Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

Published: February 14, 2018 doi: 10.3791/57052
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Maryland

Summary

מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

Abstract

. הנה, טכניקה חדשה כינה Tetrotoxin (TTX) מהונדסים ההתנגדות של חיטוט Synapses (TERPS) מוחל לבדיקת monosynaptic קשרים בין נוירונים היעד. השיטה מסתמכת על ביטוי משותף activator הטרנסגניים עם הערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac, ב presynaptic נוירון מסוים. קשרים עם שותפים הפוסט-סינפטית בשם נקבעים לפי כל-תא הקלטות בנוכחות TTX, אשר חוסם פעילות חשמלית בנוירונים המבטאים לא NaChBac. גישה זו יכול להיות שונה כדי לעבוד עם activator או סידן הדמיה ככתב של חיבורים. TERPS מוסיף ערכת הכלים הזמינים עבור קביעת קישוריות בתוך רשתות הולך וגדל. עם זאת, TERPS הוא ייחודי בכך שהוא גם אמין ידווח בצובר או אמצעי שידור ושידור והתאמת.

Introduction

יעד מרכזי של מדעי המוח הוא למפות את הקשרים בין הנוירונים כדי להבין כיצד מידע זורם דרך מעגלים. גישות ומשאבים רבים הפכו להיות זמין לבדוק את תפקודי קישוריות בין הנוירונים בטווח של דגם מערכות1,2. כדי להפיק את תרשימים בחיווט המדויקות ביותר באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, חשוב לפתור אם חיבורים שנצפה בין שני תאים הם monosynaptic לעומת עקיף ו polysynaptic הישירים. תקן הזהב להכנת הבחנה זו בנוירונים יונקים זה מודדים ההשהיה בין יחיד action potentials בתאים presynaptic תחילתה של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSCs) בתוך הנוירון השני. חיבורים monosynaptic צריך השהיות ארוכות יותר קצר של כמה אלפיות השניה, השתנות נמוכה3. גישה זו יכולה להיות מסובכת בנוירונים הגעה מכיוון הסינפסות עלולה להתרחש שלהם דנדריטים רחוק באתר הקלטה הסומטית, גרימת עיכובים בזיהוי בשל המרחקים זמן electrotonic בין postsynaptic conductances את ההקלטה אלקטרודה. עיכובים כאלה יכולים להציג את עמימות בנוגע פולי-לעומת תרומות monosynaptic. בנוסף, אירועים קטנים סינפטית ייתכן ריקבון לפני שמגיעים לאתר הקלטות הסומטית, נהיגה פעילות presynaptic חזק יותר, סביר להניח לגייס אירועים polysynaptic.

טכניקות שונות פותחו כדי לבדוק חיבורים monosynaptic חסרי חוליות. גישה אחת משתמשת הקטיון כלט גבוהה פתרונות (Hi-Di) המכילים עודף מ ג++ ו- Ca++. פתרון זה חוסמת חיבורים polysynaptic על-ידי הפחתת שחרור ההסתברות הסף הגדלת פוטנציאל הפעולה לטובת גילוי של קלט monosynaptic4,5. קביעת היחס המדויק של מ ג++ ל Ca++ הנדרשים, עם זאת, לא טריוויאלי, תרומות polysynaptic עלול להימשך אפילו צנוע גירוי6. גישה חלופית בשם GFP שיחזור על פני סינפטית שותפים (תפיסה) מנצל הקירבה בין ממברנות קדם ו postsynaptic ב הסינפסות להסיק חיבור monosynaptic 7. . הנה, רכיב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתבטאת נוירון אחד, הרסיס משלימים של המולקולה מתבטאת שותף postsynaptic בשם. הנוכחות של קרינה פלואורסצנטית מציין כי שני הנוירונים נמצאים מספיק קרוב מאוד להתיר הכינון של מולקולת ה-GFP, מרמז על קיום סינפסה. תפיסתו יכולים לדווח הסינפסות זכריה, אם שני תאים יש קשר הדוק אני בטוחה ממברנות, כמו עצב או fascicle. וריאציות של תפיסתו לחסל תוצאות חיוביות שגויות כאלה על ידי קשירה של שבר presynaptic של GFP ישירות אל synaptobrevin, ובכך מאפשר שיחזור רק ב הסינפסות פעיל8. בעוד תפיסתו והווריאנטים שלה היה תפקיד חשוב בקביעת פונקציונלי קישוריות דרוזופילה CNS, קשרים לא עשויים להיות גלויים לפי תפיסתו אם המרחקים בין שותפים קדם ו postsynaptic גדול יחסית. זה רלוונטי במיוחד על פי הערכות של העברת אמצעי האחסון המשויך neuromodulation9 או עיכוב GABAergic10.

כאן, טכניקה משלימה ואת הרומן הוא הפגין לבדיקה חיבורים ישירים monosynaptic דרוזופילה CNS. שיטה זו, הנקראת טטרודוטוקסין מהונדסים ההתנגדות על חיטוט Synapses (TERPS), פועלת על-ידי ביטוי משותף טטרודוקסין (TTX)-ערוץ נתרן עמידים NaChBac, של optogenetic activator בתא presynaptic תוך כדי הקלטה מ בשם שותפים postsynaptic9. בנוכחות TTX, מדוכא כל פעילות בתיווך פוטנציאל הפעולה בתאים שאינם לבטא NaChBac. ערוץ NaChBac משחזר באופן סלקטיבי דעתנית ב יישוב presynaptic תא (ים), המתיר הסינאפסית עורר-אור. שיטה זו מאפשרת הפעלה חזקה של הנוירונים presynaptic, כך חיבורים יכולים להיפתר postsynaptically על ידי הקלטה סומאטית תוך צמצום ההסתברות של גיוס מעגלים polysynaptic. חשוב, טכניקה זו מאפשרת לימוד אמצעי שידור, חושף את התפשטות המשדר שוחררו נוירון בודד לאורך כל מעגל. בנוסף, TERPS יכול לחשוף הטבע כימי של החיבור באמצעות פרמקולוגיה קונבנציונלי. TERPS מתאים לשימוש בכל מערכת מודל המאפשר את הביטוי הטרנסגניים של תעלות נתרן TTX-רגישות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מכינים זבובים וקווים יזם לזהות GAL4

  1. בחר קו יזם GAL4 וחצו אותה עם זבובים נושאת את transgene UAS-NaChBac והן של transgene optogenetic עבור הפעלה.
    הערה: UAS-CsChrimson11 נבחרה בשל מוליכות גבוהה שלה ואת הקלות שבה היא מפעילה בתיווך NaChBac פוטנציאל פעולה. UAS-NaChBac והן UAS-CsChrimson זמינים מהמאגר מניות בבלומינגטון.
  2. להכין כל טרנס רשתית כפתרון מניות אתנול (35 מ מ) ולאחסן את הפתרון במקפיא ב-20 ° C.
  3. מיקס 28 µL של המניה הזו אל תוך כ- 5 מ של תפוחי אדמה ולמיומנות אגיע מזון ומוסיפים תערובת זו העליון של הבקבוקון של מדיום דרוזופילה קונבנציונלי.
  4. להעלות את הזבוב הבוגר לבטא csChrimson על מזון המכיל 0.2 מ מ כל-טרנס-רשתית 1 – 3 ימים11.

2. מכינים TTX מניות

  1. ליצור פתרון מניות של 1 מ מ TTX במים מזוקקים או יונים. לאחסן פתרון זה מקרר מעבדה במשך מספר חודשים. בדוק את מדיניות מוסדות לגבי האחסון של TTX כמו מוסדות רבים לסווג TTX בתור חומר מסוכן או מבוקר.

3. מכינים את הזבובים עבור אלקטרופיזיולוגיה

  1. לאסוף יום 1 – 3 זבובים מבוגר בן מגודלים על האוכל עם כל-טרנס-רשתית.
    הערה: עיין Murthy ואת טרנר בשנת 2013 לתיאור מפורט של תיקון מחבר חובק למעקה דרוזופילה נוירונים12,13.
  2. הכניסו את הזבובים בקבוקון זכוכית נצנוץ. מקם את המבחנה לתוך קרח 1 דקות לשתק את הזבובים.
  3. להשתמש מלקחיים גס להוסיף לעוף לתוך חדר הקלטה בהזמנה אישית. התא מורכב 3 ½" מעגל לייזר לחתוך מ" 1/16" אקריליק. לחתוך חור ¾" היא המרכז שבו תשובה מכשילה מותאמת אישית מצורפת באפוקסי בשני חלקים. מסכל מכיל של משולש בצורת תקווה כי הזבוב מוכנס לתוך.
  4. החל שעווה או UV לריפוי אפוקסי סביב החיה לאבטח אותו בחוזקה בתוך תא הקלטה.
  5. יאיר ההכנה עם סיב אופטי מתכווננת ויזואליזציה תחת stereomicroscope. הגדר את הסיבים מתכווננת לתאורת עקיפה על ידי התאמת אותם כך מאירים לטוס ישירות מן הצד.
  6. להתאים את רמת האור הנמוך ביותר להגדרת אפשרי זה עדיין מאפשר הדמיה ברורה של הזבוב. עוצמת האור הזה ישתנו לאורך ניסויים בודדים.
    הערה: פרוטוקול זה ניתן להתאים באמצעות בתוך המוח באתרו explant השיטה14.
  7. אחזר הקלטה חיצוני תמיסת מלח. תמיסת המלח מכיל במ מ: 103 NaCl, 3 אשלגן כלורי, חומצה מתיל-2-aminoethane-sulfonic 5 N-טריס (hydroxymethyl), טרהלוז 8, גלוקוז 10, 26 NaHCO3,2פו ' NaH 1 '4, 1.5 CaCl2ו- 4 MgCl2 (מותאם mΩ 270-275). תמיסת המלח הוא מבעבע עם 95% או2/5% CO2 (carbogen), הסתגל pH 7.315.
  8. מקום 4-6 טיפות של תמיסת מלח הקלטה חוץ-תאית על הכנת לעוף. בשלב זה, להגביר את רמת האור-המיקרוסקופ לנתיחה עבור ניראות טובה יותר.
  9. בצעו חידוד חוט טונגסטן באמצעות אלקטרוליזה. כדי להפוך את החוט, להכין תמיסה רוויה של יודע3 ולהחיל כ 20 V של AC זרם בעודכם טובלים את קצה החוט בתוך תמיסת 20 פעמים למשך 100 אלפיות השניה עד קצהו הוא מחודד. להשתמש את החוט טונגסטן מחודדים כדי להסיר את הקוטיקולה על ראשו של הזבוב, ובכך חושף את המוח.
  10. בהמשך חושפים את המוח על-ידי הסרת קנה הנשימה וגופים שומן המקיפים אותו. אם ניגש האונות antennal, השתמש כפופות טונגסטן תילים או כלי דומה להכניס בעדינות אנטנות מתחת רדיד האלומיניום הקלטה קאמרית כדי להגדיל את הנראות. להשתמש מלקחיים חדה בעדינות תקרע מעליך את לנדן גליה המכסים את שטח עניין שבו יבוצעו הקלטות.
  11. העברה לחדר ההקלטה המתקן אלקטרופיזיולוגיה. מיד להתחיל זלוף בתמיסת הקלטה חיצוני מבעבע עם carbogen כדי לשמר את המוח. המאגר תמיסת ממוקמת מעל הבמה מיקרוסקופ, כוח המשיכה-מוזן ההכנה. השתמש קו ואקום, בקבוקון 2 ל' Erlenmeyer כדי לאסוף את תמיסת המלח פסולת.

4. להשיג את הקלטת כולה-תא

  1. משוך תיקון פיפטות פולר פיפטה מסחרי. עיין במדריך של הגדרות להגיע עם פיפטה המתאים עם התנגדות עצה ליד 7 mΩ.
  2. להוסיף 4 µL של פתרון הקלטה פנימית פיפטה תיקון. תמיסת המלח פנימי מורכב אספרטט אשלגן 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 נה3GTP, 1 EGTA ו- 1 אשלגן כלורי במ מ.
  3. להגדיר את תיקון מגבר המלחציים עבור הקלטת כל תא. אפס היסט של המגבר ולהגדיר המגבר להעביר מבחן פולסים. . הנה, משמש מגבר מלחציים תיקון מערכות 2,400 AM.
  4. החל בלחץ חיובי פיפטה, מתקרבים התא. השתמש micromanipulator כדי לכוון את פיפטה ולפנות אל התא. שחרור הלחץ. ערכת הפוטנציאל החזקה של הקרום ל-60 mV. פיפטה יוצרות גושפנקה ג'יגה אוהם עם הממברנה של התא כפי שמעידים נמוך sub-picoamp מחזיק הנוכחי.
    הערה: אם באמצעות ה-GFP מודרכת תא מיקוד, לנסות לצמצם השימוש אור פלורסנטי כדי למנוע הפעלת ChR2 ודיכאון סינפטית פוטנציאליים. בנוסף להמתין כמה דקות לפני יישום שלב 5.
  5. להגדיר את מגבר להעברת פולסים מבחן מ-50 mV ל-60 mV. הגדרה זו היא תקן על תיקון-קלאמפ מגברים. מבחן פולסים תחשוף גדול capacitative הציעה שתושב זמני המייצג את הצורך הנוכחי כדי לחייב את פיפטה תיקון. הסר שנחשולי capacitative על-ידי התאמת בידית פיצוי קיבולת על אני 2400 או מגבר דומה.
  6. החל פולסים קצרים של לחץ שלילי לקרע קרום התא ולקבל כל-תא תצורה.
    הערה: תצורה התא כולו הוא ציין כאשר יש עלייה גדולה תופעות מעבר capacitative מציג את קיבול של הנוירון. עלייה קטנה במעצר הנוכחי (בסיסית) גם סביר להניח יתקיימו. הגדרת המגבר למצב הנוכחי של קלאמפ ולהתאים את הפוטנציאל של התא-50 עד-60 mV.

5. בדיקת קישוריות סינפטית

  1. תצורת המערכת רכישה (DAQ) נתונים כדי להפעיל התקן LED כדי להפיק להבזקי האור. כאן, מערכת DAQ מכשירים הלאומית משמשת עם Matlab להעביר אות אנלוגי נהג LED. עוצמת LED מותאמת באמצעות האות האנלוגי לנהג. ה-LED הוא 620-630 ננומטר אורך גל LED.
  2. מקם את עוצמה אדום LED ישירות מתחת ההכנה. להתאים את עוצמת האור כך mW/מ מ 0.2382 מגיע הזבוב.
  3. להפעיל את הנוירונים presynaptic תוך כדי הקלטה מהתא postsynaptic עניין. להשיג תא הפעלה optogenetically, pharmacogentically, או באמצעות גירוי עצבי. כאן, csChrimson, פולסים קצרים של אור אדום מוחלים.
    הערה: קשרים סינפטיים ניתן לנטר קלאמפ הנוכחי כמו EPSPs או מתח קלאמפ כמו EPSCs. חיבור סינפטית צריכים להיות גלויים לפני החלת TTX בתגובה פולס אור של 40 אלפיות. אם אין קשר הוא ציין, אין זה סביר כי הנוירונים synaptically מחוברים או מונו - או polysynaptically. החזקת פוטנציאלי עשוי להיות מותאם כדי להדגיש את חיבורי סינאפסות או מעכבות בהתאם.
  4. אם חיבור נצפית בתמיסת מלח, להוסיף TTX למערכת זלוף להשגת ריכוז סופי של 1 מיקרומטר. השתמש משאבה recirculating ללכוד ולהשתמש את תמיסת המלח כדי לחסוך טטרודוטוקסין. משאבת סחרור לצייר את תמיסת מהאמבטיה ולהחזיר אותה למאגר המים מלוחים.
  5. להתאים את מהירות המשאבה לספק ואקום קבוע חזק שאינו מאפשר את רמת מלוחים באמבטיה עם תוכי.
    הערה: היישום של TTX צריך לגרום הפסקת spiking פעילות הנוירון המנוטר בתא-שלם. זה מאשר כי מספיק TTX נוספה מלוחים...
  6. החל פולסים קצרים של אור אדום (40 ms לכל פעימה) שוב. בשלב זה, כל קשר סינפטית הנשאר סביר monosynaptic. להוסיף היריבים תרופתי מלוחים recirculating לבחון את האופי הכימי של קשרים סינפטיים שנותרו ב טטרודוטוקסין.
    הערה: כאשר שילוב של optogenetics ומיקוד פלורסנט של נוירונים, זה עשוי להיות חשוב לא לבצע את הפעלת בהתמדה את האוכלוסייה presynaptic של הנוירונים ניסה להשיג הקלטה. זה יכול להוביל לדיכאון סינפטית והופכת אותו קשה לראות את החיבורים. מכיוון csChrimson יש להקה עירור ארוכות המרחיבה בהרחבה לתוך הטווח של חלבון פלואורסצנטי ירוק, fluorophore אדום יכול לשמש כדי להמחיש נוירונים ו- channel2rhodopsin (Ch2R) יכול לשמש כדי לרגש אוכלוסיות תאים. כך דורש גנטיקה מסוימת קוביה מסנן מותאם אישית. כדי ליצור זבובים מתאימים, להפוך זבובים המבטאים את fluorophore אדום (RFP או mCherry) תחת מערכת בינארית ביטוי מערכת לקסה או Q. אלה יצטרכו חצה עם זבובים לבטא מקדם Gal4 וגם הגנים אפקטור UAS-Ch2R ו- UAS-NaChBac. הקוביה מסנן אופטימלי עבור epifluorescence יהיה מגוון עירור צר כדי לרגש את fluorophore אדום, אבל לא לרגש את Ch2R. בנוסף, ערכת מסנן צריכה לכלול מסנן פליטה מסירה ארוכה כדי לאסוף כמה שיותר האור הנפלט. השתמשנו מסנן מותאם אישית של Chroma שכלל חלק מספרי et580/25 x ו- t600lpxr (מקבוצת 49306), אבל עם מסנן פליטה/מכשול et610lp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TERPS משמש להבחנה בין מונו - polysynaptic סיועה של קשרים סינפטיים בין נוירונים. בזמן גירוי חלשים של תא עשוי לשמש כדי לבדוק חיבורים ישירים, נהיגה יותר פעילות presynaptic לעיתים קרובות מגייס חיבורים polysynaptic (איור 1 א'). TERPS עובד על-ידי שיתוף לבטא תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac ו- activator optogenetic ולאחר בדיקת חיבורי בנוכחות TTX לחסל את חיבורי polysynaptic (איור 1B). TTX חוסם ביעילות פוטנציאל פעולה במוח דרוזופילה , שהופך אותו הכנה מתאימה עבור TERPS (איור 2 א). ביטוי הטרנסגניים של תעלת נתרן NaChBac מציל דעתנית בנוירונים ותוצאות פוטנציאלי מישורית גדולה (איור 2B).

Interneurons מקומיים (LN) באונה antennal הצג תגובות חזקות גירוי חוש הריח (איור 3 א). עם זאת, מכיוון EPSPs בודדים אינם נפתרת בקלות-soma LN, עדיין לא ברור אם תגובות כאלה נובעים באופן ישיר קולטני ריח נוירון קלט (ולהתמכר) או בעקיפין קלט באמצעות הקרנה נוירונים (PN) (איור 3B). באמצעות TERPS, ORNs המוצגת כאן, אכן עושים קשרים סינפטיים ישירה עם שירותי ההגירה (איור 3C).

תכונה ייחודית של TERPS היא היכולת שלה במיוחד לפתור שידור נפח במיוחד סינפטית שעלולות להתרחש עם GABA או neuromodulators כגון סרוטונין. גירוי של נוירון תכולה (CSDn) באונה antennal דרוזופילה תוצאות בתערובת של עירור וניגוד ב interneuron המקומי (איור 4A , 4B איור). עירור הוא במדיטציה על ידי אצטילכולין המשדר סינאפסות, עיכוב נגרמת על ידי סרוטונין (4C איור , איור 4D). TERPS יכול לשמש כדי לקבוע אם החיבורים monosynaptic על ידי ביטול התקשרויות polysynaptic (איור 4E). ב TTX, עיכוב חזק הוא ציין עדיין LN, רומז שמגיע מן ישירות מתוך ההפעלה של נוירון תכולה מסוימת (איור 4F ו- 4G איור). התקשרות זו חסומה על-ידי methysergide אנטגוניסט סרוטונין. הסינפסה סינאפסות מתווכת על-ידי אצטילכולין חוסל ב TTX, רומז שהתעוררו ממקורות polysynaptic.

Figure 1
איור 1 : TERPS מבטלת חיבורים polysynaptic ומבודד תשומות monosynaptic. (א)-תרשים סכימטי. מראה כי הגדלת פעילות presynaptic נגייס את חיבורי polysynaptic. (B). דיאגרמה המדגימה כיצד TERPS באפשרותך להסיר polysynaptic תרומות באמצעות TTX לחסל את פעילות הנוירונים עולה. דעתנית משוחזר באופן בלעדי באוכלוסיה אחת של נוירונים, כי אז ניתן optogenetically נרגשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : NaChBac משחזר דעתנית עצביים ב דרוזופילה נוירונים. (א) היישום של 1 מיקרומטר ש-TTX מבטל spiking בנוירונים דרוזופילה . פעילות ספונטנית והן עיכוב עורר ריח מסולקות ב טטרודוטוקסין. (B) NaChBac ו- csChrimson באים לידי ביטוי CSDn, המוח הוא נחשף טטרודוטוקסין. גירוי csChrimson depolarizes את CSDn, לאחר סף הוא חצה, ויש גדולים ליניארי החמירו את מתח הממברנה CSDn. דפולריזציה מהירה זו מהווה פוטנציאל מישור-כמו (פנימי). כל צבע על פני עוצמות סימולציה מקביל באותו הצבע ב כניסת מתח. דמות זו שונתה ג'אנג ו- Gaudry 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : TERPS חושף קשרים monosynaptic בין ORNs לבין שירותי ההגירה. (א) א מדגם ההקלטה מראה מענה ריח LN. תגובה זו עשויה להיות מונו - או polysynaptic בטבע. ניתן לבחון את TERPS (B)-ולהתמכר אל תוך סינפסה. TTX משמש כדי לחסום פוטנציאל פעולה, דעתנית בתאים כל ההכנה. דעתנית משוחזר באופן בלעדי ב- ORNs דרך תעלת נתרן NaChBac. ORNs אפשר ואז יהיה נרגש עם channelrhodopsin לעורר שחרור סינפטית. אירועים סינפטית נמדדים post-synaptically באמצעות תאים כל הקלטות. TERPS (ג) מגלה כי ולהתמכר אל סינפסה LN הוא monosynaptic. TERPS יכול גם להיות משולב עם פרמקולוגיה להראות כי הסינפסה היא שימוש שנחסמו על-ידי mecamylamine אנטגוניסט קולטני nicotinic (200 מיקרומטר). הפס האפור האנכי מציין את התזמון של גירוי ולהתמכר. איור זה השתנה בין ג'אנג Gaudry 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : TERPS הוא רגיש שחרור שידור בצובר או אמצעי אחסון של נוירונים modulatory. (א) הגירוי של תוצאות CSDn פוטנציאל הפעולה של LN מוקלטות באונה antennal דרוזופילה . (B) LN הוא hyperpolarized כך CSDn גירוי תוצאות פעילות subthreshold. התגובה LN מורכב דפולריזציה מהר ואחריה hyperpolarization איטי יותר. הבר אפור מציין את הזמן של גירוי CSDn. Methysergide (50 מיקרומטר), רחב 5-HT-אנטגוניסט, חוסם את hyperpolarization איטי אבל אין השפעה על דפולריזציה. Mecamylamine חוסם את דפולריזציה מהר רומז כי זה שימוש בטבע. TERPS (ג) יכול לשמש כדי לפתור אילו מרכיבי CSDn כדי LN סינפסה כימית הם מונו-לעומת polysynaptic. (ד) CSDn מגורה בנוכחות TTX, תגובות LN postsynaptic נמדדים כל-תא הקלטות. Hyperpolarization נמשכת ב TTX מציע monosynaptic בטבע. Hyperpolarization זו חסומה גם על-ידי methysergide, עקבי עם תכולה שידור. דפולריזציה קצרה הנשארות בעותק TTX סביר מתווך על ידי חשמל הפער מצמד, כפי שהיא אינה חסומה על ידי היריבים nicotinic. איור זה השתנה בין ג'אנג Gaudry 20169. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1: רדיד דרוזופילה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2: פיזיולוגיה של התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח TERPS מחמאות הנוכחי טכניקות המשמשות עבור מעגל פיצוח על-ידי הפיכת זיהוי הסינפסות בין נוירונים שזוהה. באופן ספציפי, הגישה חושף קשרים monosynaptic על ידי בהרחבה להשתיק פוטנציאל פעולה עם TTX בעת שיחזור דעתנית אוכלוסיה בחירה של נוירונים עם תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac. שחרור סינפטית היא שהפיק optogenetic גירוי בזמן אירועים postsynaptic מנוטרים עם תאים כל הקלטות. TERPS מבדיל עצמו לבין גישות אחרות כגון תפיסתו על ידי רגיש בכמות גדולה או אמצעי שידור elicited למרחקים ארוכים, היכולת לבצע מניפולציות תרופתי. הטכניקה פשוטה יחסית להעסיק ודורש רק הקלטה אחת אלקטרודה, מקור אור לגירוי optogenetic, אשר הוא ריאלי יותר מאשר קבלת הקלטות שלם-תא כפול על חלקים הפוסט-סינפטית והאיות של הסינפסה. דרישה בסיסית של TERPS היא כי פוטנציאל פעולה בקלות הנחסמים על-ידי TTX במערכת נחקר. אבל, בגלל TTX פועלת על נוירונים על פני מגוון רחב של phyla בטקסונומיה, סביר להניח כי TERPS יכול להיות מיושם באופן כללי שתי מערכות יונקים ודגם הגעה.

TERPS ניתן בקלות לשנות במספר של נימוסים להקל גם הגירוי של האוכלוסייה presynaptic בשם או עבור הקלטה מ postsynaptic מטרות. כאן, כלי optogenetic שימש כדי לגרות את אוכלוסיות היעד, למרות להפעלה באמצעות מגוון של מנגנונים אפשרית. גירוי עצבי של אקסונים סנסוריים, לדוגמה, הוא שגרה במחקרים של שידור של העצב antennal דרוזופילה16 והוא מתאים מערכות חישה אחרים, כולל העצבים ההיקפיים המכיל mechanosensory נוירונים. בגישה דומה בדיקות תפקודי קישוריות בדרוזופילה הביעו GCaMP מחוונים הסידן באוכלוסיה אחת של נוירונים בזמן נהיגה פעילות באוכלוסיה אחרת באמצעות ה ionotropic purinoceptor P2X2 ו- ATP יישום2. גישה זו צריך להיות תואם עם TERPS על ידי פשוט שיתוף לבטא את transgene NaChBac עם הקולטן P2X2 של נוירון אחד, GCaMP באוכלוסיה אחרת עבור שיטה לחלוטין ללא תיקון. עם זאת, זהירות יש לנקוט עם גישות גורם depolarizations איטי יותר, כגון מוסקריניים המבוסס על קולטנים מעצבים מופעל באופן בלעדי על ידי17,בסם (DREADDs)18. דפולריזציה איטי עלול להוביל NaChBac איון לפני דור פוטנציאל הפעולה.

שיטות דומות TERPS יש כבר מועסקים במערכות יונקים. טכניקות אלה משלבים TTX ו- channelrhodopsin כדי למפות את קישוריות בין הנוירונים. Channelrhodopsin הפעלה לבד בדרך כלל לא depolarize נוירונים מספיק, ובכך חוסם ערוץ מטעם אשלגן 4-AP הוא להיות מיושם עם TTX להפיק מהדורה19,20,21. בזמן זה עובד ב הסינפסות הרבה, זה לא יפעלו בכמה הסינפסות metabotropic אם המטרה במורד הזרם של הקולטן הוא ערוץ 4-AP אשלגן רגיש. למשל, אפנון תכולה של חוש הריח התגובה עש מסתמכת ישירות על אפנון של כזה 4-AP רגיש K+ הנוכחי (טא)22. גם גישה זו לא פעלה ב CSDn כדי סינפסה LN (נתונים לא מוצג). לפיכך, TERPS יש יתרון של התערבות פרמקולוגית פחות לעומת שיטות אחרות בשימוש נפוץ, יפעלו מגוון רחב יותר או הסינפסות.

קיימות מספר מגבלות כדי TERPS הנחשבות. ראשית, ייתכנו תופעות לוואי פוטנציאליות הביטוי כרונית של הערוץ NaChBac במהלך הפיתוח. הרכבה נכונה מעגל ותפקוד יכול להיות מאושרות על ידי השוואת הפעילות של הנוירונים בין שליטה זבובים חסר הבונה NaChBac וזבובים עם הבונה בהיעדרו של טטרודוטוקסין. כדי למנוע בעיות כאלה, ביטוי של transgene NaChBac יכול להיות נשלט חנותם באמצעות הבעת הרגיש GAL4 מדכא. שבולם, GAL8023. בנוסף, אם סינפסה נצפית רק באופן תלוי-מצב, זה מתקבל על הדעת כי דיכוי פעילות רשת עם TTX עלול להסתיר קשר כזה. חשוב להדגיש כי חיבור חיובי נצפתה עם TERPS סביר מייצג מונו-סינפטית חיבור נכון, בעוד תוצאה שלילית אינה הוכחה על העדר חיבור.

בעוד TERPS יכול לחשוף את היכולת של המשדר שחרור של נוירון אחד להשפיע על השותף postsynaptic בבירור, את הדינמיקה ערוץ איטי של NaChBac, הפוטנציאליות מישור המשויך ההפעלה שלה רינדור זה פחות רלוונטי למחקר של מוסיקה קלאסית עצבית. גישה אחת כדי לשנות TERPS עבור יותר מהר, יותר טבעי משדר השחרור יהיה לבטא TTX-רגישות כשעזבתי אנדוגני דרוזופילה נתרן ערוץ פארא בניגוד NaChBac. שינוי זה לגרום נטורליסטי spiking פעילות התא presynaptic, לאפשר ניתוח קונבנציונליים יותר של ההעברה הסינאפסית בהעדר פעילות רשת. יש לזה פוטנציאל גדול עבור מחקרים של קצב-קידוד הסינפסות, על איזו העלאת מגוון רחב של פעילות presynaptic ללא גיוס רשתות polysynaptic יהיה רצוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות יהושע זינגר, ג'ונתן שנק, כמו גם מתחשב בודקים עבור הערות על כתב היד. כן נרצה להודות לבן בן, הרולד אשות לדיונים על הטכניקה. ג'ונתן שנק סיפקה את הנתונים עבור איור 3A. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן וייטהול, R21 של NIH על QG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-csChrimson Bloomington Drosophila Stock Center 55135 Used as a neural activator
UAS-NaChBac Bloomington Drosophila Stock Center 9466 Resotores excitibility in cells in TTX
Tetrodotoxin Tochris 1078 Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance
all trans-Retinal Sigma-Aldrichall trans-Retinal R2500 Require co-factor for channelrhodopsin
Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide McMaster Carr 3254K7 Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000-C Used for dissection of preparation
Waxer Almore Eectra Waxer 66000 Used during dissection to secure fly in foil
Paraffin Wax Joann 4917217 Used with waxer
Number 5 forceps Fine Science Tools #5CO Used for dissection and desheathing
Dissection Scissors Fine Science Tools 15001-08 Used to remove parts of the cuticle during dissection
Tungsten wire A-M Systems 797500 Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection
Reciculating Peristaltic Pump Simply Pumps (Amazon) PM200S for recirculating TTX
Speed Controller for peristaltic pump Zitrades (Amazon) N/A PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B
Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator McMaster Carr 1804T1 For applying positive pressure during patching
Glass capilaries World Precision Instruments TW150F-3 For patch pipettes
Multipurpose Gauge McMaster Carr 3846K431 Gauge for pressure regulator
Electrophysiology Camera Dage MTI  IR-1000 Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson
IR LED Thorlabs  M850F2 For oblique illumination
fiber optic for IR LED Thorlabs M89L01 Couples to IR LED
Objective lens  Olympus 40X LUMPlanFLN This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.
Amber LED Thorlabs M590L3d For visualizing RFP and mCherry
Blue LED Thorlabs M470L3d For visualizing GFP
GFP filter set Chroma 49011 For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin
Custom mCherry Filter Set Chroma  et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin
Dichroic to combine Amber and blue LED Thorlabs DMLP550R Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.
Red LED LEDSupply Cree XPE 620 - 630 nm Used to drive csChrimson
LED Driver LEDSupply 3021-D-E-1000 Used to drive LEDs for optogenetic stimulation
Manipulator Sutter Instruments MP-225 Used to position pipette during recordings
Patchclamp Amplifier A-M Systems Model 2400 An equivalent amplifier is suitable
Bessel Filter Warner Instruments  LPF 202A Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.
Data Acquisition System  National Instruments NI PCIe-6321       781044-01 Used to record data from amplifier to computer
Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A National Instruments 779556-01 Used to connect amplifier to DAQ card.
Steel Foil  McMaster Carr 3254K7 Steel foil for custom recording chamber
Magnets K&J Magnetics D42 To secure recording chamber to ring stand
1/16" Cell Cast Acrylic Clear Pololu Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  2. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
  3. Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
  4. Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
  5. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
  6. Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
  7. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
  8. Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
  9. Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
  10. Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
  11. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
  12. Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
  13. Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
  14. Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
  15. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
  16. Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
  17. Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
  18. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
  19. Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
  20. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
  21. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
  22. Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
  23. Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).

Tags

מדעי המוח גיליון 132 דרוזופילה טטרודוטוקסין monosynaptic קישוריות NaChBac מעגל connectomics
בחינת חיבורים Monosynaptic <em>דרוזופילה</em> באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Gaudry, Q. Examining… More

Zhang, X., Gaudry, Q. Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels. J. Vis. Exp. (132), e57052, doi:10.3791/57052 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter