Method Article

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

DOI:

10.3791/57052

⸱

February 14th, 2018

 , 
1Department of Biology, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. הנה, טכניקה חדשה כינה Tetrotoxin (TTX) מהונדסים ההתנגדות של חיטוט Synapses (TERPS) מוחל לבדיקת monosynaptic קשרים בין נוירונים היעד. השיטה מסתמכת על ביטוי משותף activator הטרנסגניים עם הערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac, ב presynaptic נוירון מסוים. קשרים עם שותפים הפוסט-סינפטית בשם נקבעים לפי כל-תא הקלטות בנוכחות TTX, אשר חוסם פעילות חשמלית בנוירונים המבטאים לא NaChBac. גישה זו יכול להיות שונה כדי לעבוד עם activator או סידן הדמיה ככתב של חיבורים. TERPS מוסיף ערכת הכלים הזמינים עבור קביעת קישוריות בתוך רשתות הולך וגדל. עם זאת, TERPS הוא ייחודי בכך שהוא גם אמין ידווח בצובר או אמצעי שידור ושידור והתאמת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יעד מרכזי של מדעי המוח הוא למפות את הקשרים בין הנוירונים כדי להבין כיצד מידע זורם דרך מעגלים. גישות ומשאבים רבים הפכו להיות זמין לבדוק את תפקודי קישוריות בין הנוירונים בטווח של דגם מערכות1,2. כדי להפיק את תרשימים בחיווט המדויקות ביותר באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, חשוב לפתור אם חיבורים שנצפה בין שני תאים הם monosynaptic לעומת עקיף ו polysynaptic הישירים. תקן הזהב להכנת הבחנה זו בנוירונים יונקים זה מודדים ההשהיה בין יחיד action potentials בתאים presynaptic תחילתה של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSCs) בתוך הנוירון השני. חיבורים monosynaptic צריך השהיות ארוכות יותר קצר של כמה אלפיות השניה, השתנות נמוכה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מכינים זבובים וקווים יזם לזהות GAL4

  1. בחר קו יזם GAL4 וחצו אותה עם זבובים נושאת את transgene UAS-NaChBac והן של transgene optogenetic עבור הפעלה.
    הערה: UAS-CsChrimson11 נבחרה בשל מוליכות גבוהה שלה ואת הקלות שבה היא מפעילה בתיווך NaChBac פוטנציאל פעולה. UAS-NaChBac והן UAS-CsChrimson זמינים מהמאגר מניות בבלומינגטון.
  2. להכין כל טרנס רשתית כפתרון מניות אתנול (35 מ מ) ולאחסן את הפתרון במקפיא ב-20 ° C.
  3. מיקס 28 µL של המניה הזו אל תוך כ- 5 מ של תפוחי אדמה ולמיומנות אגיע מזון ומוסיפים תערובת זו העליון של הבקבוקון של מדיום דרוזופילה קונבנציונלי.
  4. להעלות את הזבוב הבוגר לבטא csChrimson על מזון המכיל 0.2 מ ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TERPS משמש להבחנה בין מונו - polysynaptic סיועה של קשרים סינפטיים בין נוירונים. בזמן גירוי חלשים של תא עשוי לשמש כדי לבדוק חיבורים ישירים, נהיגה יותר פעילות presynaptic לעיתים קרובות מגייס חיבורים polysynaptic (איור 1 א'). TERPS עובד על-ידי שיתוף לבטא תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac ו- activator optogenetic ולאחר בדיקת חיבורי בנוכחות TTX לחסל את חיבורי polysynaptic (איור 1B). TTX חוסם ביעילות פוטנציאל פעולה במוח דרוזופילה ,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח TERPS מחמאות הנוכחי טכניקות המשמשות עבור מעגל פיצוח על-ידי הפיכת זיהוי הסינפסות בין נוירונים שזוהה. באופן ספציפי, הגישה חושף קשרים monosynaptic על ידי בהרחבה להשתיק פוטנציאל פעולה עם TTX בעת שיחזור דעתנית אוכלוסיה בחירה של נוירונים עם תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac. שחרור סינפטית היא שהפיק optogenetic גירוי בזמן אירועים postsynaptic מנוטרים עם תאים כל הקלטות. TERPS מבדיל עצמו לבין גישות אחרות כגון תפיסתו על ידי רגיש בכמות גדולה או אמצעי שידור elicited למרחקים ארוכים, היכולת לבצע מניפולציות תרופתי. הטכניקה פשוטה יחסית.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות יהושע זינגר, ג'ונתן שנק, כמו גם מתחשב בודקים עבור הערות על כתב היד. כן נרצה להודות לבן בן, הרולד אשות לדיונים על הטכניקה. ג'ונתן שנק סיפקה את הנתונים עבור איור 3A. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן וייטהול, R21 של NIH על QG.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UAS-csChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55135משמש כמפעיל עצבי
UAS-NaChBacBloomington Drosophila Stock Center9466Resotores ריגוש בתאים ב-TTX
TetrodotoxinTochris1078ייתכן שיהיה צורך באישור מיוחד לרכישת TTX מכיוון שמדובר בחומר מבוקר
שכולו טרנס-רשתיתSigma-Aldrichall טרנס-רשתיתR2500דורש קו-פקטור עבור channelrhodopsin
Weldable 321 נירוסטה  גיליון,  0.002"  עבה,  10 אינץ'  מקמאסטר קאררחב 3254K7משמש לייצור מחזיק זבובים בהתאמה אישית. ניתן לחתוך נייר כסף מותאם אישית בלייזר ב-pololu.com מקובץ ה-PDF המצורף
דיסקציה מיקרוסקופZeissStemi 2000-Cמשמש לדיסקציה של הכנה
WaxerAlmoreEectra Waxer 66000משמש במהלך הדיסקציה כדי לאבטח את זבוב בנייר כסף
שעוות פרפיןJoann4917217בשימוש עם מלקחיים
מספר 5Fine Science Tools#5COמשמש לדיסקציה והסרת
מספרייםכלי מדע עדינים15001-08משמש להסרת חלקים מהציפורן במהלך דיסקציה
חוט טונגסטןמערכות A-M797500השתמש עם אלקטרוליזה לייצור מחטים מחודדות לדיסקציה
משאבה פריסטלטית מחזירהפשוט משאבות (אמזון)PM200Sלמחזור
בקר מהירות TTX עבור משאבה פריסטלטיתZitrades (אמזון)N/APWM בקר עמעום לנורות LED או סרט, 12 וולט 8 אמפר, מתג אור בהירות מתכוונן בקר דימר DC12V 8A 96W לאור רצועת לד B
Versa-Mount  ווסת אוויר דחוס מדויקMcMaster Carr1804T1להפעלת לחץ חיובי במהלך תיקון
מכלי זכוכיתמכשירי דיוק עולמייםTW150F-3עבור פיפטות תיקון
מד רב תכליתיMcMaster Carr3846K431מד לווסת לחץ
אלקטרופיזיולוגיה מצלמהDage MTI IR-1000כל מצלמה שעובדת בטווח ה-IR (850 ננומטר) תעבוד. אינך רוצה להשתמש בתאורה אדומה מכיוון שהדבר יכול להפעיל csChrimson
IR LEDThorlabs M850F2עבור סיב אופטי תאורה אלכסונית
עבור IR LEDThorlabsM89L01זוגות לעדשת אובייקטיבית LED IR
nbsp;אולימפוס 40XLUMPlanFLNזה יכול לשמש ברוב המיקרוסקיפים ועובד היטב להדמיית נוירונים של זבובים.
ענבר LEDThorlabsM590L3dלהמחשת RFP ו-mCherry
כחול LEDThorlabsM470L3dלהמחשת סט
מסנניGFP Chroma49011להדמיה של GFP או גירוי ערוץ2rhodopsin
סט מסנן mCherry מותאם אישיתChroma  et580/25x ו-t600LPXR (מהסט 49306) אך עם et610LP מחסום/אופטיקה פליטההשתמש רק אם ברצונך לתקן נוירונים מזוהים עם channel2rhodopsin
Dichroic כדי לשלב תאורת LED ענבר וכחולDMLP550Rהשתמש רק בתיקון מתחת ל-mCherry ולעורר את channel2rhodopsin עם אור כחול.
LEDאדוםSupplyCree XPE 620 - 630 ננומטרמשמש להנעת csChrimson
LED DriverLEDSupply3021-D-E-1000משמש להנעת נוריות LED לגירוי אופטוגנטי
מניפולטורSutter InstrumentsMP-225משמש למיקום פיפטה במהלך הקלטות
מגבר PatchclampA-M Systemsדגם 2400מגבר
בסל פילטרוורנר אינסטרומנטס LPF 202Aמסנן עזר המשמש לסינון עקבות זרם לאוסילוסקופ במהלך התיקון.
מערכת איסוף מידע נשיונל אינסטרומנטסNI PCIe-6321            781044-01משמש להקלטת נתונים ממגבר למחשב
בלוק מחברים - מסוף BNC BNC-2090ANational Instruments779556-01משמש לחיבור מגבר לכרטיס DAQ.
רדיד פלדה McMaster Carr3254K7רדיד פלדה לתא הקלטה מותאם אישית
מגנטיםK& J MagneticsD42כדי לאבטח את תא ההקלטה למעמד הטבעת
1/16 אינץ' תא יצוק אקריליקשקוף פולולומשמש לייצור תא הקלטה מותאם אישית. ניתן לחתוך אקריליק בלייזר pololu.com מקובץ ה-PDF המצורף
דיסקציה & GFP שווה ערך מתאים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  2. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal con....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tetrodotoxin Resistant Sodium ChannelsMonosynaptic ConnectionsDrosophila NeuronsWhole Cell RecordingsOptogenetic ActivationTetrodotoxin ApplicationPharmacological AntagonistsVolume Transmission AnalysisSynaptic Connection TestingElectrophysiology Rig Setup

Related Articles