Summary
Dit artikel biedt een methode om te testen de monosynaptic verbindingen tussen neuronen door tetrodotoxine en het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac.
Abstract
Hier, wordt een nieuwe techniek genoemd Tetrotoxin (TTX) Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken) toegepast om te testen voor monosynaptic verbindingen tussen neuronen van de doelgroep. De methode is gebaseerd op co uitdrukking van een transgene activator met het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac, in een specifieke presynaptische neuron. Verbindingen met vermeende post synaptic partners worden bepaald door geheel-cel opnames in aanwezigheid van de TTX, die blokken van elektrische activiteit in de neuronen die niet NaChBac doen uitdrukken. Deze aanpak kan worden aangepast voor het werken met elke activator of calcium imaging als een verslaggever van verbindingen. KERKEN wordt toegevoegd aan de groeiende verzameling van hulpprogramma's voor het bepalen van de connectiviteit binnen netwerken. KERKEN is echter uniek in die zin dat zij ook betrouwbaar bulk of volume transmissie en spill-over transmissie verslag.
Introduction
Een belangrijk doel van de neurowetenschappen is om de verbindingen tussen neuronen te begrijpen hoe informatie stroomt door schakelingen in kaart. Talrijke benaderingen en middelen zijn beschikbaar om te testen voor functionele verbindingen tussen neuronen in een waaier van model systemen1,2gekomen. Voor het genereren van de meest nauwkeurige schakelschema's met behulp van electrofysiologie, is het belangrijk om op te lossen of waargenomen verbindingen tussen twee cellen directe en monosynaptic versus indirecte en polysynaptic zijn. Een gouden standaard voor het maken van dit onderscheid in zoogdieren neuronen is voor het meten van de latentie tussen enkele action potentials in de presynaptische cellen en het begin van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs) in het tweede neuron. Monosynaptic verbindingen moeten korte latencies voor een paar milliseconden en lage variabiliteit3. Deze aanpak kan worden gecompliceerd in ongewervelde neuronen omdat synapsen op in hun dendrites ver van de somatische opname site treedt, veroorzaakt door vertragingen in de opsporing als gevolg van lange electrotonic afstanden tussen postsynaptisch conductances en de opname elektrode. Dergelijke vertragingen kunnen leiden tot dubbelzinnigheid over poly-versus monosynaptic bijdragen. Bovendien, kleine synaptic gebeurtenissen kan verval alvorens de site somatische opnames en rijden sterker presynaptische activiteit, dreigt te werven van polysynaptic evenementen.
Diverse technieken zijn ontwikkeld om te testen voor monosynaptic verbindingen in ongewervelden. Een benadering gebruikt hoge divalente kationen oplossingen (Hi-Di) met overtollige Mg++ en Ca++. Deze oplossing blokkeert polysynaptic verbindingen op vermindering release waarschijnlijkheid en toenemende actiepotentiaal drempel om de gunst van de detectie van monosynaptic input4,5. Bepaling van de precieze verhouding van Mg++ aan Ca++ vereist, echter, is niet triviaal en zelfs bescheiden stimulatie6polysynaptic bijdragen kunnen aanhouden. Een alternatieve benadering genaamd GFP reconstitutie in Synaptic Partners (greep) maakt gebruik van de nabijheid tussen pre-en postsynaptisch membraan gevonden op synapsen afleiden een monosynaptic verbinding 7. Hier, een onderdeel van de groen fluorescente proteïne (GFP) wordt uitgedrukt in een neuron en de aanvullende fragment van het molecuul wordt uitgedrukt in een vermeende postsynaptisch partner. De aanwezigheid van fluorescentie geeft aan dat de twee neuronen zijn genoeg dicht bij toestaan reconstitutie van het GFP-molecuul en impliceert het bestaan van een synaps. GREEP kunt melden synapsen ten onrechte, hoewel, als twee cellen hebben nauw apposed membranen, zoals in een zenuw of fascicle. Varianten van greep elimineren deze valse positieven door het binden van de presynaptische fragment van GFP rechtstreeks naar synaptobrevin, waardoor de reconstitutie alleen op actieve synapsen8. Terwijl greep en zijn varianten instrumentaal zijn bij het bepalen van de functionele connectiviteit in de Drosophila CNS, kunnen sommige verbindingen niet zichtbaar worden gemaakt door greep als de afstanden tussen de pre- en postsynaptisch partners is relatief groot. Dit is vooral relevant bij de beoordeling van volume transmissie neuromodulatie9 of10remming GABAergic zijn gekoppeld.
Hier blijkt een complementaire en nieuwe techniek voor het testen van directe monosynaptic verbindingen in de Drosophila CNS. Deze methode, genaamd tetrodotoxine Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken), werkt door co uitdrukking van de tetrodotoxine (TTX)-resistente natrium-kanaal, NaChBac en een optogenetic activator in een presynaptische cel tijdens het opnemen van vermeende postsynaptisch partners9. In aanwezigheid van de TTX, wordt alle actiepotentiaal-gemedieerde activiteit onderdrukt in cellen dan die uiting van NaChBac. Het NaChBac kanaal herstelt selectief prikkelbaarheid in de gerichte presynaptische cel(len), synaptische transmissie licht-opgeroepen het toelaat. Deze methode maakt sterke activering van de presynaptische neuronen, zodanig dat verbindingen postsynaptically kunnen worden opgelost door somatische opname terwijl het verminderen van de kans op polysynaptic schakelingen te werven. Nog belangrijker is, is deze techniek maakt de studie van volume transmissie en onthult de verspreiding van zender vrijgelaten uit een enkel neuron in een circuit. Bovendien kan de kerken de chemische aard van de verbinding via conventionele farmacologie onthullen. KERKEN is geschikt voor gebruik in elk modelsysteem waarmee de transgene uitdrukking van TTX-ongevoelig natrium kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prepareer vliegen en identificeren GAL4 promotor lijnen
- Selecteer een regel van de promotor GAL4 en het Kruis met vliegen met zowel de transgenic UAS-NaChBac en een optogenetic transgenic voor activering.
Opmerking: UAS-CsChrimson11 is geselecteerd vanwege haar hoge geleidbaarheid en het gemak waarmee het NaChBac-gemedieerde actie potentials activeert. Zowel UAS-NaChBac en UAS-CsChrimson zijn beschikbaar via de Repository van de voorraden Bloomington. - All-trans retinal bereiden als een stamoplossing in ethanol (35 mM) en bewaar de oplossing in de diepvries bij-20 ° C.
- Mix 28 µL van dit materieel in ongeveer 5 mL gerehydrateerd aardappel vlok voedsel en voeg dit mengsel aan de bovenkant van een flacon van conventionele Drosophila medium.
- Volwassen vliegen uiten van csChrimson over voedsel met 0,2 mM all-trans-retinale voor 1-3 dagen11te verhogen.
2. voorbereiding van de TTX voorraad
- Het maken van een stamoplossing van 1 mM TTX in gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Bewaar deze oplossing in een lab-koelkast voor enkele maanden. Controleer de instellingen beleid met betrekking tot de opslag van TTX zoals vele instellingen TTX als een stof gevaarlijk of gecontroleerde classificeren.
3. Prepareer vliegen electrofysiologie
- 1 – 3-daagse oude volwassene vliegt die zijn gerezen op het voedsel met all-trans-retinale verzamelen.
Nota: Verwijs naar Murthy en Turner in 2013 voor een gedetailleerde beschrijving van de patch klemmen Drosophila neuronen12,13. - Zet de vliegen in een flesje van glas scintillatie. Plaats de ampul op ijs voor 1 min te immobiliseren van de vliegen.
- Grof pincet een vlieg in de kamer van een op maat gemaakte opname invoegen gebruiken De kamer bestaat uit een 3 ½" cirkel laser gesneden uit 1/16" acryl. Knip een gat ¾" is in het midden waarop een aangepaste folie is aangesloten met 2-delige epoxy. De folie bevat een driehoekige vorm van hoop dat de vlieg wordt ingevoegd.
- Toepassing wax of UV drogende epoxy rond het dier om het stevig veilig binnen de kamer opnemen.
- Verlicht de voorbereiding met een zwanenhals optische vezel voor visualisatie onder een stereomicroscoop. De vezels van de zwanenhals voor schuine verlichting instellen door ze aan te passen zodat zij de vlieg rechtstreeks vanaf de kant verlichten.
- Pas het lichtniveau aan de laagst mogelijke instelling waarmee nog duidelijk visualisatie van de vlieg. Deze lichtintensiteit zal variëren van individuele experimenten.
Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast met behulp van een in situ hersenen explant methode14. - Opname van externe bron zoutoplossing halen. De saline bevat in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane-Sulfonzure zuur, 8 trehalose, 10 glucose, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2en 4 MgCl2 (aangepast aan 270-275 mΩ). De saline is borrelen met 95% O2/5% CO2 (carbogen) en heeft een pH aangepast aan 7.315.
- 4-6 druppels extracellulaire opname zoutoplossing op de vlieg voorbereiding plaatst. Op dit punt verhogen het lichtniveau bij de dissectie Microscoop voor betere zichtbaarheid.
- Verscherpen een wolfraam draad met behulp van elektrolyse. Om de draad, bereid een verzadigde oplossing van KNO3 en toepassen van ongeveer 20 V van AC-stroom terwijl het uiteinde van de draad in de oplossing 20 keer voor elke 100 ms dompelen totdat de tip is verscherpt. Gebruik de aangescherpte wolfraam draad te verwijderen van de epidermis op het hoofd van de vlieg en dus het blootstellen van de hersenen.
- Verder bloot de hersenen door het verwijderen van de luchtpijp en vet organen eromheen. Als toegang tot de antennal lobben, kunt een gebogen wolfraam draad of soortgelijke tool zachtjes plooi antennes onder de folie opname kamer om de zichtbaarheid te vergroten. Hiermee kunt u dat scherpe pincet zachtjes scheur weg het gliale omhulsel van het terrein van belang waar de opnames zullen worden gemaakt.
- De opname-zaal overbrengen in de elektrofysiologie tuig. Onmiddellijk start perfusie met opname van externe bron saline borrelen met carbogen voor het behoud van de hersenen. Het reservoir van de zoutoplossing wordt geplaatst boven in het werkgebied van de Microscoop en wordt zwaartekracht-gevoed aan de voorbereiding. Gebruik een vacuüm lijn en een erlenmeyer van 2 L te verzamelen het afval zoutoplossing.
4. het verkrijgen van geheel-cel opname
- Patch pipetten op een commerciële Pipetteer trekker trek. Raadpleeg de handleiding voor instellingen om een passende Pipetteer met een tip weerstand in de buurt van 7 mΩ.
- Voeg 4 µL van interne opnameoplossing in een patch pipet. De interne zoutoplossing bestaat uit 140 kalium aspartaat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA en 1 KCl in mM.
- Patch-clamp versterker voor geheel-cel opname instellen Nul van de versterker verschuiving en stel de versterker te leveren test pulsen. Hier, wordt een AM systemen Patch klem versterker 2.400 gebruikt.
- Toepassen van positieve druk via de pipet en aanpak van de cel. Gebruik een micromanipulator om de pipet direct en contact met de cel. Positieve druk vrij. Set het bedrijf potentieel van het membraan tot -60 mV. De pipet dient een zegel van de gigaohm met het celmembraan zoals blijkt uit een lage sub-picoamp huidige bedrijf vormen.
Opmerking: Als met behulp van GFP geleid cel targeting, probeer te minimaliseren gebruik van epifluorescerende licht ChR2 activering en potentiële synaptic depressie te voorkomen. Ook enkele minuten wachten voordat u stap 5. - Instellen van de versterker test pulsen om van te verlossen -50 mV tot -60 mV. Deze instelling is standaard op patch-clamp versterkers. Test pulsen zal onthullen een grote capacitative van voorbijgaande aard vertegenwoordigen de huidige nodig om te laden van de patch pipet. Verwijder capacitative transiënten door het aanpassen van de capaciteit compensatie knoppen op de AM 2400 of soortgelijke versterker.
- Toepassing korte pulsen van negatieve druk te scheuren van de celmembraan en geheel-cel configuratie te verkrijgen.
Opmerking: De configuratie van een hele cel wordt waargenomen wanneer er een grote stijging van de capacitative transiënten toont de capaciteit van het neuron. Een kleine toename van het huidige bedrijf (basislijn) zal waarschijnlijk ook worden waargenomen. De versterker aan huidige klem modus instellen en aanpassen van de cel kunnen -50 tot -60 mV.
5. de synaptische verbinding testen
- Configureren van de data (DAQ)-acquisitiesysteem te activeren van een LED-driver voor het genereren van lichte pulsen. Hier, wordt een nationale instrumenten DAQ-systeem gebruikt met Matlab te leveren van een analoog signaal aan een LED-driver. De LED-intensiteit wordt aangepast via het analoge signaal naar de chauffeur. De LED is een 620-630 nm golflengte LED.
- Plaats de high-powered rode LED direct onder de voorbereiding. De lichtintensiteit zodanig aanpassen dat 0.238 mW/mm2 de vlieg bereikt.
- Activeren presynaptische neuronen tijdens het opnemen van het postsynaptisch cel van belang. Bereiken van de cel activeren optogenetically, pharmacogentically, of via zenuwstimulatie. Hier, worden csChrimson en korte pulsen van rood licht toegepast.
Opmerking: Synaptic verbindingen kunnen worden gecontroleerd in het huidige klem als EPSPs of spanning klem als EPSCs. Een synaptische verbinding moet alvorens TTX in reactie op een lichte puls van 40 ms zichtbaar zijn. Als geen verbinding wordt waargenomen, is het onwaarschijnlijk dat de neuronen synaptically aangesloten of mono - of polysynaptically. Het bedrijf potentiële kan worden aangepast om te benadrukken excitatory of inhiberende verbindingen dienovereenkomstig. - Als een verbinding wordt waargenomen in normale zout, TTX toevoegen aan het systeem van de perfusie om een eindconcentratie van 1 µM. gebruik een circulatiepomp voor vastleggen en opnieuw gebruiken van de zoutoplossing om te besparen TTX. De slangenpomp zal de zoutoplossing trekken uit het bad en terug te sturen naar het zoute reservoir.
- Pas de snelheid van de pomp om een sterke constante vacuüm dat staat niet toe dat zoute niveau in het bad te stijgen en dalen.
Opmerking: De toepassing van de TTX moet leiden tot de beëindiging van de activiteit in het neuron die moet worden gecontroleerd in geheel-cel stekelige. Dit bevestigt dat er voldoende TTX is toegevoegd aan de zoutoplossing. - Korte pulsen van rood licht (40 ms voor elke pulse) opnieuw toepassen. Op dit punt een synaptische verbinding die blijft dreigt monosynaptic. Farmacologische antagonisten aan de recirculatie zoutoplossing om te testen de chemische aard van de synaptische verbindingen die blijven in de TTX toevoegen.
Opmerking: Bij het combineren van optogenetics en fluorescerende targeting van neuronen, mogelijk het belangrijk niet te hardnekkig activeren de presynaptische bevolking van neuronen terwijl het proberen om het verkrijgen van een opname. Dit kan leiden tot synaptic depressie en maakt het moeilijk om te zien van verbindingen. Omdat csChrimson een lange excitatie-band die zich over het algemeen in het bereik van groen fluorescent proteïne heeft uitstrekt, een rode fluorophore kan worden gebruikt voor het visualiseren van de neuronen en channel2rhodopsin (Ch2R) kan worden gebruikt voor het opwekken van cel populaties. Doen vereist specifieke genetica en een aangepast filter kubus. Maken voor het genereren van geschikte vliegen, vliegen die uitdrukking geven aan de rode fluorophore (RFP of mCherry) onder de LexA of Q systeem binaire expressiesystemen. Deze zal moeten worden gekruist met vliegen uiting geven aan de promotor van een Gal4 en UAS-Ch2R en UAS-NaChBac effector genen. De optimale filter kubus voor epifluorescence zal hebben een smalle excitatie-bereik tot prikkelen de rode fluorophore, maar niet prikkelen de Ch2R. Bovendien, een lange pass emissie filter voor het verzamelen van zoveel uitgestraalde licht moet worden opgenomen door de filter set. We gebruikten een aangepast filter instellen vanuit Chroma die opgenomen deel getallen et580/25 x en t600lpxr (uit de 49306 set), maar met een et610lp barrière/emissie filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KERKEN wordt gebruikt om te onderscheiden tussen mono- en polysynaptic bijdragen in synaptic verbindingen tussen neuronen. Terwijl de zwakke stimulatie van een cel kan worden gebruikt voor rechtstreekse verbindingen testen, werft rijden vaak grotere presynaptische activiteit polysynaptic verbindingen (figuur 1A). KERKEN werkt door mede uiting geven aan de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac en een optogenetic-activator, en het testen van verbindingen in aanwezigheid van de TTX te elimineren polysynaptic verbindingen (figuur 1B). TTX blokkeert effectief actie potentieel in de hersenen van de Drosophila , waardoor het een geschikte voorbereiding voor kerken (figuur 2A). Transgene expressie van het NaChBac natrium-kanaal redt prikkelbaarheid in neuronen en resultaten in een groot plateau potentieel (figuur 2B).
Lokale interneuronen (LN) in de antennal kwab Toon robuuste reacties op olfactorische stimulatie (figuur 3A). Omdat individuele EPSPs niet gemakkelijk opgelost in de LN-soma, blijft het echter onduidelijk of dergelijke reacties ontstaan vanuit olfactorische receptor neuron input (ORN) of niet indirect via projectie neuronen (PN) (figuur 3B input). ORNs hier is afgebeeld, maak met behulp van kerken, inderdaad directe synaptic verbindingen met LNs (Figuur 3 c).
Een uniek kenmerk van kerken is de mogelijkheid om op te lossen specifiek volume extra synaptische transmissie die bij GABA of neurotransmitters zoals serotonine optreden kan. Stimulatie van een serotonerge neuron (de CSDn) in de Drosophila antennal kwab resulteert in een mengsel van excitatie en inhibitie in een lokale interneuron (figuur 4A en figuur 4B). De excitatie door de excitatory zender acetylcholine is mediteerde en de remming wordt veroorzaakt door serotonine (figuur 4C en Figuur 4 d). KERKEN kan worden gebruikt om te bepalen of de verbindingen monosynaptic door het elimineren van polysynaptic verbindingen (figuur 4E). In TTX, is nog steeds een sterke inhibitie waargenomen in de LN, suggereert dat het komt uit rechtstreeks van de activering van een bepaalde serotonerge neuron (figuur 4F en Figuur 4 g). Deze verbinding wordt geblokkeerd door de serotonine antagonist methysergide. De excitatory SYNAPS door de acetylcholine-gemedieerde werd uitgeschakeld in de TTX, suggereert dat het is ontstaan uit polysynaptic bronnen.
Figuur 1 : Kerken elimineert polysynaptic verbindingen en isoleert monosynaptic ingangen. (A). een schematisch diagram toont dat het verhogen van de presynaptische activiteit polysynaptic verbindingen kan aanwerven. (B). een schematische weergave van hoe kerken polysynaptic bijdragen kunt verwijderen met behulp van TTX te elimineren blancobepalingen activiteit in de neuronen. Prikkelbaarheid is uitsluitend hersteld in een populatie van neuronen die vervolgens opgewonden optogenetically worden kunnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : NaChBac herstelt neuronale prikkelbaarheid in Drosophila neuronen. (A) de toepassingvan 1 µm die TTX schaft stekelige in Drosophila neuronen. Zowel spontane activiteit en geur-opgeroepen inhibitie worden geëlimineerd in de TTX. (B) NaChBac en csChrimson worden uitgedrukt in de CSDn en de hersenen is blootgesteld aan TTX. stimulatie van de csChrimson depolarizes de CSDn en na een drempel is overschreden, er is grote niet-lineaire steeg in de CSDn membraan spanning. Deze snelle depolarisatie vormt een plateau-achtige potentieel (inzet). Elke kleur over simulatie intensiteiten komt overeen met dezelfde kleur in het verzonken vlak van de spanning. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang en Gaudry 20169. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kerken onthult monosynaptic verbindingen tussen ORNs en LNs. (A) A monster opname toont een geur-reactie in een LN. Dit antwoord kunnen mono - of polysynaptic in de natuur. (B) kerken kan worden getest op de ORN aan LN synaps. TTX wordt gebruikt voor het blokkeren van actie potentials en prikkelbaarheid in alle cellen in de voorbereiding. Prikkelbaarheid is uitsluitend in de ORNs via het NaChBac natrium-kanaal gerestaureerd. De ORNs kunnen dan worden opgewekt met channelrhodopsin om te ontlokken synaptic release. Synaptic gebeurtenissen zijn gemeten post-synaptically met behulp van geheel-cel opnames. (C) kerken blijkt dat de ORN aan LN synapse monosynaptic is. KERKEN kunnen ook worden gecombineerd met farmacologie te laten zien dat de synaps cholinerge en geblokkeerd door de nicotinerge receptor antagonist mecamylamine (200 µM). De timing van ORN stimulatie geeft de verticale grijze balk. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang en Gaudry in 20169. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Kerken is gevoelig voor bulk of volume transmissie vrijlating uit f neuronen. (A) het stimuleren van de resultaten van de CSDn in een actiepotentiaal van een opgenomen LN in de Drosophila antennal kwab. (B) de LN is hyperpolarized, zodat de stimulatie van de CSDn resulteert in een subthreshold activiteit. De LN-reactie bestaat uit een snelle depolarisatie, gevolgd door een tragere hyperpolarisatie. De grijze balk duidt de tijd van CSDn stimulatie. Methysergide (50 µM), een ruime 5-HT-receptor antagonist, blokkeert de langzame hyperpolarisatie maar heeft geen effect op de depolarisatie. Mecamylamine blokkeert de snelle depolarisatie suggereren dat er cholinerge in de natuur. (C) kerken kan worden gebruikt om op te lossen die chemische bestanddelen van de CSDn naar LN synapse zijn mono-versus polysynaptic. (D) de CSDn wordt gestimuleerd in het bijzijn van de TTX en postsynaptisch LN reacties worden gemeten in geheel-cel opnames. De hyperpolarisatie blijft TTX suggereert dat het is monosynaptic in de natuur. Deze hyperpolarisatie is ook geblokkeerd door methysergide, consistent met serotonerge transmissie. De korte depolarisatie die blijft in de TTX opgeslagen is waarschijnlijk gemedieerd door elektrische kloof koppeling, als het niet wordt geblokkeerd door nicotinerge antagonisten. Dit cijfer is gewijzigd van Zhang en Gaudry in 20169. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1: Drosophila folie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestand 2: fysiologie kamer. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KERKEN analyse complimenten huidige technieken die worden gebruikt voor circuit kraken doordat de detectie van synapsen tussen geïdentificeerde neuronen. In het bijzonder blijkt de aanpak monosynaptic verbindingen door in grote lijnen silencing actie potentials met TTX wijl restoring prikkelbaarheid in een select aantal neuronen met de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac. Synaptic release wordt opgewekt door stimulatie van de optogenetic terwijl postsynaptisch gebeurtenissen worden gecontroleerd met de opnames van de gehele-cel. KERKEN onderscheidt zich van andere benaderingen zoals greep door zijn gevoelig voor bulk of volume transmissie ontlokte bij langere afstanden en de capaciteit voor het uitvoeren van farmacologische manipulaties. De techniek is relatief eenvoudig te gebruiken en vereist slechts één opname elektrode en een lichtbron voor stimulatie van de optogenetic, die meer haalbaar is dan het verkrijgen van dual geheel-cel opnamen op zowel pre- en post synaptic delen van de synaps. Een basisvereiste van kerken is dat actie potentials worden eenvoudig geblokkeerd door TTX in het systeem wordt bestudeerd. Maar omdat TTX op neuronen in een breed scala aan taxonomische stammen fungeert, het is waarschijnlijk dat kerken in grote lijnen kunnen worden toegepast op beide zoogdieren en ongewervelde modelsystemen.
KERKEN kan eenvoudig worden aangepast op een aantal manieren om hetzij de stimulatie van de vermeende presynaptische bevolking of voor opname van postsynaptisch doelstellingen. Hier, werd een optogenetic instrument gebruikt voor het stimuleren van de doelgroepen, hoewel activering door allerlei mechanismen mogelijk is. Zenuwstimulatie van sensorische axonen, bijvoorbeeld, is routine in studies van transmissie van de antennal zenuw in Drosophila16 en is geschikt in andere zintuiglijke systemen, met inbegrip van perifere zenuwen met mechanosensory neuronen. Een soortgelijke benadering van functionele connectiviteit testen in Drosophila uitgedrukt GCaMP calcium indicatoren in een populatie van neuronen tijdens het rijden van activiteit in een andere bevolking via de ionotropic purinoceptor P2X2 en ATP toepassing2. Deze aanpak moet verenigbaar zijn met kerken door het gewoon samen het uitdrukken van de transgenic NaChBac met de P2X2 receptor in een neuron en GCaMP in een andere bevolking voor een volledig patch-vrije methode. Echter moet voorzichtigheid worden genomen met benaderingen die trager depolarizations, zoals de uitsluitend geactiveerd door een designer drugs (DREADDs)17,18muscarinerge gebaseerde ontwerper receptoren veroorzaakt. Langzame depolarisatie kan leiden tot NaChBac inactivering vóór actiepotentiaal generatie.
Soortgelijke methoden om kerken zijn tewerkgesteld in zoogdieren systemen. Dergelijke technieken combineren TTX en channelrhodopsin in kaart te brengen verbindingen tussen neuronen. Channelrhodopsin activering alleen over het algemeen doet niet depolarize neuronen voldoende en dus de kalium kanaal blocker 4-AP met TTX te ontlokken release19,20,21worden toegepast. Terwijl dit op vele synapsen werkt, werkt het niet op sommige metabotropic synapsen als de downstream-doelstelling van de receptor een 4-AP gevoelige kalium-kanaal is. Bijvoorbeeld, afhankelijk serotonerge modulatie van olfactorische antistofrespons nachtvlinders van direct modulatie van dergelijke een 4-AP gevoelige K+ huidige(Ia)22. Deze aanpak werkte ook niet op de CSDn naar LN synapse (gegevens niet worden weergegeven). Dus kerken heeft een voordeel van vereisen minder farmacologische interventies ten opzichte van andere veelgebruikte methoden en breder bereik of synapsen kan werken.
Er zijn een paar beperkingen aan kerken die moeten worden overwogen. Ten eerste kan er mogelijke bijwerkingen van chronische expressie van het NaChBac kanaal in de gehele ontwikkeling. Juiste circuit vergadering en functie kunnen worden bevestigd door het vergelijken van de activiteit van neuronen tussen controle vliegt ontbreekt de NaChBac constructie en vliegt met de constructie bij gebrek aan TTX. Om te voorkomen dat dergelijke problemen, kon expressie van de NaChBac transgenic stoffelijk worden aangestuurd via uitdrukking van het temperatuur-gevoelige GAL4 onderdrukker, GAL8023. Bovendien, als een synaps alleen in een status-afhankelijke manier waargenomen wordt, is het denkbaar dat het onderdrukken van de activiteit van het netwerk met de TTX een dergelijke verbinding misschien verbergen. Het is belangrijk om te benadrukken dat een positieve verbinding waargenomen met kerken waarschijnlijk een ware mono-synaptische verbinding, vertegenwoordigt terwijl een negatief resultaat geen bewijs van het ontbreken van een verbinding is.
Hoewel kerken het vermogen van de zender onthullen kan die vrijkomt bij een neuron beïnvloeden postsynaptisch partner duidelijk, de dynamiek van de langzame kanaal van NaChBac en het potentieel van de plateau de activering is gekoppeld dat het minder regels aan de studie van de klassieke transmissie. Een benadering tot het wijzigen van de kerken voor sneller, meer natuurlijke zender release zal worden om uit te drukken een gewijzigde TTX-ongevoelig versie van de endogene Drosophila natrium kanaal para in tegenstelling tot NaChBac. Deze wijziging zou resulteren in naturalistische blancobepalingen activiteit in de presynaptische cel en meer conventionele analyse van synaptische transmissie bij gebrek aan netwerkactiviteit mogelijk te maken. Dit zou hebben groot potentieel voor studies van tarief-codering synapsen, op welke aanleiding kunnen geven tot een breed scala aan de presynaptische activiteit zonder werven polysynaptic netwerken zou wenselijk zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Joshua Singer, Jonathan Schenk, evenals nadenkende reviewers voor opmerkingen op het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Ben White en Harold Zakon voor discussies over de techniek. Jonathan Schenk de gegevens heeft verschaft voor figuur 3A. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Stichting Whitehall en een NIH R21 naar QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
