Summary
Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.
Abstract
Aqui, uma nova técnica denominada Tetrotoxin (TTX) Engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS) é aplicada para testar monosynaptic conexões entre os neurônios do alvo. O método baseia-se na expressão co de um ativador de transgênico com o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac, em um neurônio específico pré-sináptica. Conexões com parceiros pós-sináptica putativos são determinadas por gravações de células inteiras na presença de TTX, que bloqueia a atividade elétrica de neurônios que expressam não NaChBac. Esta abordagem pode ser modificada para funcionar com qualquer ativador ou imagem latente de cálcio como um repórter de conexões. TERPS adiciona o crescente conjunto de ferramentas disponíveis para determinar a conectividade em redes. No entanto, TERPS é o único que relata também confiantemente em massa ou volume transmissão e transmissão de repercussões.
Introduction
Dos principais objetivos da neurociência é mapear as conexões entre os neurônios para entender como a informação flui através de circuitos. Inúmeros recursos e abordagens tornaram-se disponíveis para testar a conectividade funcional entre os neurônios em uma variedade de sistemas de modelo1,2. Para gerar os diagramas de fiação mais precisos usando eletrofisiologia, é importante resolver se observadas as conexões entre duas células são diretos e monosynaptic versus indireta e polysynaptic. Um padrão de ouro para fazer esta distinção nos neurônios de mamíferos é medir a latência entre action potentials único nas células pré-sináptica e o aparecimento de correntes pós-sináptico excitatórios (EPSCs) no segundo neurônio. Monosynaptic conexões devem ter latências curtas de alguns milissegundos e baixa variabilidade3. Essa abordagem pode ser complicada em neurônios invertebrados porque sinapses podem ocorrer em suas dendrites, longe de ser o local de gravação somática, causando atrasos na deteção devido tempo electrotonic distâncias entre conductances pós-sinápticos e a gravação eletrodo. Esses atrasos podem introduzir ambiguidade poli-contra contribuições monosynaptic. Além disso, pequenos eventos sinápticos podem deteriorar antes de chegar ao local de gravações somática e dirigindo mais forte atividade pré-sináptica, é prováveis que recrutar polysynaptic eventos.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para testar conexões monosynaptic em invertebrados. Uma abordagem utiliza as soluções de alta cátion divalente (Hi-Di) contendo excesso Mg ++ e Ca ++. Esta solução bloqueia conexões polysynaptic por redução de lançamento de probabilidade e limiar de ação potencial crescente para favorecer a deteção de entrada monosynaptic4,5. Determinar a proporção precisa de Mg Ca ++ ++ necessário, no entanto, não é trivial e contribuições polysynaptic podem persistir por estimulação mesmo modesto6. Uma abordagem alternativa, chamada reconstituição GFP entre parceiros sináptica (alcance) aproveita a proximidade entre as membranas pré e pós-sinápticas encontrado em sinapses para inferir uma conexão monosynaptic 7. Aqui, um componente da proteína verde fluorescente (GFP) é expresso em um neurônio, e o fragmento complementar da molécula é expresso em um parceiro pós-sináptica putativo. A presença de fluorescência indica que os dois neurônios estão em proximidade suficiente para permitir a reconstituição da molécula GFP e implica a existência de uma sinapse. ALCANCE pode relatar sinapses falsamente, no entanto, se duas células estreitamente tem Aposto membranas, como em um nervo ou Fascículo. Variantes de alcance eliminam tais falsos positivos por amarrar o fragmento pré-sináptica de GFP diretamente para synaptobrevin da, permitindo assim a reconstituição somente às sinapses ativo8. Enquanto compreensão e suas variantes têm sido fundamentais para determinar a conectividade funcional na drosófila CNS, algumas conexões podem não ser feitas visíveis pelo alcance se as distâncias entre parceiros pré e pós-sinápticas é relativamente grande. Isto é particularmente pertinente na avaliação da transmissão de volume associado a neuromodulação9 ou de inibição GABAérgica10.
Aqui, uma técnica complementar e romance é demonstrada para testar conexões diretas de monosynaptic no CNS da drosófila . Esse método, chamado tetrodotoxina engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS), trabalha pela expressão co da tetrodotoxina (TTX)-canal de sódio resistente, NaChBac e um ativador de optogenetic em uma célula pré-sináptica durante a gravação de putativo parceiros pós-sináptica9. Na presença de TTX, toda a atividade mediada por potencial de ação é suprimida em células diferentes dos expressando NaChBac. O canal NaChBac restaura seletivamente excitabilidade na célula pré-sináptica alvo, permitindo a transmissão sináptica luz-evocada. Este método permite forte ativação dos neurônios pré-sináptica, tal que as conexões podem ser resolvidas pós-sinapticamente pela gravação somática, reduzindo a probabilidade de recrutamento de circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite o estudo da transmissão de volume e revela a propagação do transmissor liberado de um único neurônio ao longo de um circuito. Além disso, TERPS pode revelar a natureza química da conexão através de farmacologia convencional. TERPS é adequado para uso em qualquer modelo de sistema que permite a expressão transgênica da diferenciação de TTX canais de sódio.
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Protocol
1. prepare a moscas e GAL4 identificar linhas de promotor
- Selecione uma linha de promotor GAL4 e cruzá-la com moscas carregando tanto o transgene UAS-NaChBac e um optogenetic transgene para ativação.
Nota: UAS-CsChrimson11 é selecionado devido a sua alta condutância e a facilidade com a qual ele ativa de potenciais de ação mediada por NaChBac. Tanto UAS-NaChBac e CsChrimson-UAS estão disponíveis no repositório de estoques de Bloomington. - Prepare-se como uma solução em etanol (35mm) all-trans retinal e armazenar a solução em congelador a-20 ° C.
- Mix 28 µ l desta unidade populacional em cerca de 5 mL de batata rehidratada flake comida e adicione esta mistura na parte superior de um frasco de meio de Drosophila convencional.
- Levante o adultas moscas expressando csChrimson em alimentos contendo 0,2 mM todo-trans-retinal para 1 a 3 dias,11.
2. prepare o estoque TTX
- Crie uma solução stock de 1mm TTX em água destilada ou desionizada. Guarde esta solução em um frigorífico de laboratório durante vários meses. Verificar as instituições políticas a respeito do armazenamento de TTX como muitas instituições classificam TTX como uma substância perigosa ou controlada.
3. prepare moscas para eletrofisiologia
- Colete 1 – 3 dias velho adulto voa que são gerados na comida com all-trans-retinal.
Nota: Consulte Murthy e Turner em 2013 para uma descrição detalhada do patch aperto Drosophila neurônios12,13. - Coloque as moscas em um frasco de cintilação. Coloque o frasco em gelo por 1 min imobilizar as moscas.
- Use pinça grossa para inserir uma mosca em uma câmara de gravação sob medida. A câmara consiste de um 3 ½" círculo cortado a laser de acrílico 1/16". Corte um buraco ¾" é para o centro onde uma folha personalizada é fixada com cola epoxy de 2 partes. A folha contém um triangular em forma de esperança que a mosca é inserida.
- Aplica cera ou UV curável epóxi em torno do animal para fixá-lo firmemente dentro da câmara de gravação.
- Ilumine a preparação com um pescoço de cisne de fibra ótica para visualização sob um estereomicroscópio. Defina as fibras de pescoço de cisne para iluminação oblíqua, ajustando-os para que eles iluminam a voar directamente do lado.
- Ajuste o nível de luz a mais baixa possível que ainda permite a visualização clara de uma mosca. Esta intensidade de luz irá variar através de experiências individuais.
Nota: Este protocolo pode ser adaptado usando um em situ cérebro explant método14. - Recupere a solução salina de gravação externa. O soro contém em mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfônico, 8 trealose, glicose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2e 4 de MgCl2 (ajustada para mΩ 270-275). A solução salina é alternassem com 95% O25% CO2 (carbogênio) e tem um pH ajustado a 7.315.
- Coloque 4 a 6 gotas de solução salina de gravação extracelular sobre a preparação de voar. Neste ponto, aumente o nível de luz para o microscópio de dissecação para melhor visibilidade.
- Afie um fio de tungstênio usando eletrólise. Para fazer o fio, preparar uma solução saturada de KNO3 e aplique aproximadamente 20 V de AC corrente enquanto mergulhando a ponta do fio na solução de 20 vezes para 100 ms cada, até que a ponta é afiada. Use o fio de tungstênio afiada para remover a cutícula na cabeça de mosca e, portanto, expondo o cérebro.
- Ainda mais expor o cérebro removendo a traqueia e os corpos de gordura que o rodeiam. Se acessando os lóbulos da antena, use um fio de tungstênio tortos ou ferramenta semelhante aconchegar-se suavemente antenas debaixo da folha câmara para aumentar a visibilidade de gravação. Use o fórceps afiado a rasgar o invólucro glia cobrindo a área de interesse, onde as gravações serão feitas suavemente.
- Transferi a câmara de gravação para o equipamento de eletrofisiologia. Imediatamente iniciar perfusão com solução salina de gravação externa borbulhava com carbogênio para preservar o cérebro. O reservatório de solução salina é colocado acima do palco do microscópio e gravidade-alimentado à preparação. Use uma linha de vácuo e um frasco de Erlenmeyer de 2L para recolher a resíduos salina.
4. obter gravação de células inteiras
- Puxe um extrator comercial pipeta pipetas de remendo. Consulte o manual de configurações alcançar uma pipeta apropriada com uma resistência de ponta perto de 7 mΩ.
- Adicione 4 µ l da solução de gravação interna para uma pipeta de remendo. O soro fisiológico interno consiste de aspartato de potássio 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl em mM.
- Configure o amplificador de braçadeira do remendo para gravação de células inteiras. Zero offsets do amplificador e definir o amplificador para fornecer pulsos de teste. Aqui, um amplificador de braçadeira de Patch de sistemas AM 2.400 é usado.
- Aplicar pressão positiva através da pipeta e abordagem da célula. Use um micromanipulador para direcionar a pipeta e entre em contato com a célula. Liberar a pressão positiva. Conjunto o potencial de exploração da membrana de -60 mV. A pipeta deve formar um gigaohm selo com a membrana da célula, como evidenciado por um sub-picoamp baixo segurando atual.
Nota: Se usar GFP guiado a célula alvo, tente minimizar o uso de luz epifluorescente para impedir ativação ChR2 e potencial depressão sináptica. Também aguarde alguns minutos antes de aplicar o passo 5. - Definir o amplificador para entregar o teste pulsos de -50 mV a -60 mV. Essa configuração é padrão nos amplificadores da remendo-braçadeira. Pulsos de teste irão revelar um grande transiente capacitiva que representa a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Remova capacitiva transientes ajustando os botões de compensação de capacidade na AM 2400 ou amplificador semelhante.
- Aplica breves pulsos de pressão negativa para a ruptura da membrana celular e obter configuração de células inteiras.
Nota: Uma configuração de celular é observada quando há um grande aumento da capacitiva transientes mostrando a capacitância do neurônio. Um pequeno aumento na exploração atual (linha de base) provavelmente será também observado. Definir o amplificador para o atual modo de grampo e ajustar o potencial da célula de -50 a -60 mV.
5. testar a conectividade sináptica
- Configure o sistema de aquisição (DAQ) dados para acionar um driver de LED para gerar pulsos de luz. Aqui, um sistema DAQ de instrumentos nacionais é usado com Matlab para entregar um sinal analógico para um driver de LED. A intensidade do LED é ajustada através do sinal analógico para o motorista. O LED é um comprimento de onda 620-630 nm LED.
- Posicione o alta potência LED vermelho diretamente debaixo de preparação. Ajuste a intensidade da luz para que 0.238 mW/mm2 atinge a mosca.
- Ative os neurônios pré-sináptica durante a gravação da célula pós-sináptica de interesse. Atingir a célula ativação optogenetically, pharmacogentically, ou através da estimulação do nervo. Aqui, breves pulsos de luz vermelha e csChrimson são aplicados.
Nota: Conexões sinápticas podem ser monitoradas em braçadeira atual como EPSPs ou grampo de tensão como EPSCs. Uma conexão sináptica deve ser visível antes de aplicar a TTX em resposta a um pulso de luz de 40 ms. Se nenhuma conexão é observado, é improvável que os neurônios estão synaptically ligados ou mono - ou polysynaptically. A potencial de exploração pode ser ajustada para enfatizar conexões excitatórias ou inibitórias em conformidade. - Se uma conexão é observado em solução salina normal, adicionar TTX no sistema de perfusão para obter uma concentração final de 1 µM. usar uma bomba de recirculação para capturar e reutilizar o soro fisiológico para conservar TTX. A bomba peristáltica irá desenhar a solução salina do banho e devolvê-lo para o reservatório de solução salino.
- Ajuste a velocidade da bomba para fornecer um forte vácuo constante que não permite esse nível salino no banho para subir e descer.
Nota: A aplicação da TTX deve resultar na cessação da actividade no neurônio que está sendo monitorado em células inteiras de cravação. Isto confirma que suficiente TTX foi adicionado para o soro. - Aplica breves pulsos de luz vermelha (40 ms para cada pulso) novamente. Neste ponto, qualquer conexão sináptica que permanece é provável monosynaptic. Adicione antagonistas farmacológicas para testar a natureza química das ligações sinápticas que permanecem em TTX, solução salina a recirculação.
Nota: Quando a combinação de optogenetics e direcionamento fluorescente de neurônios, pode ser importante para não ativar persistentemente a população pré-sináptica dos neurônios ao tentar obter uma gravação. Isto pode conduzir à depressão sináptica e torna difícil ver conexões. Porque csChrimson tem uma faixa de excitação longo que se estende amplamente para a gama de proteína verde fluorescente, um fluoróforo vermelho pode ser usado para visualizar os neurônios e channel2rhodopsin (Ch2R) pode ser usado para excitar a populações de células. Fazer isso requer genética específica e um cubo de filtro personalizado. Para gerar moscas adequadas, fazer moscas que expressam o fluoróforo vermelho (RFP ou mCherry) sob os sistemas de expressão binário sistema LexA ou Q. Estas precisará ser cruzados com moscas expressando um promotor Gal4 e UAS-Ch2R e UAS-NaChBac genes efetores. O cubo do filtro ideal para epifluorescência terá uma escala estreita da excitação para excitar o fluoróforo vermelho, mas não excita a Ch2R... Além disso, o conjunto de filtro deve incluir um filtro de emissão de passe longo para coletar tanta luz emitida. Nós usamos um filtro personalizado definido de Chroma que incluía parte números et580/25 x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com um filtro de barreira/emissão de et610lp.
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Representative Results
TERPS é usado para distinguir entre mono e polysynaptic contribuições em conexões sinápticas entre os neurônios. Enquanto fraca estimulação de uma célula pode ser usada para testar conexões diretas, dirigindo a maior atividade pré-sináptica frequentemente recruta polysynaptic conexões (figura 1A). TERPS funciona co, expressando o diferenciação de TTX canal de sódio NaChBac e um ativador de optogenetic e testes de conexões na presença de TTX para eliminar ligações polysynaptic (figura 1B). TTX efetivamente bloqueia os potenciais de ação no cérebro drosófila , tornando-se uma preparação adequada para TERPS (Figura 2A). Expressão transgênica do canal de sódio NaChBac resgata a excitabilidade nos neurônios e resulta em um potencial grande planalto (Figura 2B).
Interneurônios locais (LN) no lóbulo da antena mostram respostas robustas para estimulação olfativa (Figura 3A). No entanto, porque EPSPs individuais não são facilmente resolvidos no soma LN, permanece obscuro se tais respostas surgem diretamente da entrada do neurônio olfactory do receptor (ORN) ou indirectamente de entrada através de neurônios de projeção (PN) (Figura 3B). Usando TERPS, ORNs mostrados aqui, na verdade fazer conexões sinápticas diretas com LNs (Figura 3).
Uma característica única do TERPS é sua habilidade para resolver especificamente a transmissão sináptica extra volume que pode ocorrer com GABA ou neuromodulators tais como a serotonina. Estimulação de um neurônio serotoninérgico (o CSDn) no lóbulo da antena Drosophila resulta em uma mistura de excitação e inibição em um interneurônio local (Figura 4A e 4B figura). A excitação é meditada pela acetilcolina transmissor excitatório e a inibição é causada pela serotonina (Figura 4 e Figura 4). TERPS pode ser usado para determinar se as conexões estão monosynaptic eliminando conexões polysynaptic (Figura 4E). Em TTX, uma forte inibição ainda é observada na FLN, sugerindo que chega de directamente a partir da ativação de um neurônio serotoninérgico específico (Figura 4F e Figura 4). Esta conexão está bloqueada por metisergida de antagonista da serotonina. A sinapse excitatória mediada por acetilcolina foi eliminado em TTX, sugerindo que ela surgiu de fontes polysynaptic.
Figura 1 : TERPS elimina conexões polysynaptic e isola entradas monosynaptic. (A). um diagrama esquemático mostrando que a crescente atividade pré-sináptica pode recrutar conexões polysynaptic. (B). um diagrama ilustrando como TERPS pode remover polysynaptic contribuições usando TTX para eliminar cravação atividade nos neurônios. Excitabilidade é exclusivamente restaurada em uma população de neurônios que podem então ser animado optogenetically. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : NaChBac restaura a excitabilidade neuronal em Drosófila neurônios. (A) a aplicação de 1 µm que TTX abole a cravação em Drosophila neurônios. Tanto atividade espontânea e inibição de odor-evocados são eliminados por TTX. (B) NaChBac e csChrimson são expressos no CSDn e o cérebro é exposto a TTX. csChrimson estimulação depolarizes a CSDn e depois um limite é ultrapassado, não há grandes não-linear de aumento de tensão da membrana CSDn. Esta rápida despolarização constitui um planalto como potencial (baixo-relevo). Cada cor em intensidades de simulação corresponde a mesma cor em baixo-relevo a tensão. Esta figura foi modificada de Zhang e 2016 Gaudry9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : TERPS revela monosynaptic conexões entre ORNs e LNs. (A), A gravação de amostra mostrando uma resposta de odor em um LN. Esta resposta pode ser mono ou polysynaptic na natureza. (B) TERPS pode ser testado na ORN a sinapse LN. TTX é usada para bloquear potenciais de ação e excitabilidade em todas as células na preparação. Excitabilidade é exclusivamente restaurada nos ORNs através do canal de sódio NaChBac. Os ORNs podem então ser animados com channelrhodopsin para eliciar liberação sináptica. Eventos sinápticos são medidos usando post-synaptically gravações de células inteiras. (C) TERPS revela que a ORN a sinapse LN é monosynaptic. TERPS também podem ser combinados com farmacologia para mostrar que a sinapse é colinérgicos e bloqueado pelo mecamylamine de antagonista do receptor nicotínico (200 µM). A barra vertical cinza indica o tempo de estimulação ORN. Esta figura foi modificada de Zhang e Gaudry em 20169. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : TERPS é sensível ao lançamento de transmissão em massa ou volume de neurônios moduladora. (A) a estimulação dos resultados CSDn em um potencial de ação de um LN gravado no lóbulo da antena drosófila . (B) o LN é hyperpolarized para que CSDn estimulação resulta em uma atividade abaixo do limite. A resposta de LN consiste de uma rápida despolarização seguida por uma hiperpolarização mais lenta. A barra cinzenta denota o tempo de estimulação CSDn. Metisergida (50 µM), um antagonista dos receptores de 5-HT amplo, bloqueia a hiperpolarização lenta mas não tem efeito sobre a despolarização. Mecamylamine bloqueia a despolarização rápida, sugerindo que é colinérgico na natureza. TERPS (C) pode ser usada para resolver que componentes químicos do CSDn a sinapse LN são mono-contra polysynaptic. (D) o CSDn é estimulada na presença de TTX e respostas pós-sinápticas do LN são medidas em gravações de células inteiras. A hiperpolarização persiste em TTX sugerindo é monosynaptic na natureza. Este hiperpolarização também é bloqueada por metisergida, consistente com transmissão serotoninérgico. A breve despolarização que permanece em TTX é provavelmente mediada por lacuna eléctrica de acoplamento, como não bloqueado por antagonistas nicotínicos. Esta figura foi modificada de Zhang e Gaudry em 20169. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo complementar 1: folha de drosófila. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo complementar 2: câmara de fisiologia. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Análise TERPS elogios atuais técnicas usadas para circuito rachando, permitindo a detecção de sinapses entre os neurônios identificados. Especificamente, a abordagem revela conexões monosynaptic por silenciar amplamente os potenciais de ação com TTX enquanto restaura a excitabilidade numa população de neurônios com o canal de sódio TTX diferenciação NaChBac selecione. Liberação sináptica é provocada pela estimulação optogenetic enquanto eventos pós-sinápticos são monitorados com gravações de células inteiras. TERPS distingue-se de outras abordagens como alcance por serem sensíveis à granel ou transmissão de volume suscitou em distâncias mais longas e a capacidade de executar manipulações farmacológicas. A técnica é relativamente simples de empregar e requer apenas uma gravação eletrodo e uma fonte de luz para a estimulação de optogenetic, que é mais viável do que a obtenção de duplas célula inteira gravações em partes pré e pós-sináptica da sinapse. Um requisito básico de TERPS é que potenciais de ação são facilmente bloqueados por TTX no sistema a ser estudado. Mas, porque TTX age sobre os neurônios em uma ampla gama de filos taxonômicas, é provável que TERPS pode ser amplamente aplicada para ambos os sistemas modelo de mamíferos e invertebrados.
TERPS pode ser facilmente modificado em um número de maneiras de facilitar também a estimulação da população pré-sináptica putativa ou para gravação de alvos pós-sinápticos. Aqui, uma ferramenta de optogenetic foi usada para estimular as populações-alvo, por uma variedade de mecanismos, a ativação é possível. Estimulação do nervo de axônios sensoriais, por exemplo, é rotina nos estudos da transmissão do nervo da antena em Drosophila16 e é adequada em outros sistemas sensoriais, incluindo nervos periféricos contendo neurônios mechanosensory. Uma abordagem semelhante para testar a conectividade funcional em Drosophila expressa indicadores de cálcio GCaMP em uma população de neurônios durante a condução de atividade em outra população através da geleificação purinoceptor P2X2 e ATP aplicação2. Esta abordagem deve ser compatível com TERPS expressando simplesmente co o transgene de NaChBac com o receptor P2X2 em um neurônio e GCaMP em outra população para um método completamente livre de remendo. No entanto, cuidado deve ser tomado com abordagens causando depolarizations mais lentos, tais como os receptores de desenhador muscarínicos baseada exclusivamente ativados por um de17,de droga (DREADDs)18. Despolarização lenta pode levar a inativação de NaChBac antes da geração do potencial de ação.
Métodos semelhantes para TERPS têm sido empregados em sistemas de mamíferos. Tais técnicas combinam TTX e channelrhodopsin para mapear a conectividade entre os neurônios. Channelrhodopsin ativação sozinha geralmente não despolarizar neurônios suficientemente, e, portanto, o bloqueador de canal de potássio 4-AP é ser aplicado com TTX eliciar lançamento19,20,21. Enquanto isso funciona em muitas sinapses, pode não funcionar em algumas sinapses metabotrópicos se o alvo a jusante do receptor é um canal de potássio sensível 4-AP. Por exemplo, serotoninérgico modulação da resposta olfativa em traça se baseia diretamente na modulação de tal um 4-AP sensível K+ corrente (IA)22. Esta abordagem também não funcionou do CSDn a sinapse LN (dados não mostrados). Assim, TERPS tem uma vantagem de exigir menos intervenção farmacológica em comparação com outros métodos comumente utilizados e pode trabalhar à escala mais larga ou sinapses.
Existem algumas limitações para TERPS que devem ser considerados. Primeiro, pode haver efeitos colaterais potenciais de expressão crônica do canal NaChBac durante todo o desenvolvimento. Função e montagem de circuitos adequada podem ser confirmadas, comparando a atividade de neurônios entre controle moscas falta a construção de NaChBac e voa com a construção, na ausência de TTX. Para evitar tais problemas, expressão do transgene NaChBac podia ser controlado temporalmente através de expressão do repressor de GAL4 sensíveis à temperatura, GAL8023. Além disso, se uma sinapse é observada somente em uma maneira dependente do estado, é concebível que suprimindo a atividade de rede com TTX pode esconder tal uma conexão. É importante ressaltar que uma conexão positiva observada com TERPS provável representa uma verdadeira conexão mono-sinápticas, enquanto um resultado negativo não é prova da ausência de uma conexão.
Enquanto TERPS pode revelar a capacidade do emissor de lançamento de um neurônio para afetar o parceiro pós-sináptica claramente, a dinâmica do canal lento de NaChBac e os potenciais de platô associados com sua ativação torná-lo menos aplicável ao estudo dos clássicos neurotransmissão. Uma abordagem para alterar TERPS para mais rapidamente, liberação de transmissor mais natural será expressar uma versão modificada de TTX diferenciação da endógena drosófila de sódio canal pará em oposição ao NaChBac. Esta alteração poderia resultar em atividade de cravação naturalista na célula pré-sináptica e permitir análise mais convencional de transmissão sináptica na ausência de atividade da rede. Isso teria grande potencial para estudos de sinapses taxa-codificação, que desencadeiem uma ampla gama de atividade pré-sináptica sem polysynaptic redes de recrutamento seria desejável.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Joshua Singer, Jonathan Schenk, bem como os revisores pensativos para comentários sobre o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Ben White e Harold Zakon para discussões sobre a técnica. Jonathan Schenk forneceu os dados para a Figura 3A. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação Whitehall e um R21 NIH ao QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
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