Summary
Denna artikel innehåller en metod för att testa monosynaptic kopplingarna mellan nervceller genom att anställa tetrodotoxin och tetrodotoxin-resistenta natrium kanal, NaChBac.
Abstract
Här, används en ny teknik som kallas Tetrotoxin (TTX) konstruerade motstånd för sondering synapser (TERPS) för att testa för monosynaptic anslutningar mellan målet nervceller. Metoden bygger på samtidig uttryck av en transgen aktivator med tetrodotoxin-resistenta natrium kanal, NaChBac, i en specifik presynaptiska neuron. Anslutningar med förmodad efter synaptic partners bestäms av hela-cell inspelningar i närvaro av TTX, som blockerar elektrisk aktivitet i nervceller som inte uttrycker NaChBac. Detta tillvägagångssätt kan ändras för att fungera tillsammans med aktivator eller kalcium imaging som reporter av anslutningar. TERPS läggs till den växande uppsättningen verktyg tillgängliga för att fastställa anslutning inom nätverk. TERPS är dock unikt i att det rapporterar också tillförlitligt bulk- eller volym överförings- och spridningseffekter överföring.
Introduction
Ett viktigt mål för neurovetenskap är att kartlägga sambanden mellan nervceller att förstå hur information flödar genom kretsar. Många metoder och resurser har blivit tillgängliga för funktionella anslutningstestet mellan nervceller i en rad modell system1,2. För att generera de noggrannaste kopplingsscheman använder elektrofysiologi, är det viktigt att lösa om observerade sambanden mellan två celler är direkta och monosynaptic kontra indirekta och polysynaptic. En guld-standard för att göra denna distinktion i däggdjur nervceller är att mäta latensen mellan enstaka action potentials i presynaptiska cellerna och uppkomsten av excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) i andra neuron. Monosynaptic anslutningar bör ha kort latens i några millisekunder och låg variabilitet3. Detta tillvägagångssätt kan vara komplicerat i ryggradslösa nervceller eftersom synapser kan förekomma i deras dendriter långt ifrån den somatiska inspelning webbplats, orsakar förseningar i upptäckt tack vare lång electrotonic distanserar mellan postsynaptiska conductances och inspelningen elektroden. Sådana förseningar kan införa tvetydighet om poly-kontra monosynaptic bidrag. Dessutom små synaptic evenemang kan förfalla innan du når webbplatsen somatiska inspelningar och körning starkare presynaptiska aktivitet, sannolikt att rekrytera polysynaptic händelser.
Olika tekniker har utvecklats för att testa för monosynaptic anslutningar i ryggradslösa djur. En strategi använder hög tvåvärda ering lösningar (Hi-Di) som innehåller överflödiga Mg++ och Ca++. Denna lösning blockerar polysynaptic anslutningar genom att minska release sannolikheten och ökande aktionspotential tröskeln att gynna upptäckten av monosynaptic input4,5. Fastställa det exakta förhållandet mg++ till Ca++ krävs, är dock inte trivialt och polysynaptic bidrag kan kvarstå för även en blygsam stimulering6. En alternativ metod som kallas GFP beredning över Synaptic Partners (grepp) drar nytta av närheten mellan pre- och postsynaptiska membran finns på synapser att härleda en monosynaptic anslutning 7. Här, en komponent av grönt fluorescerande protein (GFP) uttrycks i en nervcell, och den kompletterande fragmentet av molekylen uttrycks i en förmodad postsynaptiska partner. Förekomsten av fluorescens visar att de två nervcellerna i nära nog närhet att möjliggöra beredning av GFP molekylen och antyder existensen av en synaps. GREPP kan rapportera synapser falskt, dock om två celler har nära apposed membran, som i en nerv eller frånskilja. Varianter av grepp eliminera sådana falska positiva genom tjudra den presynaptiska fragmentet av GFP direkt till synaptobrevin, vilket möjliggör beredning endast på aktiva synapser8. Medan grepp och dess varianter har varit avgörande för att fastställa funktionella anslutningar i den Drosophila CNS, kan vissa anslutningar inte göras synlig av grepp om avstånden mellan pre- och postsynaptiska partners är relativt stor. Detta är särskilt relevant för bedömningen av volym överföring är associerad med neuromodulation9 eller GABAergic hämning10.
Här demonstreras en kompletterande och ny teknik för att testa monosynaptic direktförbindelser i Drosophila CNS. Denna metod, som kallas Tetrodotoxin konstruerade motstånd för sondering synapser (TERPS), fungerar genom samtidig uttryck av tetrodotoxin (TTX)-resistenta natrium kanal, NaChBac och en optogenetic aktivator i en presynaptiska cellen under inspelning från förmodade postsynaptiska partners9. I närvaro av TTX dämpas all potentiell handling-medierad aktivitet i celler än de som uttrycker NaChBac. Den NaChBac kanalen återställer selektivt retbarhet i den riktade presynaptiska cell(er) tillåter ljus-framkallat synaptisk transmission. Denna metod tillåter stark aktivering av de presynaptiska neuronerna, sådan att anslutningar kan lösas postsynaptically genom somatiska inspelning samtidigt minska sannolikheten för att rekrytera polysynaptic kretsar. Viktigast av allt, denna teknik tillåter studier av volym överföring och avslöjar spridningen av sändare som frigörs från en enda neuron i hela en krets. TERPS kan dessutom avslöja kemiska beskaffenhet anslutning via konventionell farmakologi. TERPS är lämplig för användning i alla modellsystem som tillåter transgena uttrycket av TTX-okänsliga natriumkanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered flugor och identifiera GAL4 promotorn linjer
- Välj en GAL4 promotorn linje och korsa det med flugor bär både den UAS-NaChBac transgenens och en optogenetic transgenens för aktivering.
Obs: UAS-CsChrimson11 väljs på grund av dess hög konduktans och den lätthet med vilken den aktiverar NaChBac-medierad handlingspänningar. Från Bloomington lager databasen finns både UAS-NaChBac och UAS-CsChrimson. - Förbered all-trans-retinal som stamlösning i etanol (35 mM) och förvara lösningen i frys vid-20 ° C.
- Blanda 28 µL av beståndet till cirka 5 mL återfuktad potatis flake mat och lägga till denna blandning till toppen av en flaska med konventionella Drosophila medium.
- Höja vuxna flugor uttrycker csChrimson på livsmedel som innehåller 0,2 mM all-trans-retinal för 1 – 3 dagar11.
2. Förbered TTX lager
- Skapa en stamlösning 1 mm TTX i destillerat eller avjoniserat vatten. Förvara lösningen i kylskåp lab för flera månader. Kontrollera den institutioner politiken angående lagring av TTX som många institutioner klassificera TTX som ett farligt eller kontrollerade ämne.
3. Förbered flugor för elektrofysiologi
- Samla in 1 – 3 dagars gamla vuxen flyger som föds upp på maten med all-trans-retinal.
Obs: Se Murthy och Turner i 2013 för en detaljerad beskrivning av patch fastspänning Drosophila nervceller12,13. - Sätta flugorna i en injektionsflaska för scintillation. Placera injektionsflaskan på is för 1 min att immobilisera flugorna.
- Använd grova pincett för att infoga en fluga i en skräddarsydd inspelning kammare. Avdelningen består av en 3 ½ ”cirkel laserskurna från 1/16” akryl. Skära ett hål i ¾ ”är in till centrum där en anpassad folie är fäst med 2-komponent epoxi. Folien innehåller ett triangulärt formade hoppas att flugan sätts in.
- Applicera vax eller UV härdande epoxi runt djuret att ordentligt förankra det i inspelning kammaren.
- Belysa preparatet med en svanhals optisk fiber för visualisering under ett stereomikroskop. Ställ in svanhals fibrerna för sned belysning genom att justera dem så att de lyser upp i farten direkt från sidan.
- Justera ljusnivån till lägsta möjliga inställning som fortfarande gör tydlig visualisering av i farten. Detta ljusintensiteten kommer att variera mellan enskilda experiment.
Obs: Detta protokoll kan anpassas med hjälp av en i situ hjärnan explant metod14. - Hämta extern inspelning saltlösning. Saltlösning innehåller i mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymetyl) metyl-2-aminoethane-sulfonsyra, 8 trehalos, 10 glukos, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2och 4 MgCl2 (justerat till 270 – 275 mΩ). Saltlösning är bubblade med 95% O2/5% CO2 (carbogen) och har ett pH justeras till 7,315.
- Placera 4-6 droppar extracellulära inspelning saltlösning över flyga beredning. Vid denna punkt, öka ljusnivån på mikroskopet dissektion för bättre synlighet.
- Vässa en volframtråd med hjälp av elektrolys. För att göra tråden, förbereda en mättad lösning av KNO3 och tillämpa cirka 20 V för växelström medan doppa spetsen av tråden i lösningen 20 gånger för 100 ms varje tills spetsen är skärpt. Använd de vässade volframtråd ta bort nagelband på huvudet av i farten och därmed utsätter hjärnan.
- Ytterligare Utsätt hjärnan genom att ta bort luftstrupen och fett organ som omger den. Om åtkomst till antennal loberna, använda en böjd volframtråd eller liknande verktyg att försiktigt stoppa antenner under folien inspelning kammare för att öka synligheten. Använd vass pincett för att försiktigt riva bort den gliaceller mantlar som täcker området av intresse där inspelningar kommer att göras.
- Överföra inspelningen kammaren till elektrofysiologi riggen. Omedelbart börja perfusion med extern inspelning saltlösning bubblade med carbogen att bevara hjärnan. Reservoaren saltlösning placeras ovanför Mikroskop scenen och gravitation-matas preparatet. Använda en vakuum linje och en 2 L Erlenmeyerkolv för att samla den avfall saltlösning.
4. Skaffa hela-cell inspelning
- Dra patch pipetter kommersiella pipett avdragare. Konsultera manualen för inställningar för att uppnå en lämplig pipett med en tip motstånd nära 7 mΩ.
- Tillsätt 4 µL av intern inspelning lösning i en patch-pipett. Den interna saltlösning består av 140 kalium aspartat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 Na3GTP, 1 EGTA och 1 KCl i mM.
- Ställa in patch clamp förstärkare för hela-cell inspelning. Noll förstärkarens offset och ställa förstärkaren till leverera test pulser. Här används en AM system Patch clamp förstärkare 2,400.
- Applicera övertryck genom pipetten och närma sig cellen. Använd en micromanipulator för att rikta pipetten och kontakta cellen. Släppa övertryck. Uppsättning innehav potential av membranet till -60 mV. Pipetten bör bilda en gigaohm tätning med cellens membran vilket framgår av en låg sub-picoamp håller nuvarande.
Obs: Om med GFP guidad cell inriktning, försök minimera användningen av epifluorescerande ljus att förhindra ChR2 aktivering och potentiella synaptic depression. Även vänta några minuter innan du applicerar steg 5. - Ställa in förstärkaren till leverera test pulser från -50 mV till -60 mV. Denna inställning är standard på patch-clamp förstärkare. Test pulser kommer att avslöja en stor capacitative övergående som representerar nödvändig att debitera patch pipetten. Ta bort capacitative transienter genom att justera kapaciteten ersättning rattarna på AM 2400 eller liknande förstärkare.
- Gäller kort pulser av undertryck att brista cellmembranet och få hela-cell konfiguration.
Obs: En konfiguration för hela cellen observeras när det finns en stor ökning av capacitative transienter som visar kapacitansen av neuron. En liten ökning av innehavet nuvarande (baslinje) kommer sannolikt också att observeras. Ställa in förstärkaren till nuvarande klämma läge och justera cellens potential att -50 till -60 mV.
5. testa Synaptic anslutning
- Konfigurera datainsamlingssystemet (DAQ) för att utlösa en LED driver för att generera ljuspulser. Här används ett nationellt instrument DAQ system med Matlab för att leverera en analog signal till en LED-driver. LED intensitet justeras via den analoga signalen till föraren. LED är en 620-630 nm våglängd LED.
- Placera den motorstarka röda lysdioden direkt under förberedelserna. Justera ljusstyrkan så att 0.238 mW/mm2 når i farten.
- Aktivera presynaptiska neuroner under inspelning från den postsynaptiska cellen av intresse. Uppnå cell aktivering optogenetically, pharmacogentically, eller via nervstimulering. Här tillämpas csChrimson och korta pulser med rött ljus.
Obs: Synapsförbindelser kan övervakas antingen i nuvarande klämman som EPSPs eller spänningen klämman som EPSCs. En synaptic anslutning bör vara synlig innan du applicerar TTX som svar på en 40 ms ljuspuls. Om ingen anslutning observeras, är det osannolikt att nervceller synaptically anslutna antingen mono - eller polysynaptically. Potentiella innehav kan justeras för att betona retande eller hämmande anslutningar med detta. - Om en anslutning observeras i fysiologisk koksaltlösning, lägga till TTX till perfusion systemet för att uppnå en slutlig koncentration på 1 Använd µM. en recirkulerande pump att fånga och återanvända den saltlösning för att bevara TTX. Den peristaltiska pumpen kommer att dra saltlösning badet och returnera den till reservoaren saltlösning.
- Justera pumpens hastighet för att ge en stark konstant vakuum som inte tillåter denna saltlösning nivå i badet att stiga och falla.
Notera: Tillämpningen av TTX bör resultera i upphörande med tillsatta aktivitet i neuron som övervakas i hela-cell. Detta bekräftar att tillräckligt TTX har lagts till i saltlösning. - Gäller kort pulser av rött ljus (40 ms för varje puls) igen. Vid denna punkt, en synaptic anslutning som förblir sannolikt monosynaptic. Lägg till farmakologiska antagonister till den återcirkulerande koksaltlösning att testa kemiska beskaffenhet de synapsförbindelser som finns kvar i TTX.
Obs: När du kombinerar optogenetik och fluorescerande inriktning av nervceller, kan det vara viktigt inte att envist aktivera presynaptiska befolkningen av nervceller samtidigt försöker få en inspelning. Detta kan leda till synaptic depression och gör det svårt att se anslutningar. Eftersom csChrimson har en lång excitation band som sträcker sig i stort sett in i spänna av grönt fluorescerande protein, en röd fluorophore kan användas för att visualisera nervceller och channel2rhodopsin (Ch2R) kan användas för att excitera cellpopulationer. Detta kräver viss genetik och ett anpassat filter kub. Generera lämpliga flugor, göra flugor som express röd fluorophore (RFP eller mCherry) under de LexA eller Q system binärt uttryck system. Dessa kommer att behöva passeras med flugor som uttrycker en Gal4 promotor och UAS-Ch2R och UAS-NaChBac effektor gener. Optimala filtret kuben för epifluorescence har ett smalt excitation utbud att excitera röd fluorophore, men inte excitera den Ch2R. Dessutom, filtrera uppsättningen bör innehålla ett långt pass utsläpp filter för att samla in så mycket utsända ljus. Vi använde ett anpassat filter från Chroma som inkluderade en del nummer et580/25 x och t600lpxr (från 49306 uppsättningen), men med ett et610lp barriär/utsläpp filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TERPS används för att skilja mellan mono- och polysynaptic bidrag i synaptiska kopplingar mellan nervceller. Även svaga stimulering av en cell kan användas för att testa direkta anslutningar, rekryterar körning större presynaptiska aktivitet ofta polysynaptic anslutningar (figur 1A). TERPS fungerar genom samtidig uttrycker TTX-okänsliga natrium kanal NaChBac och en optogenetic aktivator och testa anslutningar i närvaro av TTX att eliminera polysynaptic anslutningar (figur 1B). TTX blockerar effektivt handlingspänningar i Drosophila hjärnan, vilket gör det till en lämplig förberedelse för TERPS (figur 2A). Transgena uttrycket av NaChBac natrium kanal räddar retbarhet i nervceller och resulterar i en stor platå potential (figur 2B).
Lokala interneuroner (LN) i den antennal LOB Visa robust svar på olfactory stimulering (figur 3A). Eftersom enskilda EPSPs inte är lätt att lösa på de LN soma, förblir det dock oklart om sådana svar direkt uppkommer luktreceptor neuron input (ORN) eller indirekt ingång via projektion nervceller (PN) (figur 3B). Genom att använda TERPS, gör ORNs visas här, verkligen direkta synaptiska förbindelser med LNs (figur 3 c).
En unik funktion i TERPS är dess förmåga att specifikt lösa extra synaptic volym överföring som kan uppstå med GABA eller neuromodulators såsom serotonin. Stimulering av en serotonerga neuron (CSDn) i den Drosophila antennal LOB resulterar i en blandning av excitation och hämning i en lokala interneuron (figur 4A och figur 4B). Magnetiseringen är mediterade av den excitatoriska sändare acetylkolin och hämning orsakas av serotonin (figur 4 c och figur 4 d). TERPS kan användas för att avgöra om anslutningarna är monosynaptic genom att eliminera polysynaptic anslutningar (figur 4E). TTX följs fortfarande en stark hämning i de LN, föreslår den anländer från direkt från aktiveringen av en specifik serotonerga neuron (figur 4F och figur 4 g). Denna anslutning är blockerad av serotonin antagonist metysergid. Excitatorisk synaps medieras av acetylkolin eliminerades i TTX, tyder på att det uppstod från polysynaptic källor.
Figur 1 : TERPS eliminerar polysynaptic anslutningar och isolerar monosynaptic ingångar. (A). en schematisk bild som visar att ökande presynaptiska aktivitet kan rekrytera polysynaptic anslutningar. (B). ett diagram som illustrerar hur TERPS kan ta bort polysynaptic bidrag genom att använda TTX för att eliminera tillsatta aktivitet i nervceller. Retbarhet återställs uteslutande i en population av nervceller som sedan kan glada optogenetically. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : NaChBac återställer neuronal excitabilitet i Drosophila nervceller. (A) tillämpningen av 1 µm TTX avskaffar tillsatta i Drosophila nervceller. Både spontan aktivitet och lukt-framkallat hämning elimineras i TTX. (B) NaChBac och csChrimson uttrycks i CSDn och hjärnan utsätts för TTX. csChrimson stimulering depolarizes CSDn och efter en tröskel passeras, det finns stora icke-linjära ökade i CSDn membran spänningen. Denna snabba depolarisation utgör en platå-liknande potential (infälld). Varje färg över simulering stödnivåer motsvarar samma färg i den spänning infällt. Denna siffra har ändrats från Zhang och Gaudry 20169. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : TERPS avslöjar monosynaptic anslutningar mellan ORNs och LNs. (A) A prov inspelning visar ett lukt-svar i en LN. Detta svar kan vara mono - eller polysynaptic i naturen. (B) TERPS kan testas på ORN till LN synaps. TTX används för att blockera handlingspänningar och retbarhet i alla celler i preparatet. Retbarhet återställs uteslutande i ORNs via NaChBac natrium kanal. ORNs kan sedan vara upphetsad med channelrhodopsin att framkalla synaptic release. Synaptic händelser mäts post-synaptically använder hela-cell inspelningar. (C) TERPS avslöjar att ORN till LN synaps är monosynaptic. TERPS kan också kombineras med farmakologi att visa att synapsen är kolinerga och blockerade av den nikotinhaltiga receptorantagonist mekamylamin, reserpin (200 µM). Det vertikala grå fältet anger tidpunkten för ORN stimulering. Denna siffra har ändrats från Zhang och Gaudry i 20169. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : TERPS är känslig för bulk eller volym överföring release från immunmodulerande nervceller. (A) stimulering av CSDn resulterar i en aktionspotential från en inspelad LN i den Drosophila antennal LOB. (B) The LN är hyperpolarized så att CSDn stimulering resulterar i en subthreshold verksamhet. LN svaret består av en snabb depolarisation följt av en långsammare hyperpolarisering. Det grå fältet betecknar tiden för CSDn stimulering. Metysergid (50 µM), en bred 5-HT-receptorantagonist, blockerar den långsamma hyperpolarisering men har ingen effekt på depolarisation. Mekamylamin, reserpin blockerar den snabb depolarisation tyder på att det är kolinerga i naturen. (C) TERPS kan användas för att lösa som kemiska komponenterna i CSDn till LN synaps är mono-kontra polysynaptic. (D) The CSDn stimuleras i närvaro av TTX och postsynaptiska LN Svaren mäts i hela-cell inspelningar. Hyperpolarisering kvarstår i TTX tyder på det är monosynaptic i naturen. Detta hyperpolarisering blockeras också av metysergid, konsekvent med serotonerg transmission. Den korta depolarisation som återstår i TTX medieras troligen av elektriska gap koppling, eftersom det inte blockeras av nicotinic antagonister. Denna siffra har ändrats från Zhang och Gaudry i 20169. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Drosophila folie. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 2: fysiologi kammare. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TERPS analys komplimanger aktuella tekniker som används för krets sprickbildning genom att aktivera upptäckt av synapser mellan identifierade nervceller. Specifikt avslöjar metoden monosynaptic anslutningar av i stort sett ljuddämpningssystem handlingspänningar med TTX samtidigt återställa retbarhet i en Välj population av nervceller med TTX-okänsliga natrium kanal NaChBac. Synaptic release framkallas genom optogenetic stimulering medan postsynaptiska händelser övervakas med hela-cell inspelningar. TERPS skiljer sig från andra metoder såsom grepp genom att vara känslig för bulk eller volym överföring framkallas på längre avstånd och förmågan att utföra farmakologiska manipulationer. Tekniken är relativt enkel att använda och kräver endast en inspelning elektrod och en ljuskälla för optogenetic stimulering, som är mer praktiskt än att få dubbla hela-cell inspelningar på både före och efter synaptic delar av synapsen. Ett grundläggande krav på TERPS är att nervimpulsernas lätt blockeras av TTX i systemet som studeras. Men, eftersom TTX fungerar på neuroner inom ett brett spektrum av taxonomiska phyla, det är troligt att TERPS skulle kunna tillämpas i huvudsak både däggdjur och ryggradslösa modell system.
TERPS kan enkelt ändras i ett antal sätt att underlätta antingen stimulering av förmodad presynaptiska befolkningen eller för inspelning från postsynaptiska mål. Här, användes ett optogenetic verktyg att stimulera målgrupperna, men aktivering genom olika mekanismer är möjligt. Nervstimulering av sensoriska axoner, exempelvis är rutin i studier av överföring från den antennal nerven i Drosophila16 och är lämplig i andra sensoriska system, inklusive perifera nerver som innehåller mechanosensory nervceller. En liknande inställning till testning funktionella anslutningsmöjligheter i Drosophila uttryckt GCaMP kalcium indikatorer i en population av nervceller under körning aktivitet i en annan befolkning via jonotropa purinoceptor P2X2 och ATP ansökan2. Denna strategi bör vara förenliga med TERPS helt enkelt tillsammans uttrycka den NaChBac transgenens med P2X2 receptorn i en neuron och GCaMP i en annan befolkning för en helt patch-fri metod. Försiktighet bör dock iakttas med metoder som orsakar långsammare depolarizations, t ex muskarin-baserade designern receptorerna enbart aktiveras av en designer drug (DREADDs)17,18. Långsam depolarisation kan leda till NaChBac inaktivering före aktionspotential generation.
Liknande metoder till TERPS har varit anställd i däggdjur system. Sådana tekniker kombinera TTX och channelrhodopsin för att kartlägga anslutning mellan nervceller. Channelrhodopsin aktivering ensam generellt depolariseras inte nervceller tillräckligt och därmed kalium kanal blockerare 4-AP är appliceras med TTX att framkalla release19,20,21. Även om detta fungerar på många synapser, fungerar det inte på vissa metabotropa synapser om nedströms målet av receptorn är en 4-AP känsliga kaliumkanal. Exempelvis bygger serotonerga modulering av lukt svar i malar direkt på modulering av sådan en 4-AP känsliga K+ ström (IA)22. Detta tillvägagångssätt också fungerade inte på CSDn till LN synaps (inga data anges). Således, TERPS har en fördel av kräver mindre farmakologisk intervention jämfört med andra vanliga metoder och kan fungera på bredare eller synapser.
Det finns några begränsningar för TERPS som bör övervägas. Först, det kan finnas potentiella biverkningar från kronisk uttryck för den NaChBac kanalen i hela utvecklingen. Ordentlig krets montering och funktion kan bekräftas genom att jämföra aktiviteten hos nervceller mellan kontroll flyger saknar den NaChBac konstruktionen och flyger med konstruktionen i avsaknad av TTX. För att undvika sådana problem, kunde uttryck för den NaChBac transgenens styras temporally via uttryck för den temperaturkänsliga GAL4 repressor, GAL8023. Dessutom, om en synaps observeras endast på ett sätt som staten-beroende, är det tänkbart att undertrycka nätverksaktivitet med TTX kan dölja sådan anslutning. Det är viktigt att betona att en positiv anslutning som observerats med TERPS sannolikt representerar en sann mono-synaptic anslutning, medan ett negativt resultat inte är bevis på frånvaro av en anslutning.
Medan TERPS kan avslöja förmågan hos sändaren släppa från en nervcell påverka postsynaptiska partner tydligt, långsam kanal dynamiken i NaChBac och de plateau potentials associerade med dess aktiveringen göra det mindre tillämplig till studien av klassiskt neurotransmission. En metod för att ändra TERPS för snabbare, mer naturlig sändare release kommer att uttrycka en modifierad TTX-okänsliga version av endogena Drosophila natrium kanal para i motsats till NaChBac. Denna förändring skulle resultera i naturalistiska tillsatta aktivitet i den presynaptiska cellen och tillåta mer konventionella analys av synaptisk transmission i avsaknad av nätverksaktivitet. Detta skulle ha stor potential för studier av kurs-kodning synapser, på vilka framkalla ett brett spektrum av presynaptiska aktivitet utan rekrytera polysynaptic nätverk vore önskvärt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Joshua Singer, Jonathan Schenk, samt eftertänksamma recensioner för synpunkter på manuskriptet. Vi vill också tacka Ben White och Harold Zakon för diskussioner på tekniken. Jonathan Schenk lämnade uppgifterna för figur 3A. Detta arbete stöds av en Whitehall Foundation Grant och en NIH R21 till QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
