind in der CSDn ausgedrückt und das Gehirn TTX ausgesetzt ist. CsChrimson Stimulation erschüttert die CSDn und nachdem ein Schwellenwert überschritten wird, gibt es große nicht-linearen Anstieg der CSDn Membran Spannung. Diese schnelle Depolarisation bildet eine Hochebene Potenzial (Einschub). Jede Farbe über Simulation Intensitäten entspricht der gleichen Farbe im Spannung-Einschub. Diese Zahl wurde von Zhang und Gaudry 20169geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Terpen enthüllt monosynaptische Verbindungen zwischen ORNs und LNs. (A) A Aufnahme zeigt eine Geruch Antwort in eine LN Diese Antwort kann Mono- oder polysynaptische in der Natur. (B) WARFTEN können bei der ORN, LN Synapse getestet werden. TTX wird verwendet, um Aktionspotentiale und Erregbarkeit in allen Zellen bei der Vorbereitung zu blockieren. Erregbarkeit ist ausschließlich in der ORNs über den NaChBac-Natrium-Kanal wiederhergestellt. Die ORNs können dann mit Channelrhodopsin angeregt werden, synaptischen Freisetzung zu entlocken. Synaptische Ereignisse sind post-synaptically mit Aufnahmen der gesamten Zelle gemessen. (C) WARFTEN zeigt, dass die ORN, LN Synapse monosynaptischen. Terpen kombinierbar auch mit Pharmakologie zu zeigen, dass die Synapse cholinerge und durch das Nikotin-Rezeptor-Antagonist Mecamylamin (200 µM) blockiert ist. Der graue Balken zeigt das Timing der ORN Stimulation. Diese Zahl wurde von Zhang und Gaudry in 20169geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Terpen ist empfindlich gegen Masse oder Volumen Übertragung Entlassung aus modulierende Neuronen. (A) die Stimulation des CSDn entsteht ein Aktionspotential aus einer aufgezeichneten LN in der Drosophila Riechzentrum Lappen. (B) der LN ist hyperpolarisierten damit CSDn Stimulation eine Eingangssignale Aktivität führt. Die LN-Antwort besteht aus eine schnelle Depolarisation, gefolgt von einem langsameren Hyperpolarisation. Der graue Balken gibt die Zeit der CSDn Stimulation. Methysergid (50 µM), einem breiten 5-HT-Rezeptor-Antagonisten blockiert die langsame Hyperpolarisation aber hat keinen Einfluss auf die Depolarisation. Mecamylamin blockiert die schnelle Depolarisation, die darauf hindeutet, dass es in der Natur cholinerge. (C) WARFTEN können verwendet werden, um zu beheben, welche chemischen Komponenten des CSDn, LN Synapse Mono-und polysynaptische sind. (D) der CSDn wird im Beisein von TTX stimuliert und postsynaptischen LN-Antworten werden im gesamten Zelle Aufnahmen gemessen. Die Hyperpolarisation weiterhin TTX, was darauf hindeutet, dass es in der Natur monosynaptischen ist. Diese Hyperpolarisation wird auch von Methysergid, Einklang mit serotonerge Übertragung blockiert. Die kurze Depolarisation, die in TTX bleibt ist wahrscheinlich durch elektrische Kupplung, da sie nicht durch Nikotinsäure Antagonisten blockiert Lücke vermittelt. Diese Zahl wurde von Zhang und Gaudry in 20169geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei 1: Drosophila Folie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Datei 2: Physiologie Kammer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Terpen Analyse ergänzt aktuelle Techniken zur Schaltung Rissbildung durch ermöglicht die Erkennung von Synapsen zwischen bestimmten Nervenzellen verwendet. Insbesondere offenbart der Ansatz monosynaptische Verbindungen im großen und ganzen Aktionspotentiale mit TTX-Stummschaltung während der Wiederherstellung Erregbarkeit in einer ausgewählten Population von Neuronen mit dem TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac. Synaptischen Freisetzung wird durch optogenetische Stimulation ausgelöst, während postsynaptischen Veranstaltungen mit Aufnahmen der gesamten Zelle überwacht werden. WARFTEN unterscheidet sich von anderen Ansätzen wie Griff durch sensibel Bulk oder Volumen Getriebe löste bei längeren Strecken und die Fähigkeit, pharmakologische Manipulationen durchführen. Die Technik ist relativ einfach zu verwenden und erfordert nur eine Aufzeichnung Elektrode und einer Lichtquelle für optogenetische Stimulation, die mehr als den Erhalt dual ganze Zelle Aufnahmen auf Prä- und postsynaptischen Teil der Synapse machbar ist. Eine grundlegende Anforderung der WARFTEN ist, dass Aktionspotentiale leicht in das zu untersuchende System durch TTX blockiert werden. Aber weil TTX einem breiten Spektrum von taxonomischen Stämme auf Nervenzellen wirkt, ist es wahrscheinlich, dass WARFTEN im großen und ganzen auf beiden Säugetieren und Wirbellosen Modellsysteme angewandt werden könnte.
WARFTEN können einfach in einer Reihe von Sitten, entweder zu erleichtern die Stimulation der vermeintlichen präsynaptischen Bevölkerung oder für die Aufnahme von postsynaptischen Ziele angepasst werden. Hier wurde ein optogenetische Werkzeug verwendet, um die Zielgruppen zu stimulieren obwohl Aktivierung durch eine Vielzahl von Mechanismen möglich ist. Nervenstimulation von sensorischen Axonen, z. B. ist Routine in Studien der Übertragung vom Riechzentrum Nerv in Drosophila16 und eignet sich in anderen sensorischen Systemen, einschließlich der periphere Nerven, die Mechanosensory Neuronen enthalten. Ein ähnlicher Ansatz zu testen funktionelle Verknüpfung in Drosophila ausgedrückt GCaMP Kalzium Indikatoren in einer Population von Neuronen während der Fahrt Tätigkeit in anderen Bevölkerung über die Ionotropic Purinoceptor P2X2 und ATP Anwendung2. Dieser Ansatz sollte einfach gemeinsam zum Ausdruck bringen das Transgen NaChBac mit den P2X2-Rezeptor in einem Neuron und GCaMP in anderen Bevölkerung nach einer Methode, völlig frei von Patch kompatibel mit WARFTEN. Jedoch sollte Vorsicht mit Ansätzen verursacht langsamere Depolarizations, wie z. B. die Muskarin-basierten Designer Rezeptoren aktiviert ausschließlich durch eine Designerdroge (DREADDs)17,18genommen werden. Langsame Depolarisation könnte zu NaChBac Inaktivierung vor Aktionspotential Generation führen.
Ähnliche Methoden auf WARFTEN sind in Säugetier-Systemen eingesetzt worden. Solche Techniken kombinieren TTX und Channelrhodopsin Verbindungen zwischen den Neuronen zu kartieren. Channelrhodopsin Aktivierung allein in der Regel nicht depolarisieren Neuronen ausreichend, und somit ist die Kalium Kanal Blocker 4-AP mit TTX Release19,20,21zu entlocken angewendet werden. Während dies bei vielen Synapsen funktioniert, kann es nicht an einige metabotropen Synapsen funktionieren, wenn das nachgeschaltete Ziel des Rezeptors ein 4-AP sensible Kaliumkanal ist. Zum Beispiel setzt serotonergen Modulation der olfaktorischen Antwort in Motten direkt zur Modulation von solch eine 4-AP empfindliche K+ Strom (IA)22. Dieser Ansatz funktionierte auch nicht an die CSDn, LN Synapse (Daten nicht gezeigt). So WARFTEN hat noch einen Vorteil des Erforderns weniger pharmakologische Intervention im Vergleich zu anderen gängigen Methoden und breiteres Spektrum oder Synapsen arbeiten können.
Es gibt ein paar Einschränkungen auf WARFTEN, die berücksichtigt werden sollten. Erstens kann mögliche Nebenwirkungen von chronischen Ausdruck des NaChBac Kanals während der Entwicklung sein. Ordnungsgemäße Schaltung Montage und Funktion können durch den Vergleich bestätigt werden, die Aktivität der Neuronen zwischen Kontrolle fehlt das NaChBac Konstrukt fliegt und fliegt mit dem Konstrukt der mangelnden TTX. Um solche Probleme zu vermeiden, konnte Expression des Transgens NaChBac per Ausdruck von temperaturempfindlichen GAL4 Repressor, GAL8023zeitlich gesteuert werden. Darüber hinaus, wenn eine Synapse nur in einem Staat-abhängigen Weise beobachtet wird, ist es denkbar, dass Netzwerk-Aktivität mit TTX unterdrücken solche Verbindung verbergen könnte. Es ist wichtig zu betonen, dass eine formschlüssige Verbindung mit WARFTEN wahrscheinlich beobachtet eine echte Mono-synaptische Verbindung darstellt, während ein negatives Ergebnis nicht Beweis für das Fehlen einer Verbindung ist.
Während WARFTEN die Fähigkeit des Senders offenbaren loslassen von einem Neuron postsynaptischen Partner natürlich beeinflussen die langsame Kanal Dynamik des NaChBac und die Plateau-Potenziale verbunden mit seiner Aktivierung machen es weniger für das Studium der klassischen Neurotransmission. Ein Ansatz, die WARFTEN für schneller verändern, werden mehr natürliche Sender Freisetzung eine modifizierte TTX-unempfindliche Version des endogenen Drosophila Natrium-Kanal Para im Gegensatz zu NaChBac zum Ausdruck bringen. Diese Änderung würde naturalistischen spiking Aktivität in der präsynaptischen Zelle und herkömmlicheren Analyse der synaptischen Übertragung in Ermangelung der Netzwerk-Aktivität zu ermöglichen. Dies hätte großes Potential für Studien der Rate-Codierung Synapsen, an denen entlocken eine Vielzahl von präsynaptischen Aktivität ohne recruiting polysynaptische Netzwerke wünschenswert wäre.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten danken Joshua Singer, Jonathan Schenk sowie durchdachte Rezensenten für Kommentare auf das Manuskript. Wir möchten auch Danke Ben White und Harold Zakon für Diskussionen über die Technik. Jonathan Schenk lieferten die Daten für die Abbildung 3A. Diese Arbeit wurde durch ein Whitehall Foundation Grant und einem NIH-R21, QG unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
