Summary
Bu makalede tarafından istihdam Tetradotoksin ve Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanal, NaChBac arasındaki monosynaptic bağlantıları sınamak için bir yöntem sunar.
Abstract
Burada, Tetrotoxin (TTX) Engineered Direniş sondalama Synapses (TERPS için) olarak adlandırılan yeni bir teknik hedef nöronlar arasındaki monosynaptic bağlantıları için test etmek için uygulanır. Yöntem bir transgenik harekete geçirmek Tetradotoksin dayanıklı sodyum kanalda, NaChBac, presynaptic belirli bir neuron ile ortak ifade kullanır. Sözde Post sinaptik ortaklarıyla bağlantı NaChBac ifade edemediği nöronların elektriksel aktivite engeller TTX huzurunda bütün hücreli kayıtları belirler. Bu yaklaşım ile herhangi bir harekete geçirmek ya da kalsiyum görüntüleme bağlantılarının bir muhabir olarak çalışmaya değiştirilebilir. TERPS büyüyen bağlantı ağları içerisinde belirlemek için kullanılabilen araçlar kümesi ekler. Ayrıca güvenilir bir şekilde toplu veya ses iletimi ve yayılma iletim raporları ancak, TERPS benzersizdir.
Introduction
Nöroloji ana amacı bilgi devreleri nasıl aktığını anlamak için nöronlar arasındaki bağlantıları göster etmektir. Çok sayıda yaklaşımlar ve kaynakları model sistemleri1,2aralığında nöronlar arasındaki fonksiyonel bağlantı test etmek kullanılabilir hale gelmiştir. Elektrofizyoloji kullanarak en doğru devre şemaları oluşturmak için iki hücre arasında gözlenen bağlantı doğrudan ve dolaylı ve polysynaptic karşı monosynaptic gidermek önemlidir. Bu ayrım memeli nöronlarda yapmak için bir altın standart presynaptic hücrelerdeki tek action potentials ve ikinci nöron eksitatör postsinaptik akımlar (EPSCs) başlangıcı arasındaki gecikme süresi ölçmek etmektir. Monosynaptic bağlantıları bir kaç milisaniye ve düşük değişkenlik3kısa gecikme süreleri olması gerekir. Çünkü sinapslarda onların dendrites uzak algılama arasında postsinaptik conductances ve kayıt uzun electrotonic mesafeleri nedeniyle gecikmelere neden somatik kayıt sitesi oluşabilir bu yaklaşım omurgasız nöronlarda karmaşık olabilir elektrot. Böyle gecikmeler belirsizlik ile ilgili Poli-monosynaptic katkıları karşı ortaya çıkarabilir. Ayrıca, küçük sinaptik olaylar somatik kayıtları sitenin ulaşmadan önce çürük ve daha güçlü presynaptic etkinlik, sürüş polysynaptic olaylar işe almak olasıdır.
Omurgasızlar monosynaptic bağlantılarına ilişkin test etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Uygulanabilecek yöntemlerden biri aşırı++ Mg ve Ca++içeren yüksek divalent katyon Çözümleri (Hi-Di) kullanır. Bu çözüm azalan bakiyeli yayın olasılık ve algılama monosynaptic giriş4,5lehine artan aksiyon potansiyeli eşik tarafından polysynaptic bağlantıları engeller. Gerekli, Mg Ca++ ++ kesin oranını belirlemek ancak, önemsiz değildir ve polysynaptic katkıları için bile mütevazı stimülasyon6kalıcı. GFP sulandırma genelinde sinaptik ortakları (kavrama) denilen alternatif bir yaklaşım sinapslarda bir monosynaptic bağlantı 7anlaması için bulundu öncesi ve postsinaptik membran arasında yakınlık avantajlarını kullanır. Burada, bir bileşeni yeşil flüoresan protein (GFP) bir neuron ifade edilir ve molekül tamamlayıcı parçası sözde postsinaptik ortak olarak ifade edilir. Floresans varlığını iki neurons sulandırma GFP molekülünün izin vermek için yeterince yakın ve bir synapse varlığını ima olduğunu gösterir. İki hücre membranlar, bir sinir ya da fascicle olduğu gibi yakından apposed KAVRAMAK sinapslarda yanlış, yine de, bildirebilirsiniz. KAVRAMAK türevleri böyle yanlış pozitif GFP presynaptic parçası doğrudan synaptobrevin, böylece yalnızca etkin sinapslarda8' de sulandırma izin için hayvan zinciri tarafından ortadan kaldırmak. Ise KAVRAMAK ve türevleri fonksiyonel bağlantısı'nda Drosophila CNS belirlemede etkili olabilirdi, öncesi ve postsinaptik ortakları arasındaki mesafeleri göreceli olarak büyük ise bazı bağlantılar KAVRAMAK tarafından görünür yapılabilir değil. Bu özellikle ilgili değerlendirme birimi iletim neuromodulation9 veya GABAergic inhibisyon10ile ilişkili olduğunu.
Burada, bir tamamlayıcı ve yeni teknik Drosophila içinde CNS doğrudan monosynaptic bağlantıları sınama gösterilmiştir. Tetradotoksin (TTX) ortak ifade tarafından Tetradotoksin Engineered Direniş sondalama Synapses (TERPS için), denilen bu yöntem inşaat-dayanıklı sodyum kanal, NaChBac ve optogenetic aktivatör sözde üzerinden kayıt sırasında presynaptic hücrede postsinaptik ortakları9. TTX huzurunda tüm aksiyon potansiyeli-aracılı etkinliğini NaChBac ifade dışındaki hücrelerde bastırılır. NaChBac kanal seçici olarak sinaptik iletimi ışık uyarılmış izin uyarılabilirlik hedeflenen presynaptic hücreleri içinde geri yükler. Öyle ki bağlantıları postsynaptically polysynaptic devreler işe alma olasılığını azaltırken somatik kayıt tarafından çözülebilir bu yöntem presynaptic nöronların güçlü harekete geçirmek izin verir. Önemlisi, bu teknik ses iletim çalışma ruhsatı ve bir devre boyunca tek bir nöron serbest verici yayılmasını ortaya koymaktadır. Buna ek olarak, TERPS geleneksel Farmakoloji bağlantısından kimyasal doğası ortaya çıkarabilir. TERPS TTX-duyarlı sodyum kanalları transgenik ifade veren herhangi bir modeli sistem kullanım için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. uçar ve tanımlamak GAL4 organizatörü satırları hazırlamak
- GAL4 organizatörü satırı seçin ve sinekler UAS-NaChBac transgene ve harekete geçirmek için bir optogenetic transgene ile çapraz.
Not: UAS-CsChrimson11 onun yüksek gürültülerinden ve hangi ile NaChBac-aracılı aksiyon potansiyelleri etkinleştirir kolaylığı nedeniyle seçilir. UAS-NaChBac ve UAS-CsChrimson Bloomington hisse senetleri deposundan mevcuttur. - All-trans retinal etanol (35 mM) hisse senedi bir çözüm olarak hazırlamak ve çözüm dondurucu-20 ° C'de depolayın
- Mix 28 µL yaklaşık 5 mL rehydrated patates de içine bu stokunun gıda pul ve geleneksel Drosophila orta bir şişe başına bu karışımı ekleyin.
- Yetişkin sinekler 0.2 mM all-trans-retina 1 – 3 gün11içeren gıda csChrimson ifade yükseltmek.
2. TTX hisse senedi hazırlayın
- 1 mM TTX stok çözeltisi distile veya deiyonize su içinde oluşturun. Bu çözüm birkaç ay için bir laboratuvar buzdolabında saklayın. Birçok kurum TTX tehlikeli veya kontrollü bir madde olarak sınıflandırmak olarak TTX depolanmasını ilgili kurumlarının politikalarına kontrol edin.
3. sinekler Elektrofizyoloji için hazırlayın
- 1-3 yaşlı yetişkin uçar gün yetiştirilir gıda all-trans-retina ile toplamak.
Not: Yama Drosophila sinir hücreleri12,13sıkma ayrıntılı bir açıklaması için 2013 yılında Murthy ve Turner'ı bakın. - Sinekler bir cam mercek şişede koymak. Şişe buz sinekler hareketsiz için 1 dakika için üzerine yerleştirin.
- Kaba forseps bir sinek bir ısmarlama kayıt odasına eklemek için kullanın. 1/16" akrilik kesmek 3 ½" Daire lazer odası oluşmaktadır. Nerede özel bir folyo 2 parçalı epoksi ile bağlı olduğu merkezi haline kesim bir delik ¾" olduğunu. Folyo bir üçgen şeklinde anında eklenir umut içerir.
- Balmumu veya UV tedavi edilebilir epoksi hayvan sıkıca içinde kayıt odası güvenliğini sağlamak için geçerli.
- Boynu optik fiber hazırlıkla bir stereomicroscope altında görselleştirme için aydınlatmak. Böylece onlar sinek tarafından doğrudan gelen aydınlatmak onları ayarlayarak boynu liflerin oblik aydınlatma için ayarlayın.
- Hala anında net görselleştirme sağlar en düşük olası ayar için ışık seviyesini ayarlayın. Bu ışık şiddeti bireysel deneyler arasında değişir.
Not: Bu protokol adapte edilebilir bir içinde in situ beyin kullanarak yöntemi14explant. - Harici kayıt salin almak. Serum mM içerir: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) metil-2-aminoethane-sulfonic asit, 8 trehalose, 10 glikoz, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2ve 4 MgCl2 (270 – 275 mΩ için ayarlanabilir). Tuz çözeltisi % 95'i O2/5% CO2 ile (carbogen) bubbled ve pH 7,315' e ayarlanabilir.
- 4-6 damla hücre dışı kayıt tuz uçmak hazırlık yere. Bu noktada, diseksiyon mikroskop daha iyi görüş için hafif düzeyde artırmak.
- Elektroliz kullanarak bir tungsten tel keskinleştirmek. Tel yapmak için KNO3 doymuş çözeltisi hazırlamak ve ucu bilenmiş kadar 100 ms için 20 kez çözüm içine tel ucu daldırma süre yaklaşık 20 V AC akım uygulayın. Bilenmiş tungsten tel anında ve böylece beyin başkalarının eline geçmesini kafasına kütikül kaldırmak için kullanın.
- Daha fazla beyin trakea ve onu çevreleyen yağ cesetleri çıkarma tarafından ortaya çıkarmak. Antennal loblar, bir bükülmüş tungsten tel veya benzer aracı yavaşça anten folyo odası görünürlüğünü artırmak için kayıt altına sokmak için kullanın. Sharp forceps yavaşça uzakta gözyaşı nerede kayıtları yapılacaktır ilgi alanı kapsayan gliyal kaplama için kullanın.
- Kayıt odası Elektrofizyoloji teçhizat aktarın. Hemen başlangıç perfüzyon harici kayıt salin ile beyin korumak için carbogen ile bubbled. Tuzlu çözüm rezervuar mikroskop sahne üzerinde yerleştirilir ve yerçekimi beslenen-hazırlık için. Bir vakum hattı ve bir 2 L Erlenmeyer şişesi atık salin toplamak için kullanın.
4. bütün hücreli kayıt elde
- Yama Pipetler bir ticari pipet çektirmenin çek. 7 mΩ yakınındaki bir ipucu direnci ile uygun bir pipet elde etmek ayarları için kullanım kılavuzuna bakın.
- İç kayıt çözüm 4 µL yama pipet ekleyin. 140 potasyum aspartat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 Na3GTP, 1 EGTA ve 1 iç tuz oluşur KCl mm.
- Yama kelepçe amplifikatör bütün hücreli kayıt için ayarlayın. Amplifikatör'ın uzaklık sıfır ve amplifikatör test darbeleri teslim etmek için ayarla. Burada, bir AM sistemleri yama kelepçe amplifikatör 2400 kullanılır.
- Pipet ile pozitif basınç uygulayın ve hücre yaklaşım. Bir micromanipulator pipet doğrudan ve hücre üzere kullanın. Pozitif basınç serbest bırakmak. Set membran -60 için holding potansiyelini mV. Pipet gigaohm mühür olarak geçerli tutan düşük bir alt picoamp kanıtladığı hücre membran ile oluşturmalıdır.
Not: GFP kullanarak hücre hedefleme destekli, ChR2 harekete geçirmek ve potansiyel sinaptik depresyon önlemek için epifluorescent ışık kullanımı en aza indirmek deneyin. Ayrıca adım 5 uygulamadan önce birkaç dakika bekleyin. - Ayarla test bakliyat -50 teslim etmek belgili tanımlık amplifikatör mV -60 için mV. Yama-kelepçe amplifikatörler üzerinde standart bir ayardır. Test bakliyat yama pipet şarj etmek için geçerli gerekli temsil eden bir büyük capacitative geçici ortaya çıkaracaktır. AM 2400 kapasite tazminat topuzlar ayarlayarak capacitative geçişler veya benzer amplifikatör kaldırın.
- Hücre membran rüptürü ve bütün hücre yapılandırmasını almak için negatif basınç kısa darbeleri uygulayın.
Not: nöron kapasitans gösterilen capacitative geçişler büyük bir artış olduğunda bütün hücre yapılandırması görülmektedir. Holding geçerli (temel) küçük bir artış büyük olasılıkla da gözlenir. Amplifikatör geçerli kelepçe moda ayarlayın ve hücre potansiyeli -50 -60 ila için ayarlamak mV.
5. sinaptik bağlantısını sınama
- Işık darbeleri üretmek için bir LED sürücü tetiklemek için veri alma (DAQ) sistemi yapılandırın. Burada, bir ulusal aletleri DAQ sistemi Matlab ile analog bir sinyal LED sürücü için teslim etmek için kullanılır. LED yoğunluğu sürücü analog sinyal aracılığıyla ayarlanır. LED bir 620-630 nm dalga boyu LED var.
- Yüksek güçlü kırmızı LED doğrudan hazırlık altına yerleştirin. 0,238 mW/mm2 anında ulaşır ışık yoğunluğunu ayarlayın.
- Postsinaptik hücre ilgi kayıt sırasında presynaptic nöronlar etkinleştirin. Hücre harekete geçirmek optogenetically, pharmacogentically, elde etmek veya sinir stimülasyonu ile. Burada, csChrimson ve kırmızı ışık ve kısa darbeleri uygulanır.
Not: Sinaptik bağlantıları ya EPSPs olarak geçerli kelepçe ya da gerilim kelepçe EPSCs olarak izlenebilir. Sinaptik bağlantı yanıt olarak 40 ms ışık nabız TTX uygulamadan önce görünür olmalıdır. Hiçbir bağlantı gözlem yapılırsa, olası değildir ya da mono - bağlı nöronlar synaptically olan ya da polysynaptically. Potansiyel holding buna göre eksitatör ve inhibitör bağlantıları vurgulamak için ayarlanabilir. - Bir bağlantı normal salin TTX 1 son bir konsantrasyon ulaşmak için perfüzyon sistemi eklemek gözlem yapılırsa µM. dolaşım pompası yakalamak ve serum TTX korumak için yeniden kullanmak için kullanın. Peristaltik pompa tuzlu çözüm banyodan çizmek ve tuzlu su deposu için geri.
- Bu serum düzeyi yükselişi ve düşüşü için banyoda izin vermez güçlü bir sürekli vakum sağlamak için Pompa hızı ayarlayın.
Not: Bütün-hücreye izlenmekte nöron etkinliğinde spiking bırakma TTX uygulanması sonucunda. Bu yeterli TTX salin için eklenmiş olduğunu onaylar. - Kırmızı ışık (40 ms her darbe için) ve kısa darbeleri tekrar başvur. Bu noktada kalır herhangi bir sinaptik bağlantı büyük olasılıkla monosynaptic. Farmakolojik antagonistleri kalır sinaptik bağlantıları kimyasal doğası TTX içinde test etmek için dolaşım tuz ekleyin.
Not: optogenetics ve floresan nöronlar hedefleme birleştirilirken, ısrarla nöronlar presynaptic nüfusa kaydı elde etmek çalışırken değil harekete geçirmek için önemli olabilir. Bu sinaptik depresyona yol açabilir ve bağlantıları görmek zorlaştırır. CsChrimson geniş yeşil flüoresan protein aralığı uzanır bir uzun uyarma grup olduğundan, kırmızı bir fluorophore nöronlar ve channel2rhodopsin görselleştirmek için kullanılabilir (Ch2R) hücre popülasyonlarının heyecanlandırmak için kullanılabilir. Bunu yaparken belirli genetik ve bir özel filtre küp gerektirir. Uygun sinekler üretmek için kırmızı fluorophore (RFP ya da mCherry) hızlı uçar LexA veya Q sistem ikili ifade sistemleri altında yapmak. Bunlar bir Gal4 organizatörü ve UAS-Ch2R ile UAS-NaChBac efektör gen ifade sinekli geçti gerekecektir. Epifluorescence için en uygun filtre küp kırmızı fluorophore heyecanlandırmak için ama heyecanlandırmak Ch2R. buna ek olarak değil bir dar uyarma aralığı vardır, filtre kümesi verilmiş kadar ışık toplamak için uzun pası emisyon filtre içermelidir. Bölüm numaraları et580/25 x ve t600lpxr (49306 set) üzerinden dahil Chroma kümeden özel filtre kullandık ama bir et610lp bariyer/emisyon filtreli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TERPS mono - ve polysynaptic katkıları sinaptik bağlantıları nöronlar arasında ayırt etmek için kullanılır. Zayıf bir hücre uyarılması doğrudan bağlantıyı sınamak için kullanılan iken, büyük presynaptic faaliyet kez sürüş polysynaptic bağlantıları (şekil 1A) acemi. TTX-duyarlı sodyum kanal NaChBac ve bir optogenetic aktivatör ortak ifade ve bağlantıları polysynaptic bağlantıları (şekil 1B) ortadan kaldırmak için TTX varlığında test TERPS çalışır. TTX TERPS (şekil 2A) için uygun bir hazırlık yapma aksiyon potansiyelleri Drosophila beyinde etkili bir şekilde engeller. NaChBac sodyum kanalının transgenik ifade uyarılabilirlik nöronlar içinde ve bir büyük Plato potansiyel (şekil 2B) sonuçlarında kurtarır.
Yerel interneurons (LN) antennal LOB koku stimülasyon (şekil 3A) sağlam yanıtlarını göster. Ancak, bireysel EPSPs LN soma kolayca çözülmüş değildir çünkü böyle yanıtlar doğrudan koku reseptör neuron girdileri (ORN) ortaya çıkar ya da dolaylı olarak projeksiyon nöronlar (PN) (3B rakam) yolu ile giriş Eğer belirsiz kalır. TERPS kullanarak, burada gösterildiği ORNs gerçekten yapmak Ins (şekil 3 c) ile direkt sinaptik bağlantıları.
TERPS bir benzersiz özellikle GABA ya da neuromodulators serotonin gibi ile oluşabilir ekstra sinaptik ses iletim çözme yeteneğini özelliktir. Drosophila antennal LOB serotonerjik nöron (CSDn) uyarılması uyarma ve inhibisyon bir yerel interneuron (şekil 4A ve 4B şekil) içinde sonuçlanır. Uyarma eksitatör verici asetilkolin tarafından meditasyon ve inhibisyon serotonin tarafından (şekil 4 c ve şekil 4 d) neden olur. TERPS polysynaptic bağlantıları (şekil 4E) ortadan kaldırarak bağlantıları monosynaptic olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. TTX içinde güçlü bir inhibisyon hala doğrudan belirli serotonerjik nöron (şekil 4F ve şekil 4 g) etkinleştirme gelen geldiğinde düşündüren FLN görülmektedir. Bu bağlantı serotonin antagonisti methysergide tarafından engellenir. Asetilkolin tarafından aracılı eksitatör synapse TTX polysynaptic kaynaklardan ortaya çıkan düşündüren, elendi.
Resim 1 : TERPS polysynaptic bağlantıları ortadan kaldırır ve monosynaptic girişleri izole ediyor. (A). presynaptic etkinliği artan polysynaptic bağlantıları işe gösteren bir şematik diyagramı. (B). nasıl TERPS nöronlar spiking etkinliğinde ortadan kaldırmak için TTX kullanarak polysynaptic katkıları kaldırmak için gösteren bir diyagram. Uyarılabilirlik sadece o zaman-ebilmek var olmak heyecanlı optogenetically nöronlar bir nüfus içinde geri yüklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : NaChBac nöronal uyarılabilirlik geri yükler. Drosophila nöronlar. (A) 1 µm Drosophila nöronlarda spiking TTX onuntemsilcilerini uygulanması. Spontan aktivite ve koku uyarılmış inhibisyon TTX içinde ortadan kalkar. (B) NaChBac ve csChrimson CSDn ifade edilir ve beyin TTX için yararlanılır. csChrimson uyarım depolarizes CSDn ve bir eşiği geçtikten sonra orada büyük doğrusal olmayan CSDn membran gerilim arttı. Bu hızlı depolarizasyon bir plato gibi potansiyel (iç metin) kabul ettiğiniz anlamına gelir. Her renk simülasyon yoğunluklarda arasında gerilim iç metin aynı renkte karşılık gelir. Bu şekil Zhang ve Gaudry 20169değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : TERPS ortaya ORNs ve Göçmenlik arasında monosynaptic bağlantı. (A) A örnek kayıt bir koku yanıt bir LN. gösterilen Bu yanıtı mono - olabilir veya doğada polysynaptic. (B) TERPS ORN LN synapse için test edilebilir. TTX aksiyon potansiyelleri ve hazırlık tüm hücrelerdeki uyarılabilirlik engellemek için kullanılır. Uyarılabilirlik sadece NaChBac sodyum kanalı ile ORNs içinde geri yüklenir. ORNs sonra channelrhodopsin ile sinaptik yayın temin için heyecanlı. Sinaptik olaylar post-synaptically bütün hücreli kayıtları kullanılarak ölçülür. (C) TERPS ORN LN synapse için monosynaptic olduğunu ortaya koymaktadır. TERPS da synapse kolinerjik ve nikotinik reseptör antagonisti mecamylamine (200 µM) tarafından bloke olduğunu göstermek için Farmakoloji ile kombine edilebilir. Dikey gri çubuk ORN stimülasyon zamanlama belirtir. Bu şekil Zhang ve Gaudry 20169' değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : TERPS toplu ya da güç iletim serbest bırakmak--dan düzenleyici nöronlar için hassas. (A) bir aksiyon potansiyeli üzerinden kaydedilen LN Drosophila antennal LOB CSDn sonuçlarında uyarılması. Böylece CSDn stimülasyon subthreshold bir faaliyet sonuçları (B) LN hyperpolarized. LN yanıt yavaş hyperpolarization tarafından takip hızlı bir depolarizasyon oluşur. Gri bar CSDn uyarım zamanı gösterir. Methysergide (50 µM), geniş 5-HT reseptör antagonisti yavaş hyperpolarization engeller, ancak depolarizasyon üzerinde bir etkisi yoktur. Mecamylamine doğada kolinerjik olduğunu düşündüren hızlı depolarizasyon engeller. (C) TERPS hangi kimyasal CSDn LN synapse için mono-polysynaptic karşı bileşenleridir gidermek için kullanılabilir. (D) CSDn huzurunda TTX uyarılır ve postsinaptik LN yanıt-e doğru tüm hücreli kayıtları ölçülür. Hyperpolarization doğada monosynaptic düşündüren TTX devam ederse. Bu hyperpolarization de methysergide, serotonerjik şanzıman ile tutarlı tarafından engellenir. TTX içinde kalır kısa depolarizasyon büyük olasılıkla kaplin, nikotinik antagonistleri tarafından bloke değil olarak elektrik boşluk tarafından aracılık ettiği. Bu şekil Zhang ve Gaudry 20169' değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek dosya 1: Drosophila folyo. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Ek dosya 2: Fizyoloji odası. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TERPS analiz tanımlanan neurons arasındaki sinapslar tespiti etkinleştirerek çatlama devre için kullanılan güncel teknikler övgü. Özellikle, yaklaşım geniş aksiyon potansiyelleri ile TTX uyarılabilirlik nöronların TTX-duyarlı sodyum kanalı NaChBac ile select bir popülasyondaki geri yüklerken susturmak tarafından monosynaptic bağlantıları ortaya koymaktadır. Postsinaptik olaylar bütün hücreli kayıtları ile izlenir iken sinaptik yayın optogenetic stimülasyon tarafından elde edildi. TERPS kendini KAVRAMAK gibi diğer yaklaşımlar üzerinden toplu olarak hassas veya ses iletim daha uzun mesafeler ve farmakolojik işlemler gerçekleştirme olanağı elde edildi tarafından ayırt eder. Teknik istihdam nispeten basittir ve synapse öncesi ve sonrası sinaptik parçaların üzerinde çift bütün hücreli kayıtları elde etmek daha daha uygun olduğunu optogenetic uyarılması için yalnızca bir kayıt elektrot ve bir ışık kaynağı gerektirir. Bir temel TERPS aksiyon potansiyelleri kolayca okudu sisteminde TTX tarafından engellenen gereksinimdir. Ancak TTX taksonomik kültürlenebilen geniş bir aralığında nöronlar üzerinde davrandığından, TERPS geniş iki memeli ve omurgasız modeli sistemde uygulanan olabilir yüksektir.
TERPS, stimülasyon sözde presynaptic nüfusun veya kayıt postsinaptik hedefleri için görgü ya kolaylaştırmak için bir dizi kolayca değiştirilebilir. Burada, çeşitli mekanizmalar tarafından harekete geçirmek mümkün olsa da bir optogenetic aracı hedef nüfus uyarmak için kullanılan. Sinir stimülasyonu, duyusal aksonlar, örneğin, rutin çalışmalarda Drosophila16 antennal sinir iletim ve periferik sinirler mechanosensory nöronlar içeren dahil olmak üzere diğer duyu sistemleri, uygundur. Drosophila içinde işlevsel bağlanırlığını sınama için benzer bir yaklaşım GCaMP kalsiyum göstergeleri nöron bir nüfus etkinliği başka bir nüfus ionotropic purinoceptor P2X2 ve ATP uygulama2yolu ile sürüş sırasında dile getirdi. Bu yaklaşım sadece NaChBac transgene bir neuron P2X2 reseptör ve tamamen yama-Alerjik bir yöntem için başka bir nüfus GCaMP ile birlikte ifade ederek TERPS ile uyumlu olmalıdır. Ancak, sadece bir uyuşturucu (DREADDs)17,18tarafından aktive muscarinic tabanlı tasarımcı reseptörleri gibi daha yavaş depolarizations neden yaklaşımlarla dikkatli alınmalıdır. Yavaş depolarizasyon NaChBac inactivation aksiyon potansiyeli nesil önce neden olabilir.
TERPS için benzer yöntemler memeli sistemlerinde istihdam edilmiştir. Bu tür teknikler TTX ve channelrhodopsin arasındaki bağlantı dışarı eşlemek için birleştirir. Channelrhodopsin harekete geçirmek yalnız genellikle sinir hücreleri yeterince depolarize değil, ve böylece potasyum kanal engelleyici 4-AP olmak uygulanan TTX ile yayın19,20,21temin için. Bu birçok sinapslarda çalışsa da, reseptör aşağı akım hedef 4-AP hassas potasyum kanal ise bazı metabotropic sinapslar çalışmayabilir. Örneğin, güveler koku yanıtının serotonerjik modülasyon doğrudan böyle bir 4-AP hassas K+ akım (ıA)22modülasyon üzerinde dayanır. Bu yaklaşım aynı zamanda CSDn LN synapse (veri gösterilmez) için de işe yaramadı. Böylece, TERPS yaygın olarak kullanılan diğer yöntemlerine göre daha az farmakolojik müdahale gerektiren bir yararı vardır ve daha geniş veya sinapslarda işe yaramayabilir.
Düşünülmesi gereken TERPS için bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, NaChBac kanal boyunca geliştirme kronik ifade potansiyel yan etkileri olabilir. Uygun devre montaj ve işlev karşılaştırarak nöronlar arasında denetim etkinliğini NaChBac yapı eksik uçar ve yapı TTX yokluğu ile uçar onaylanabilir. Bu tür sorunlar önlemek için NaChBac transgene ifade geçici sıcaklığa duyarlı GAL4 önleyici GAL8023ifade denetlenebilecek. Ayrıca, bir synapse sadece bir devlet bağlı şekilde gözlem yapılırsa, ağ etkinliğini TTX ile bastırarak böyle bir bağlantı gizlemek akla yatkın. Bu negatif bir sonuç bir bağlantı yokluğu kanıtı değildir, ancak TERPS ile büyük olasılıkla gözlenen olumlu bir bağlantı gerçek mono sinaptik bağlantı gösterir vurgulamak önemlidir.
TERPS verici yetenek gösterebilir iken NaChBac yavaş kanal dinamikleri postsinaptik ortak açıkça, etkilemek için bir neuron yayın ve onun harekete geçirmek ile ilişkili Yaylası potansiyeller daha az klasik çalışma için geçerli hale neurotransmission. TERPS için daha hızlı değiştiren bir yaklaşım, daha doğal verici TTX-duyarlı sürümü olarak bir endojen Drosophila sodyum kanal para NaChBac karşı ifade etmek olacaktır. Bu değişiklik presynaptic hücredeki doğal spiking aktivite neden ve ağ etkinliğini yokluğunda sinaptik iletimi daha geleneksel analiz izin. Bu hangi alabilme presynaptic faaliyet polysynaptic ağlar işe olmadan geniş bir arzu olur, oran kodlama sinapslarda çalışmaları için büyük bir potansiyel var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
El yazması üzerinde Joshua Singer, Jonathan Schenk yanı sıra düşünceli gözden geçirenler yorum için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Ben beyaz ve Harold Zakon tekniği üzerine tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum. Jonathan Schenk verileri şekil 3Aiçin sağlanan. Bu eser Whitehall Vakfı Hibe ve NIH R21 QG için tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
