Summary
Denne artikkelen inneholder en metode for å teste monosynaptic tilkoblinger mellom neurons ved å bruke tetrodotoxin og tetrodotoxin-resistente natrium kanalen, NaChBac.
Abstract
Her, brukes en ny teknikk kalt Tetrotoxin (TTX) foretatt motstand for undersøkelser synapser (TERPS) for å teste for monosynaptic tilkoblinger mellom målet neurons. Metoden er avhengig av co uttrykk for en transgene aktivator med tetrodotoxin-resistente natrium kanalen, NaChBac, i en bestemt presynaptic Nevron. Forbindelser med antatte etter synaptic partnere bestemmes av hele celle opptak i nærvær av TTX, som blokkerer elektrisk aktivitet i nerveceller som ikke uttrykker NaChBac. Denne tilnærmingen kan endres for å arbeide med Aktivator eller kalsium bildebehandling som reporter tilkoblinger. TERPS legges til voksende verktøy tilgjengelig for å bestemme tilkobling i nettverk. Men er TERPS unik i at den rapporterer også pålitelig bulk eller volum overføring og smitteeffekter overføring.
Introduction
Et hovedmål for nevrovitenskap er å tilordne forbindelsene mellom neurons å forstå hvordan informasjon flyter gjennom kretser. Mange tilnærminger og ressurser har blitt tilgjengelig til å teste funksjonelle tilkoblingen mellom nerveceller i en rekke modell systemer1,2. For å generere de mest nøyaktige koblingsskjema bruker elektrofysiologi, er det viktig å løse om observerte forbindelser mellom to celler som er direkte og monosynaptic indirekte og polysynaptic. En gull-standard for å gjøre dette skillet i pattedyr neurons er å måle ventetiden mellom én action potentials i de presynaptic cellene og utbruddet av eksitatoriske postsynaptic strømmer (EPSCs) i andre Nevron. Monosynaptic tilkoblinger bør ha kort ventetid av noen millisekunder og lav variasjon3. Denne tilnærmingen kan være komplisert i virvelløse neurons fordi synapser kan oppstå i sin dendrites langt fra somatiske innspillingen området, forårsaker forsinkelser i påvisning på grunn av lange electrotonic avstander mellom postsynaptic conductances og opptak elektroden. Slike forsinkelser kan introdusere tvetydighet om poly-kontra monosynaptic bidrag. I tillegg liten synaptic hendelser kan forfalle før området somatiske innspillinger og kjøring sterkere presynaptic aktivitet, er sannsynlig å rekruttere polysynaptic hendelser.
Ulike teknikker er utviklet for å teste for monosynaptic forbindelser i dyr. En tilnærming bruker høy divalent kasjon løsninger (Hi-Di) som inneholder overflødig Mg++ og Ca++. Denne løsningen blokkerer polysynaptic tilkoblinger ved å redusere utgivelsen sannsynlighet og økende handling potensial terskel å favorisere gjenkjenning av monosynaptic inn4,5. Bestemme nøyaktig forholdet mellom Mg++ til Ca++ kreves, men er ikke trivielt og polysynaptic bidrag kan vare i selv beskjeden stimulering6. En alternativ tilnærming kalt GFP rekonstituering over Synaptic partnere (tak) drar nytte av nærhet mellom før og postsynaptic membraner på synapser å antyde en monosynaptic forbindelse 7. Her en komponent av grønne fluorescerende protein (GFP) er uttrykt i en Nevron, og komplementære fragmentet av molekylet er uttrykt i en antatte postsynaptic partner. Tilstedeværelsen av fluorescens angir at to neurons i nok nærheten tillater rekonstituering av GFP molekyl og innebærer eksistensen av en synapse. FORSTÅELSE kan rapportere synapser feilaktig, skjønt, hvis to celler har tett apposed membraner, som i en nerve eller fascicle. Varianter av forståelse eliminere slike falske positiver ved tethering presynaptic fragmentet av GFP direkte til synaptobrevin, slik at rekonstituering bare på aktive synapser8. Mens forståelse og variantene har vært medvirkende i å bestemme funksjonelle tilkobling i Drosophila CNS, kan noen tilkoblinger ikke gjøres synlig av forståelse om avstandene mellom pre og postsynaptic partnere er relativt stor. Dette er spesielt relevant i vurderingen av volum overføring forbundet med neuromodulation9 eller GABAergic hemming10.
Her er en komplementær og romanen teknikken demonstrert for testing direkte monosynaptic forbindelser i Drosophila CNS. Denne metoden kalles Tetrodotoxin foretatt motstand for undersøkelser synapser (TERPS), fungerer ved co uttrykk for tetrodotoxin (TTX)-resistente natrium kanal, NaChBac og optogenetic aktivator i en presynaptic celle under opptak fra antatte postsynaptic partnere9. I nærvær av TTX undertrykkes alle action potensial-mediert aktivitet i cellene ikke uttrykke NaChBac. NaChBac kanalen gjenoppretter selektivt excitability i målrettede presynaptic cellen(e), tillater lys-utløste synaptic overføring. Denne metoden tillater sterk aktivering av presynaptic neurons, slik at tilkoblinger kan løses postsynaptically ved somatiske opptak samtidig redusere sannsynligheten for rekruttering polysynaptic kretser. Viktigere, denne teknikken tillater studiet av volum overføring og avslører spredning av senderen fra en enkelt Nevron i en krets. I tillegg kan TERPS avsløre av kjemisk natur tilkoblingen gjennom konvensjonelle farmakologi. TERPS er egnet for bruk i noen modellsystem som tillater transgene uttrykket TTX tittelen natrium kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør fluer og identifisere GAL4 promoter linjer
- Velg en GAL4 promoter linje, og krysse den med fluer bærer både transgene UAS-NaChBac og en optogenetic transgene for aktivisering.
Merk: UAS-CsChrimson11 er valgt på grunn av sin høye konduktans og enkel som aktiverer NaChBac-mediert handling potensialer. Både UAS-NaChBac og UAS-CsChrimson er tilgjengelig fra Bloomington aksjer depotet. - Forberede all-trans retinal som lager løsning i etanol (35 mM) og lagre løsningen i fryseren på 20 ° C.
- Mix 28 µL denne aksjer i ca 5 mL av utvannet potet flake næringen og legge til denne blandingen på toppen av ampuller med konvensjonelle Drosophila medium.
- Øke voksen fluer uttrykke csChrimson på mat som inneholder 0.2 mM alle-trans-retinal for 1-3 dager11.
2. Forbered TTX lager
- Opprette en lagerløsning 1 mm TTX i destillert eller deionisert vann. Lagre denne løsningen i lab kjøleskap i flere måneder. Sjekk institusjoner retningslinjer for lagring av TTX som mange institusjoner klassifisere TTX som et farlig eller kontrollert stoff.
3. forberede fluer elektrofysiologi
- Samle 1-3 dagers gammel voksen flyr som er reist på mat med all-trans-retinal.
Merk: Se Murthy og Turner i 2013 en detaljert beskrivelse av oppdateringen clamping Drosophila neurons12,13. - Sette fluene i et hetteglass for scintillation. Plass ampullen på is 1 min til nakkens fluene.
- Bruk grov tang å sette inn en flue i et skreddersydd opptak kammer. Kammeret består av en 3 ½" sirkel laser kuttet fra 1/16" akryl. Kutt ¾" hull er i midten der en egendefinert folie er festet med 2-part epoxy. Folien inneholder en triangulær formet håper at fly settes inn i.
- Bruke voks eller UV kureres epoxy rundt dyret å sikre det fast i innspillingen kammeret.
- Belyse utarbeidelse med en svanehals optisk fiber for visualisering under en stereomicroscope. Angi svanehals fiber for skrå belysning ved å justere dem slik at de lyse fly direkte fra siden.
- Justere lysnivået til lavest mulig innstilling som gir tydelig visualisering av fly. Denne lysintensiteten varierer over personlige eksperimenter.
Merk: Denne protokollen kan tilpasses ved hjelp av en i situ hjernen explant metode14. - Hente eksterne opptak saltvann. Saltkildene inneholder i mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) metyl-2-aminoethane-sulfonic syre, 8 trehalose, 10 glukose, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2og 4 MgCl2 (justert til 270-275 mΩ). Saltkildene er boblet med 95% O2/5% CO2 (carbogen) og har en pH justert til 7.315.
- Plass 4-6 dråper ekstracellulære opptak saltoppløsning over fly utarbeidelse. På dette punktet, øke lysnivået i disseksjon mikroskopet for bedre synlighet.
- Skjerpe en tungsten wire med elektrolyse. Ledningen, utarbeide en mettet løsning KNO3 og bruke ca 20 V av vekselstrøm mens dipping spissen av ledningen inn i løsningen 20 ganger for 100 ms til spissen er nok. Bruk skjerpet tungsten wire for å fjerne cuticle på fly og dermed utsette hjernen.
- Videre utsett hjernen ved å fjerne trachea og fett organer som omgir den. Hvis antennal lobes, bruk en bøyd tungsten wire eller lignende verktøy til å forsiktig brette antenner under folien opptak kammer å øke synligheten. Bruk skarpe tang til å forsiktig rive glial vindsperre dekker området rundt der opptakene vil bli gjort.
- Overføre opptaket kammeret til elektrofysiologi riggen. Umiddelbart starte perfusjonsmåling med eksterne opptak saltvann frikirkelige carbogen å bevare hjernen. Saltvann reservoaret er plassert over mikroskopet scenen og er gravitasjon-matet til utarbeidelse. Bruk en vakuum linje og en 2 L Erlenmeyer kolbe samle avfall saltkildene.
4. få hele celle opptak
- Trekk oppdateringen Pipetter på en kommersiell pipette avtrekker. Se i håndboken for innstillinger for å oppnå en passende pipette med en tips motstand i nærheten 7 mΩ.
- Legge til 4 µL av interne innspillingen løsning i en patch pipette. Den interne saline består av 140 kalium aspartate, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA og 1 KCl i mM.
- Definere oppdateringen klemme forsterker for hele celle opptak. Null phono-inngangen på forskyvning og angi forsterkeren å levere test pulser. Her brukes er systemer Patch klemme forsterker 2400.
- Bruke positivt trykk gjennom pipette og tilnærming cellen. Bruk en micromanipulator direkte i pipette og kontakt cellen. Slipp positivt trykk. Sett holde potensialet av membranen til-60 mV. Pipette bør danne et gigaohm segl med cellemembranen som gjenspeiles av en lav sub-picoamp holder gjeldende.
Merk: Hvis bruker GFP guidet celle målretting, prøve å minimere bruken av epifluorescent lys for å hindre ChR2 aktivisering og potensielle synaptic depresjon. Også vente i noen minutter før trinn 5. - Angi forsterkeren å levere test pulser fra-50 mV til-60 mV. Denne innstillingen er standard på patch-klemme forsterkere. Test pulser vil avdekke en stor capacitative forbigående som representerer den gjeldende nødvendig å lade den oppdateringen pipette. Fjern capacitative transienter ved å justere kapasiteten kompensasjon knotter på AM 2400 eller lignende forsterker.
- Bruk korte pulser av negative trykket ruptur cellemembranen og få hele celle konfigurasjon.
Merk: En hel cellekonfigurasjon er observert når det er en stor økning i de capacitative transienter viser kapasitans av Nevron. En liten økning i holder gjeldende (grunnlinje) vil trolig også bli observert. Sette forsterkeren til gjeldende klemme modus og justere cellens potensialet til-50 til-60 mV.
5. test Synaptic tilkobling
- Konfigurere dataene oppkjøp (DAQ) systemet for å utløse en LED-driver for å generere lyspulser. Her, brukes en National Instruments DAQ systemet med Matlab for å levere et analogt signal til en LED-driver. LED intensiteten justeres via analoge signalet til driveren. LED er en 620-630 nm bølgelengde LED.
- Plasser high-powered rød LED direkte under utarbeidelse. Juster lysintensiteten slik at 0.238 mW/mm2 når fly.
- Aktivere presynaptic neurons under opptak fra postsynaptic cellen rundt. Oppnå celle aktivering optogenetically, pharmacogentically, eller via nervestimulering. Her, brukes csChrimson og korte pulser av rødt lys.
Merk: Synaptic tilkoblinger kan overvåkes i dagens klemme som EPSPs eller spenning klemme som EPSCs. En synaptic tilkobling skal vises før TTX svar på en 40 ms lys pulsen. Hvis ingen tilkobling er observert, er det usannsynlig at nervecellene synaptically koblet enten mono - eller polysynaptically. Holde potensielle kan justeres for å fremheve eksitatoriske eller hemmende tilsvarende. - Hvis en tilkobling er observert i normal saline, som legger til TTX i perfusjon systemet å oppnå en siste konsentrasjon på 1 µM. Bruk en resirkulerende pumpe å fange og gjenbruke saltkildene for å spare TTX. Peristaltiske pumpen vil trekke saltvann fra bad og gå tilbake til saltholdig reservoaret.
- Justere pumpens hastigheten for å gi sterk kontinuerlig vakuum som ikke tillater at saltvann nivået i badekaret å stige og falle.
Merk: Bruk av TTX bør føre opphør av skyter aktivitet i Nevron som overvåkes i hele-cellen. Dette bekrefter at nok TTX er lagt til i saltvann. - Bruke korte pulser av rødt lys (40 ms for hver puls) på nytt. På dette punktet, tilknytning synaptic er trolig monosynaptic. Legge til farmakologisk antagonister resirkulerende saltkildene teste av kjemisk natur synaptic koblingene forblir i TTX.
Merk: Når kombinerer optogenetics og fluorescerende målretting av neurons, kan det være viktig å ikke aktivere vedvarende presynaptic befolkningen av neurons under forsøk på å få et opptak. Dette kan føre til synaptic depresjon og gjør det vanskelig å se tilkoblinger. Fordi csChrimson har en lang eksitasjon band som utvider bredt inn i rekken av grønne fluorescerende protein, en rød fluorophore kan brukes til å visualisere neurons og channel2rhodopsin (Ch2R) kan brukes til å opphisse celle populasjoner. Dette krever spesifikk genetikk og en egendefinert filter kube. Vil generere egnet fluer, gjør fluer som uttrykker den røde fluorophore (RFP eller mCherry) under Meglos eller Q systemet binære uttrykk systemer. Disse må krysses med fluer uttrykke en Gal4 promoter og UAS-Ch2R og UAS-NaChBac effektor gener. Optimal filter kuben for epifluorescence har mange smale eksitasjon å opphisse den røde fluorophore, men ikke opphisse Ch2R. i tillegg, hvilke filteret skal inneholde en lang pass utslipp-filteret for å samle så mye lyset fra cellen. Vi brukte et egendefinert filter fra Chroma del tall et580/25 x og t600lpxr (fra 49306 settet), men med et et610lp barriere/utslipp filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TERPS brukes til å skille mellom mono- og polysynaptic bidrag i synaptic tilkoblinger mellom neurons. Mens svak stimulering av en celle kan brukes til å teste direkte forbindelser, rekrutterer kjører større presynaptic aktivitet ofte polysynaptic tilkoblinger (figur 1A). TERPS arbeider av co uttrykke TTX tittelen natrium kanalen NaChBac og optogenetic Aktivator og testing tilkoblinger i nærvær av TTX å eliminere polysynaptic tilkoblinger (figur 1B). TTX blokkerer effektivt handling potensialer i Drosophila hjernen, noe som gjør det til en egnet forberedelse til TERPS (figur 2A). Transgene uttrykk for NaChBac natrium kanalen redder excitability i nevroner og resulterer i et stort platå potensial (figur 2B).
Lokale interneurons (LN) i antennal flik vise robust svar på olfactory stimulering (figur 3A). Men fordi enkelte EPSPs ikke er lett løst på LN soma, fortsatt det uklart om slike svar oppstå direkte fra olfactory reseptor Nevron inngang (ORN) eller indirekte inngang via projeksjon neurons (PN) (figur 3B). Ved TERPS gjør ORNs vist her, faktisk synaptic direkteforbindelser med LNs (Figur 3 c).
En unik funksjon i TERPS er dens evne til å løse spesielt ekstra synaptic volum overføring som kan oppstå med GABA eller neuromodulators som serotonin. Stimulering av en serotonergic Nevron (CSDn) i Drosophila antennal flik resulterer i en blanding av eksitasjon og hemming i en lokal interneuron (figur 4A og figur 4B). Magnetisering er mediterte av eksitatoriske senderen acetylkolin og hemming skyldes serotonin (figur 4C og Figur 4 d). TERPS kan brukes til å avgjøre om tilkoblinger er monosynaptic ved å eliminere polysynaptic tilkoblinger (figur 4E). I TTX, er en sterk hemming fortsatt observert i LN, tyder det kommer fra direkte fra aktivering av en bestemt serotonergic Nevron (figur 4F og figur 4G). Denne tilkoblingen er blokkert av serotonin antagonist methysergide. Eksitatoriske synapse formidlet av acetylcholine ble utslått i TTX, foreslå kommer fra polysynaptic kilder.
Figur 1 : TERPS eliminerer polysynaptic tilkoblinger og isolerer monosynaptic innganger. (A). en skjematisk diagram viser at økt presynaptic aktivitet kan rekruttere polysynaptic tilkoblinger. (B). et diagram illustrerer hvordan TERPS kan fjerne polysynaptic bidrag med TTX for å eliminere skyter aktivitet i neurons. Excitability gjenopprettes utelukkende i en befolkning på nerveceller som deretter kan glade optogenetically. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : NaChBac gjenoppretter neuronal excitability i Drosophila neurons. (A) bruk av 1 µm TTX opphever skyter i Drosophila neurons. Både spontan aktivitet og lukt-utløste hemming elimineres i TTX. (B) NaChBac og csChrimson er uttrykt i CSDn og hjernen er utsatt for TTX. csChrimson stimulering depolarizes CSDn og etter en terskel er krysset, det er ikke-lineær økte i CSDn membran spenningen. Denne raske depolarization utgjør et platå som potensial (innfelt). Hver farge over simulering intensiteter samsvarer med samme farge i den spenning rammemargen. Dette tallet er endret fra Zhang og Gaudry 20169. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : TERPS avslører monosynaptic forbindelser mellom ORNs og LNs. (A) A eksempel innspillingen viser en lukt svar i en LN. Dette svaret kan være mono - eller polysynaptic i naturen. (B) TERPS kan testes på ORN til LN synapse. TTX brukes til å blokkere handling potensialer og excitability i alle celler i forberedelsene. Excitability gjenopprettes utelukkende i ORNs via NaChBac natrium kanalen. ORNs kan deretter bli begeistret med channelrhodopsin å lokke fram synaptic utgivelsen. Synaptiske hendelser er målt post-synaptically bruk hele celle innspillinger. (C) TERPS avslører at ORN til LN synapse er monosynaptic. TERPS kan også kombineres med farmakologi viser at synapse er cholinergic og blokkert av nikotinsyre reseptoren antagonist mecamylamine (200 µM). Den loddrette grå linjen indikerer tidsberegningen for ORN stimulering. Dette tallet er endret fra Zhang og Gaudry i 20169. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : TERPS er følsom for bulk eller volum overføring utgivelse fra modulatory neurons. (A) stimulering av CSDn resulterer i en handling potensial fra en registrert LN i Drosophila antennal flik. (B) The LN er hyperpolarized slik at CSDn stimulering resulterer i en subthreshold aktivitet. LN svaret består av en rask depolarization etterfulgt av en lavere hyperpolarization. Den grå linjen angir tidspunktet for CSDn stimulering. Methysergide (50 µM), en bred 5-HT reseptor antagonist, blokkerer den langsomme hyperpolarization, men har ingen innvirkning på depolarization. Mecamylamine blokkerer den raske depolarization antyder at det er cholinergic i naturen. (C) TERPS kan brukes å løse hvilke kjemiske komponenter i CSDn til LN synapse er mono-kontra polysynaptic. (D) The CSDn stimuleres i nærvær av TTX og postsynaptic LN svar er målt i hele celle innspillinger. Hyperpolarization vedvarer i TTX foreslå det er monosynaptic i naturen. Denne hyperpolarization er også blokkert av methysergide, samsvarer med serotonergic overføring. Den korte depolarization som forblir i TTX er trolig formidlet av elektriske gapet kopling, som det ikke er blokkert av nikotinsyre antagonister. Dette tallet er endret fra Zhang og Gaudry i 20169. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende filen 1: Drosophila folie. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende filen 2: fysiologi Chamber. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TERPS analyse komplimenter gjeldende teknikker for krets sprengning ved å aktivere gjenkjenning av synapser mellom identifiserte neurons. Spesielt avslører tilnærming monosynaptic tilkoblinger forstand stanse handling potensialer med TTX under gjenoppretting excitability i Velg innbyggere neurons med TTX-ufølsom natrium kanalen NaChBac. Synaptiske utgivelsen er brakt frem av optogenetic stimulering mens postsynaptic hendelser overvåkes med hele celle innspillinger. TERPS skiller seg fra andre tilnærminger som rekkevidde ved å være følsomme for bulk eller volum overføring skapte på lengre avstander og utføre farmakologiske manipulasjoner. Teknikken er relativt enkelt å bruke og krever bare én registrering elektrode og en lyskilde for optogenetic stimulering, som er gjennomførbare enn å skaffe dobbelt hele celle opptak på både før og etter synaptic deler av synapse. En grunnleggende forutsetning av TERPS er at handlingen potensialer er lett blokkeres av TTX i systemet blir studert. Men fordi TTX virker på neurons over et bredt spekter av taksonomisk rekker, er det sannsynlig at TERPS kan brukes generelt til systemene pattedyr og virvelløse modell.
TERPS kan enkelt endres i en rekke måter å lette enten stimulering av antatte presynaptic befolkningen eller opptak fra postsynaptic mål. Her ble en optogenetic verktøy brukt til å stimulere målet befolkningen, selv om aktivering av en rekke mekanismer er mulig. Nervestimulering av sensoriske axons, for eksempel er rutine i studier av overføring fra antennal nerve i Drosophila16 og passer i andre sensoriske systemer, inkludert eksterne nerver som inneholder mechanosensory neurons. En lignende tilnærming til testing funksjonelle tilkobling i Drosophila uttrykt GCaMP kalsium indikatorer i en befolkning av neurons under kjøring aktivitet i en annen befolkningen via ionotropic purinoceptor P2X2 og ATP program2. Denne tilnærmingen bør være kompatibel med TERPS bare co uttrykke NaChBac transgene P2X2 reseptoren i en Nevron og GCaMP i en annen befolkningen for en fullstendig oppdatering-fri metode. Men bør forsiktighet tas med tilnærminger forårsaker tregere depolarizations, som muscarinic-baserte designeren receptors utelukkende aktivert av en designer narkotika (DREADDs)17,18. Langsom depolarization føre til NaChBac inaktivering før handlingen potensial generasjon.
Lignende metoder til TERPS har vært ansatt i pattedyr systemer. Slike teknikker kombinerer TTX og channelrhodopsin for å kartlegge tilkobling mellom neurons. Channelrhodopsin aktivisering alene generelt depolarize ikke neurons tilstrekkelig, og dermed kalium kanal blokker 4-AP er brukes med TTX å lokke fram utgivelsen19,20,21. Mens dette fungerer på mange synapser, kan den ikke fungere på noen metabotropic synapser hvis nedstrøms målet for reseptoren er en 4-AP følsom kalium kanal. For eksempel avhengig serotonergic modulering av olfactory respons i møll direkte modulering av slike en 4-AP følsom K+ gjeldende (IA)22. Denne tilnærmingen også fungerte ikke på CSDn til LN synapse (data ikke vist). Dermed TERPS har en fordel ved å kreve mindre farmakologisk intervensjon i forhold til andre vanlige metoder og fungerer på bredere spekter eller synapser.
Det er noen begrensninger TERPS som bør vurderes. Først, det kan være mulige bivirkninger av kronisk uttrykk for NaChBac kanalen gjennom utvikling. Riktig krets montering og funksjon kan bekreftes ved å sammenligne aktiviteten av neurons mellom kontroll flyr mangler den NaChBac konstruksjonen og flyr med Konstruer i fravær av TTX. For å unngå slike problemer, kan uttrykk for NaChBac transgene kontrolleres timelig via uttrykk for temperatur-sensitive GAL4 repressor, GAL8023. I tillegg hvis en synapse bare forekommer i en tilstandsavhengige måte, er det tenkelig at undertrykke nettverksaktivitet TTX kan skjule slik forbindelse. Det er viktig å understreke at en god forbindelse observert med TERPS sannsynlig representerer en sann mono-synaptic tilkobling, mens et negativt resultat ikke er bevis for fravær av en tilkobling.
Mens TERPS kan avsløre evne til senderen slipp fra en Nevron å påvirke postsynaptic partner åpenbart langsom kanal dynamikken i NaChBac og platå potensial forbundet med dens aktivisering gjøre det mindre gjelder for studiet av klassisk neurotransmission. En tilnærming til endre TERPS for raskere, mer naturlig senderen utgivelsen vil være å uttrykke en modifisert TTX tittelen versjon av den endogene Drosophila natrium kanal para i motsetning til NaChBac. Denne endringen vil føre naturalistiske skyter aktivitet i presynaptic cellen og tillater mer konvensjonelle analyse av synaptic overføring i fravær av nettverksaktivitet. Dette ville ha stort potensial for studier av rente-koding synapser, på hvilke fremlokkende en rekke presynaptic aktivitet uten rekruttere polysynaptic nettverk ville være ønskelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Joshua Singer, Jonathan Schenk, samt gjennomtenkt korrekturlesere på manuskriptet. Vi vil også gjerne takke Ben White og Harold Zakon for diskusjoner om teknikken. Jonathan Schenk gitt dataene for figur 3A. Dette arbeidet ble støttet av en Whitehall stiftelse stipend og en NIH R21 til QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
