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Neuroscience

Tetrodotoxin प्रतिरोधी सोडियम चैनलों का उपयोग Drosophila में Monosynaptic कनेक्शन की जांच

Published: February 14, 2018 doi: 10.3791/57052
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Maryland

Summary

यह आलेख tetrodotoxin और tetrodotoxin-प्रतिरोधी सोडियम चैनल, NaChBac को नियोजित करके न्यूरॉन्स के बीच monosynaptic कनेक्शन का परीक्षण करने के लिए एक विधि सुविधाएँ.

Abstract

यहां, एक नई तकनीक Tetrotoxin (TTX) जांच के लिए इंजीनियर प्रतिरोध Synapses (TERPS) के लिए लक्ष्य ंयूरॉंस के बीच monosynaptic कनेक्शन के लिए परीक्षण के लिए आवेदन किया है । विधि सह पर निर्भर करता है, एक विशिष्ट presynaptic ंयूरॉन में tetrodotoxin प्रतिरोधी सोडियम चैनल, NaChBac, के साथ एक ट्रांसजेनिक उत्प्रेरक की अभिव्यक्ति । ख्यात पोस्ट के साथ कनेक्शन-synaptic भागीदारों TTX की उपस्थिति में पूरे सेल रिकॉर्डिंग द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, जो NaChBac व्यक्त नहीं करते कि न्यूरॉन्स में विद्युत गतिविधि ब्लॉक. इस दृष्टिकोण को किसी भी उत्प्रेरक या कनेक्शन के एक रिपोर्टर के रूप में कैल्शियम इमेजिंग के साथ काम संशोधित किया जा सकता है । TERPS नेटवर्क के भीतर कनेक्टिविटी निर्धारित करने के लिए उपलब्ध उपकरणों के बढ़ते सेट को जोड़ता है । हालांकि, TERPS कि यह भी मज़बूती से थोक या वॉल्यूम ट्रांसमिशन और spillover ट्रांसमिशन रिपोर्ट में अद्वितीय है ।

Introduction

तंत्रिका विज्ञान के एक प्रमुख लक्ष्य को समझने के लिए कैसे जानकारी सर्किट के माध्यम से बहती ंयूरॉंस के बीच कनेक्शन नक्शा है । कई दृष्टिकोण और संसाधनों के लिए मॉडल सिस्टम1,2की एक श्रेणी में ंयूरॉंस के बीच कार्यात्मक संपर्क के लिए परीक्षण उपलब्ध हो गए हैं । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर सबसे सटीक तारों आरेख उत्पन्न करने के लिए, यह दो कोशिकाओं के बीच मनाया कनेक्शन प्रत्यक्ष और monosynaptic बनाम अप्रत्यक्ष और polysynaptic हैं कि क्या हल करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्तनधारी न्यूरॉन्स में इस अंतर को बनाने के लिए एक सोने के मानक presynaptic कोशिकाओं में एकल कार्रवाई क्षमता के बीच विलंबता को मापने और उत्तेजक postsynaptic धाराओं (EPSCs) की शुरुआत में दूसरे ंयूरॉन. Monosynaptic कनेक्शंस में कुछ मिलीसेकंड और कम परिवर्तनशीलता3की लघु विलंब होनी चाहिए । यह दृष्टिकोण invertebrate न्यूरॉन्स में जटिल हो सकता है क्योंकि synapses उनके dendrites तक दैहिक रिकॉर्डिंग साइट से हो सकता है, postsynaptic conductances और रिकॉर्डिंग के बीच लंबी electrotonic दूरी की वजह से पता लगाने में देरी के कारण इलेक्ट्रोड. इस तरह की देरी पाली बनाम monosynaptic योगदान के बारे में अस्पष्टता का परिचय कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, दैहिक रिकॉर्डिंग साइट तक पहुंचने से पहले छोटे synaptic घटनाओं क्षय हो सकता है, और मजबूत presynaptic गतिविधि ड्राइविंग, polysynaptic घटनाओं की भर्ती होने की संभावना है ।

अकशेरूकीय में monosynaptic कनेक्शन के लिए परीक्षण के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया है । एक दृष्टिकोण उच्च divalent कटियन समाधान (हाय-Di) अतिरिक्त मिलीग्राम+ + और सीए+ +युक्त का उपयोग करता है । यह समाधान monosynaptic इनपुट4,5का पता लगाने के पक्ष में रिलीज़ प्रायिकता को कम करने और कार्रवाई संभावित थ्रेशोल्ड को बढ़ाने से polysynaptic कनेक्शन ब्लॉक करता है । मिलीग्राम की सटीक अनुपात का निर्धारण+ + करने के लिए सीए ++ आवश्यक, तथापि, तुच्छ नहीं है और polysynaptic योगदान भी मामूली उत्तेजना6के लिए बनी रह सकती है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण Synaptic भागीदारों भर में GFP पुनर्गठन कहा जाता है (समझ) पूर्व के बीच निकटता का लाभ लेता है और postsynaptic झिल्ली synapses में पाया एक monosynaptic कनेक्शन 7का अनुमान है । यहां, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक घटक (GFP) एक ंयूरॉन में व्यक्त की है, और अणु के पूरक टुकड़ा एक ख्यात postsynaptic साथी में व्यक्त की है । प्रतिदीप्ति की उपस्थिति इंगित करता है कि दो न्यूरॉन्स करीब पर्याप्त निकटता में हैं GFP अणु के पुनर्गठन की अनुमति और एक synapse के अस्तित्व का तात्पर्य. समझ synapses झूठी रिपोर्ट कर सकते हैं, हालांकि, अगर दो कोशिकाओं को बारीकी से apposed झिल्ली है, के रूप में एक तंत्रिका या fascicle में । समझ के वेरिएंट synaptobrevin करने के लिए सीधे GFP के presynaptic टुकड़ा tethering द्वारा इस तरह के झूठे सकारात्मक को खत्म करने, इस प्रकार केवल सक्रिय synapses8पर पुनर्गठन की अनुमति । जबकि समझ और उसके वेरिएंट में कार्यात्मक संपर्क का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है Drosophila सीएनएस, कुछ कनेक्शन नहीं किया जा सकता दिखाई समझ से अगर पूर्व और postsynaptic भागीदारों के बीच दूरी अपेक्षाकृत बड़ी है । यह neuromodulation9 या GABAergic संकोच10के साथ जुड़े मात्रा संचरण के आकलन में विशेष रूप से प्रासंगिक है ।

यहां, एक पूरक और उपंयास तकनीक Drosophila सीएनएस में प्रत्यक्ष monosynaptic कनेक्शन के परीक्षण के लिए प्रदर्शन किया है । इस विधि, Synapses (TERPS) की जांच के लिए Tetrodotoxin इंजीनियर प्रतिरोध कहा जाता है, सह द्वारा काम करता है Tetrodotoxin की अभिव्यक्ति (TTX)-प्रतिरोधी सोडियम चैनल, NaChBac, और एक optogenetic कक्ष में एक presynaptic उत्प्रेरक जबकि ख्यात से रिकॉर्डिंग postsynaptic पार्टनर्स9. TTX की उपस्थिति में, सभी कार्रवाई संभावित मध्यस्थता गतिविधि उन NaChBac व्यक्त करने के अलावा अन्य कोशिकाओं में दबा दिया है. NaChBac चैनल चुनिंदा लक्षित presynaptic सेल (ओं) में उत्तेजित पुनर्स्थापित करता है, प्रकाश-synaptic संचरण की अनुमति । इस विधि presynaptic ंयूरॉंस की मजबूत सक्रियण परमिट, इस तरह कि कनेक्शन दैहिक रिकॉर्डिंग द्वारा postsynaptically हल किया जा सकता है, जबकि polysynaptic सर्किट भर्ती की संभावना को कम करने । महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक की मात्रा संचरण के अध्ययन परमिट और एक सर्किट भर में एक ंयूरॉन से जारी ट्रांसमीटर के प्रसार से पता चलता है । इसके अलावा, TERPS पारंपरिक औषध विज्ञान के माध्यम से कनेक्शन की रासायनिक प्रकृति प्रकट कर सकते हैं । TERPS किसी भी मॉडल प्रणाली है कि TTX असंवेदनशील सोडियम चैनलों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति की अनुमति देता में उपयोग के लिए उपयुक्त है ।

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Protocol

1. मक्खियों को तैयार करने और GAL4 प्रमोटर लाइनों की पहचान

  1. एक GAL4 प्रमोटर लाइन का चयन करें और यह दोनों यूएएस-NaChBac transgene और सक्रियण के लिए एक optogenetic transgene ले मक्खियों के साथ पार ।
    नोट: यूएएस-CsChrimson11 अपने उच्च कंडक्टर और आसानी के साथ जो यह NaChBac-मध्यस्थ कार्रवाई क्षमता को सक्रिय करता है के कारण चुना गया है । ब्लूमिंगटन स्टॉक्स भण्डार से यूएएस-NaChBac और यूएएस-CsChrimson दोनों ही उपलब्ध हैं ।
  2. इथेनॉल में एक शेयर समाधान के रूप में सभी ट्रांस रेटिना तैयार (३५ mM) और में फ्रीजर समाधान की दुकान-20 डिग्री सेल्सियस ।
  3. इस शेयर के 28 µ l को मिक्स करके हाइड्रेटेड आलू की गुच्छी खाने के लगभग 5 मिलीलीटर में मिलाएं और इस मिश्रण को पारंपरिक Drosophila मीडियम की एक शीशी के ऊपर डालें ।
  4. 1-3 दिन11के लिए ०.२ mM सभी ट्रांस-रेटिना युक्त भोजन पर csChrimson व्यक्त वयस्क मक्खी उठाएं ।

2. तैयार TTX स्टॉक

  1. आसुत या TTX पानी में 1 मिमी का एक स्टॉक समाधान बनाएं । कई महीनों के लिए एक प्रयोगशाला रेफ्रिजरेटर में इस समाधान की दुकान । TTX के भंडारण के संबंध में संस्थानों की नीतियों की जांच के रूप में कई संस्थाओं एक खतरनाक या नियंत्रित पदार्थ के रूप में TTX वर्गीकृत ।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए मक्खियों तैयार

  1. इकट्ठा 1 – 3 दिन पुराने वयस्क मक्खियों कि सभी ट्रांस-रेटिना के साथ भोजन पर उठाया जाता है ।
    नोट: २०१३ में मूर्ति और टर्नर के लिए देखें पैच clamping Drosophila ंयूरॉंस12,13के विस्तृत विवरण के लिए ।
  2. मक्खियों को एक गिलास जुटाकर शीशी में रख दें । मक्खियों को स्थिर करने के लिए 1 मिनट के लिए शीशी को बर्फ पर रखें ।
  3. किसी कस्टम-निर्मित रिकॉर्डिंग चैंबर में एक मक्खी डालने के लिए मोटे संदंश का प्रयोग करें । चैंबर एक 3 ½ के होते हैं "सर्कल लेजर 1/16 से काटा" एक्रिलिक । कट एक ¾ "छेद केंद्र में है, जहां एक कस्टम पंनी 2 भाग epoxy के साथ जुड़ा हुआ है । पन्ना एक त्रिकोणीय आकार आशा है कि मक्खी में डाला जाता है शामिल हैं.
  4. मजबूती से यह रिकॉर्डिंग चैंबर के भीतर सुरक्षित करने के लिए पशु के आसपास मोम या यूवी का इलाज epoxy लागू करें ।
  5. एक stereomicroscope के तहत दृश्य के लिए एक gooseneck ऑप्टिकल फाइबर के साथ तैयारी को रोशन । वे पक्ष से सीधे मक्खी रोशन इतना है कि उन्हें समायोजित करके परोक्ष रोशनी के लिए gooseneck फाइबर सेट करें ।
  6. अभी भी मक्खी का स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है कि सबसे कम संभव सेटिंग करने के लिए प्रकाश स्तर समायोजित करें । इस प्रकाश की तीव्रता व्यक्तिगत प्रयोगों में भिन्न होगी.
    नोट: इस प्रोटोकॉल एक में सीटू मस्तिष्क explant विधि14का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है ।
  7. बाहरी रिकॉर्डिंग खारा निकालते हैं । खारा मिमी में शामिल हैं: १०३ NaCl, 3 KCl, 5 एन-tris (hydroxymethyl) मिथाइल-2-aminoethane-sulfonic एसिड, 8 trehalose, 10 ग्लूकोज, 26 NaHCO3, 1 णः2पीओ4, १.५ CaCl2, और 4 MgCl2 (समायोजित करने के लिए 270 – 275 mΩ) । खारा ९५% ओ2/5% CO2 (carbogen) के साथ bubbled है और ७.३15करने के लिए एक पीएच समायोजित किया है ।
  8. उड़ान तैयारी पर extracellular रिकॉर्डिंग खारा की 4-6 बूंदें प्लेस । इस बिंदु पर, बेहतर दृश्यता के लिए विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी पर प्रकाश स्तर बढ़ाएं ।
  9. इलेक्ट्रोलिसिस का उपयोग कर एक टंगस्टन तार पैनापन । तार बनाने के लिए, KNO के एक संतृप्त समाधान तैयार3 और लगभग 20 V एसी वर्तमान के लागू है जबकि समाधान में तार की नोक सूई १०० ms के लिए 20 बार प्रत्येक जब तक टिप तेज है । मक्खी के सिर पर छल्ली को हटाने और इस तरह मस्तिष्क को उजागर करने के लिए तेज टंगस्टन तार का प्रयोग करें ।
  10. इसके अलावा श्वासनली और वसा शरीर है कि यह चारों ओर हटाने के द्वारा मस्तिष्क का पर्दाफाश । यदि antennal पालियों तक पहुंचने, एक तुला टंगस्टन तार या इसी तरह के उपकरण का उपयोग करने के लिए धीरे पंनी रिकॉर्डिंग चैंबर दृश्यता में वृद्धि के नीचे एंटीना टक । तीव्र संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे दूर glial आवरण के हित के क्षेत्र को कवर जहां रिकॉर्डिंग किया जाएगा ।
  11. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के लिए रिकॉर्डिंग चैंबर स्थानांतरण. तुरंत बाहरी रिकॉर्डिंग खारा carbogen के साथ bubbled मस्तिष्क की रक्षा के साथ छिड़काव शुरू करते हैं । खारा समाधान जलाशय खुर्दबीन स्टेज के ऊपर रखा गया है और गुरुत्वाकर्षण को तैयार करने के लिए खिलाया है । अपशिष्ट खारा इकट्ठा करने के लिए एक वैक्यूम लाइन और एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी का उपयोग करें ।

4. पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करें

  1. एक वाणिज्यिक पिपेट खींचने पर पैच पिपेट खींचो । 7 mΩ के पास एक टिप प्रतिरोध के साथ एक उपयुक्त पिपेट प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स के लिए मैनुअल से परामर्श करें ।
  2. एक पैच पिपेट में आंतरिक रिकॉर्डिंग समाधान के 4 µ एल जोड़ें । आंतरिक खारा १४० पोटेशियम aspartate, 10 HEPES, 4 MgATP, ०.५ ना3GTP, 1 EGTA, और मिमी में 1 KCl के होते हैं ।
  3. पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए पैच दबाना एम्पलीफायर सेट करें । शून्य एम्पलीफायर की ऑफसेट और परीक्षण दालों देने के लिए एम्पलीफायर सेट. यहां, एक AM सिस्टम पैच दबाना एम्पलीफायर २,४०० प्रयोग किया जाता है ।
  4. पिपेट के माध्यम से सकारात्मक दबाव लागू करें और सेल दृष्टिकोण । पिपेट को निर्देशित करने और कक्ष से संपर्क करने के लिए किसी micromanipulator का उपयोग करें । सकारात्मक दबाव जारी । -६० एमवी के लिए झिल्ली की होल्डिंग क्षमता निर्धारित करें । पिपेट कोशिका की झिल्ली के साथ एक gigaohm सील फार्म के रूप में एक कम उप picoamp वर्तमान होल्डिंग द्वारा सबूत चाहिए ।
    नोट: यदि GFP निर्देशित सेल लक्ष्यीकरण का उपयोग कर, ChR2 सक्रियण और संभावित synaptic अवसाद को रोकने के लिए epifluorescent प्रकाश के उपयोग को कम करने का प्रयास करें । भी चरण 5 लागू करने से पहले कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ।
  5. टेस्ट पल्स देने के लिए एम्पलीफायर सेट-५० एमवी से-६० एमवी. यह सेटिंग पैच-दबाना एम्पलीफायरों पर मानक है । टेस्ट दालों पैच पिपेट चार्ज करने के लिए आवश्यक वर्तमान का प्रतिनिधित्व करने वाले एक बड़े capacitative क्षण प्रकट होगा । AM २४०० या समान एम्पलीफायर पर क्षमता मुआवजा knobs का समायोजन करके capacitative यात्रियों को हटा दें.
  6. सेल झिल्ली टूटना और पूरे सेल विन्यास प्राप्त करने के लिए नकारात्मक दबाव के संक्षिप्त दालों लागू करें ।
    नोट: एक पूरे सेल विंयास देखा है जब वहां capacitative यात्रियों में एक बड़ी वृद्धि ंयूरॉन के समाई दिखा रहा है । होल्डिंग वर्तमान (आधारभूत) में एक छोटी सी वृद्धि की संभावना भी मनाया जाएगा । वर्तमान दबाना मोड के लिए एम्पलीफायर सेट और सेल की क्षमता को समायोजित करने के लिए-५० करने के लिए-६० एमवी.

5. टेस्ट Synaptic कनेक्टिविटी

  1. डेटा प्राप्ति (DAQ) सिस्टम एक एलईडी ड्राइवर प्रकाश पल्स जनरेट करने के लिए ट्रिगर करने के लिए कॉन्फ़िगर करें । यहाँ, एक राष्ट्रीय उपकरणों DAQ प्रणाली एक एलईडी ड्राइवर के लिए एक एनालॉग संकेत देने के लिए Matlab के साथ प्रयोग किया जाता है. एलईडी तीव्रता ड्राइवर के लिए एनालॉग सिग्नल के माध्यम से समायोजित किया जाता है । एलईडी एक 620-630 एनएम तरंग दैर्ध्य एलईडी है ।
  2. स्थिति उच्चस्तरीय लाल सीधे तैयारी के नीचे एलईडी । प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करें ताकि ०.२३८ मेगावाट/mm2 मक्खी तक पहुंच जाए ।
  3. presynaptic न्यूरॉन्स सक्रिय है, जबकि ब्याज की postsynaptic सेल से रिकॉर्डिंग. प्राप्त सेल सक्रियकरण optogenetically, pharmacogentically, या तंत्रिका उत्तेजना के माध्यम से । यहाँ, लाल बत्ती की csChrimson और संक्षिप्त दालें लागू होती हैं.
    नोट: Synaptic कनेक्शन EPSCs के रूप में EPSPs या वोल्टेज दबाना के रूप में वर्तमान दबाना में या तो निगरानी की जा सकती है । एक synaptic कनेक्शन एक ४० एमएस प्रकाश पल्स के जवाब में TTX लागू करने से पहले दिखाई जानी चाहिए । यदि कोई संबंध नहीं देखा है, यह संभावना नहीं है कि ंयूरॉंस synaptically या तो मोनो या polysynaptically जुड़े रहे हैं । होल्डिंग संभावित उत्तेजक या निरोधात्मक कनेक्शन तदनुसार पर जोर समायोजित किया जा सकता है ।
  4. एक कनेक्शन सामान्य खारा में मनाया जाता है, तो 1 µ एम के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए छिड़काव प्रणाली के लिए TTX जोड़ें. कब्जा करने के लिए और खारा TTX के संरक्षण के लिए पुन: उपयोग करने के लिए एक परिसंचारी पंप का उपयोग करें । सिकुड़नेवाला पंप से खारा समाधान निकालकर नहाने से उसे खारा जलाशय में वापस लौटना होगा ।
  5. पंप की गति को समायोजित करने के लिए एक मजबूत निरंतर वैक्यूम है कि स्नान में खारा स्तर वृद्धि और गिरने के लिए अनुमति नहीं देता है प्रदान करने के लिए ।
    नोट: TTX के आवेदन न्यूरॉन में spiking गतिविधि की समाप्ति में परिणाम चाहिए कि पूरे सेल में नजर रखी जा रही है. इससे इसकी पुष्टि होती है कि काफी TTX को खारा में जोड़ा गया है ।
  6. (प्रत्येक पल्स के लिए ४० ms) फिर से लाल बत्ती के संक्षिप्त दालों लागू करें । इस बिंदु पर, किसी भी synaptic कनेक्शन है कि संभावना monosynaptic है । synaptic कनेक्शन है कि TTX में रहने की रासायनिक प्रकृति का परीक्षण करने के लिए पुनर्संचारी खारा करने के लिए औषधीय विरोधी जोड़ें ।
    नोट: optogenetics और न्यूरॉन्स के लक्ष्यीकरण फ्लोरोसेंट जब संयोजन, यह लगातार एक रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की कोशिश करते हुए न्यूरॉन्स की presynaptic आबादी को सक्रिय करने के लिए नहीं महत्वपूर्ण हो सकता है. इससे synaptic डिप्रेशन का कारण बन सकता है और कनेक्शन देखना मुश्किल हो जाता है । क्योंकि csChrimson एक लंबी उत्तेजना बैंड है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सीमा में मोटे तौर पर फैली हुई है, एक लाल fluorophore ंयूरॉंस और channel2rhodopsin (Ch2R) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता सेल आबादी उत्तेजित किया जा सकता है । ऐसा करने के लिए विशिष्ट आनुवंशिकी और एक कस्टम फ़िल्टर घन की आवश्यकता है । उपयुक्त मक्खियों उत्पन्न करने के लिए, मक्खियों कि लाल fluorophore (आरएफपी या mCherry) LexA या क्यू सिस्टम बाइनरी एक्सप्रेशन सिस्टम के अंतर्गत व्यक्त करते हैं । ये एक Gal4 प्रमोटर और यूएएस-Ch2R और यूएएस-NaChBac प्रभाव जीन व्यक्त मक्खियों के साथ पार करने की आवश्यकता होगी । epifluorescence के लिए इष्टतम फिल्टर घन लाल fluorophore उत्तेजित करने के लिए एक संकीर्ण उत्तेजना रेंज होगा, लेकिन Ch2R उत्तेजित नहीं है । साथ ही, फ़िल्टर सेट एक लंबे पास उत्सर्जन के रूप में ज्यादा उत्सर्जित प्रकाश इकट्ठा करने के लिए फ़िल्टर शामिल करना चाहिए । हमने क्रोमा से एक कस्टम फ़िल्टर सेट किया था जिसमें भाग संख्या et580/25x और t600lpxr (४९३०६ सेट से) शामिल थी, लेकिन एक et610lp बैरियर/

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Representative Results

TERPS न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्शन में मोनो और polysynaptic योगदान के बीच भेद करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जबकि एक कोशिका की कमजोर उत्तेजना के लिए सीधे कनेक्शन का परीक्षण किया जा सकता है, अधिक से अधिक presynaptic गतिविधि ड्राइविंग अक्सर polysynaptic कनेक्शन (चित्र 1a) रंगरूटों. TERPS-TTX असंवेदनशील सोडियम चैनल NaChBac और एक optogenetic उत्प्रेरक, और TTX की उपस्थिति में परीक्षण कनेक्शन polysynaptic कनेक्शन (आंकड़ा 1b) को खत्म करने के लिए सह-व्यक्त द्वारा काम करता है । TTX प्रभावी रूप से Drosophila मस्तिष्क में कार्रवाई की क्षमता को रोकता है, यह TERPS (चित्रा 2a) के लिए एक उपयुक्त तैयारी कर रही है । NaChBac सोडियम चैनल की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति एक बड़े पठार की क्षमता में न्यूरॉन्स और परिणामों में उत्तेजितता को बचाता है (चित्र b) ।

antennal पालि में स्थानीय न्यूरॉन्स (LN) घ्राण उत्तेजना (चित्र 3ए) के लिए मजबूत प्रतिक्रिया दिखाएँ । हालांकि, क्योंकि व्यक्तिगत EPSPs आसानी से LN सोमा पर हल नहीं कर रहे हैं, यह स्पष्ट नहीं रहता है अगर ऐसी प्रतिक्रियाओं घ्राण रिसेप्टर ंयूरॉन इनपुट (ORN) या अप्रत्यक्ष रूप से प्रक्षेपण ंयूरॉंस (PN) (चित्र बी) के माध्यम से सीधे इनपुट से उत्पंन । TERPS का उपयोग करके, ORNs यहाँ दिखाया गया है, वास्तव में LNs के साथ प्रत्यक्ष synaptic कनेक्शन बनाने (चित्रा 3सी).

TERPS की एक अनूठी विशेषता विशेष रूप से अतिरिक्त synaptic मात्रा संचरण है कि या तो गाबा या neuromodulators जैसे सेरोटोनिन के साथ हो सकता है को हल करने की क्षमता है । एक serotonergic ंयूरॉन की उत्तेजना (CSDn) में Drosophila antennal पालि परिणाम में उत्तेजना और निषेध एक स्थानीय ंयूरॉन में (चित्रा 4a और चित्रा 4B) । उत्तेजना उत्तेजक ट्रांसमीटर acetylcholine द्वारा ध्यान है और निषेध सेरोटोनिन (चित्र 4c और चित्रा 4d) के कारण होता है । TERPS कनेक्शन polysynaptic कनेक्शंस (आरेख 4E) को नष्ट करके monosynaptic हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । TTX में, एक मजबूत अवरोध अभी भी LN में मनाया जाता है, सुझाव है कि यह एक विशिष्ट serotonergic ंयूरॉन (चित्रा 4F और चित्रा 4g) के सक्रियण से सीधे से आता है । यह कनेक्शन सेरोटोनिन विरोधी methysergide द्वारा ब्लॉक किया गया है । acetylcholine द्वारा मध्यस्थता synapse उत्तेजक TTX में समाप्त किया गया था, यह सुझाव polysynaptic स्रोतों से उठी.

Figure 1
चित्र 1 : TERPS polysynaptic कनेक्शन को समाप्त करता है और monosynaptic आदानों को अलग करता है । (a). एक योजनाबद्ध चित्र दिखा रहा है कि बढ़ती presynaptic गतिविधि polysynaptic कनेक्शन भर्ती कर सकते हैं । (B) । एक आरेख कैसे TERPS न्यूरॉन्स में spiking गतिविधि को खत्म करने के लिए TTX का उपयोग करके polysynaptic योगदान को दूर कर सकते हैं. उत्तेजितता विशेष रूप से न्यूरॉन्स की एक आबादी है कि फिर optogenetically उत्साहित किया जा सकता है में बहाल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : NaChBac में न्यूरॉन ्स की उत्तेजितता को पुनर्स्थापित करता है Drosophila न्यूरॉन्स । (क) 1 µm TTX का आवेदन Drosophila न्यूरॉन्स में spiking समाप्त हो जाता है. दोनों सहज गतिविधि और गंध-पैदा निषेध TTX में सफाया कर रहे हैं । (ख) NaChBac और csChrimson CSDn में व्यक्त किए जाते हैं और मस्तिष्क TTX के संपर्क में आ जाता है. csChrimson उत्तेजना CSDn और एक सीमा पार कर रहा है के बाद, वहां बड़े गैर रैखिक CSDn झिल्ली वोल्टेज में वृद्धि हुई है । यह तेजी से ध्रुवीकरण एक पठार की तरह क्षमता (इनसेट) का गठन । अनुकरण में प्रत्येक रंग तीव्रता वोल्टेज इनसेट में एक ही रंग के अनुरूप है । यह आंकड़ा झांग और Gaudry २०१६9से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : TERPS ORNs और LNs के बीच monosynaptic कनेक्शन का पता चलता है । (a) एक नमूना एक गंध प्रतिक्रिया में एक LN दिखा रिकॉर्डिंग । यह प्रतिक्रिया मोनो हो सकता है-या प्रकृति में polysynaptic. (B) TERPS को ORN पर LN synapse पर परीक्षण किया जा सकता है । TTX तैयारी में सभी कोशिकाओं में कार्रवाई की क्षमता और उत्तेजितता को ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है । उत्तेजितता विशेष रूप से NaChBac सोडियम चैनल के माध्यम से ORNs में बहाल है । ORNs तो channelrhodopsin के साथ उत्साहित करने के लिए synaptic जारी कर सकते हैं । Synaptic घटनाओं के बाद पूरे सेल रिकॉर्डिंग का उपयोग कर synaptically मापा जाता है । (ग) TERPS से पता चलता है कि LN synapse को ORN monosynaptic है । TERPS भी synapse कोलीनर्जिक और कोर्टेक्स रिसेप्टर प्रतिपक्षी mecamylamine (२०० µ मीटर) द्वारा अवरुद्ध है कि दिखाने के लिए औषध विज्ञान के साथ जोड़ा जा सकता है. अनुलंब धूसर पट्टी ORN उत्तेजना के समय को इंगित करती है । २०१६9में झांग और Gaudry से यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : TERPS थोक या modulatory न्यूरॉन्स से वॉल्यूम ट्रांसमिशन रिलीज के प्रति संवेदनशील है । (क) एक कार्रवाई की क्षमता में CSDn परिणाम की उत्तेजना Drosophila antennal पालि में एक दर्ज की गई LN से । (ख) LN hyperpolarized है ताकि CSDn उत्तेजना एक उपसीमा गतिविधि में परिणाम है । LN प्रतिक्रिया एक धीमी hyperpolarization द्वारा पीछा एक तेजी से ध्रुवीकरण के होते हैं । ग्रे बार CSDn उत्तेजना के समय का अर्थ है । Methysergide (५० µ मीटर), एक व्यापक 5-एचटी रिसेप्टर प्रतिपक्षी, धीमी गति से hyperpolarization ब्लॉक लेकिन ध्रुवीकरण पर कोई प्रभाव नहीं है. Mecamylamine ब्लॉकों में तेजी से ध्रुवीकरण का सुझाव है कि यह प्रकृति में कोलीनर्जिक है. (C) TERPS को हल करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जो LN synapse को CSDn के रासायनिक अवयव मोनो-बनाम polysynaptic हैं । (D) CSDn TTX और postsynaptic की उपस्थिति में उत्तेजित है LN प्रतिक्रियाओं पूरे सेल रिकॉर्डिंग में मापा जाता है । hyperpolarization TTX में बनी हुई है यह सुझाव प्रकृति में monosynaptic है । यह hyperpolarization भी methysergide द्वारा अवरुद्ध है, serotonergic संचरण के साथ संगत । संक्षिप्त ध्रुवीकरण कि TTX में रहता है की संभावना बिजली के अंतर युग्मन द्वारा मध्यस्थता है, के रूप में यह कोर्टेक्स विरोधी द्वारा अवरुद्ध नहीं है । २०१६9में झांग और Gaudry से यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फ़ाइल 1: Drosophila पंनी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: फिजियोलॉजी चैंबर । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

TERPS विश्लेषण तारीफ वर्तमान तकनीक की पहचान न्यूरॉन्स के बीच synapses का पता लगाने को सक्षम करने के द्वारा खुर सर्किट के लिए इस्तेमाल किया. विशेष रूप से, दृष्टिकोण TTX-असंवेदनशील सोडियम चैनल NaChBac के साथ न्यूरॉन्स की एक चयन जनसंख्या में उत्तेजितता बहाल करते हुए TTX के साथ मोटे तौर पर मुंह बंद करने कार्रवाई संभावितों द्वारा monosynaptic कनेक्शन से पता चलता है. Synaptic रिलीज optogenetic उत्तेजना से भरा हुआ है, जबकि postsynaptic घटनाओं पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ नजर रखी है । TERPS ऐसे समझ के रूप में अंय दृष्टिकोण से खुद को अलग थोक या मात्रा संचरण के प्रति संवेदनशील जा रहा है अब दूरी और औषधीय जोड़तोड़ प्रदर्शन करने की क्षमता पर । तकनीक अपेक्षाकृत काम करने के लिए सरल है और केवल एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और optogenetic उत्तेजना है, जो दोनों पूर्व और बाद synapse के synaptic भागों पर दोहरी पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने से अधिक संभव है के लिए एक प्रकाश स्रोत की आवश्यकता है । TERPS की एक बुनियादी आवश्यकता है कि कार्रवाई की क्षमता आसानी से प्रणाली में TTX द्वारा अवरुद्ध कर रहे है अध्ययन किया जा रहा है । लेकिन, क्योंकि TTX वर्गीकरण संघ की एक विस्तृत श्रृंखला में न्यूरॉन्स पर कार्य करता है, यह TERPS मोटे तौर पर दोनों स्तनधारी और invertebrate मॉडल सिस्टम के लिए लागू किया जा सकता है कि संभावना है.

TERPS आसानी से ख्यात presynaptic जनसंख्या की उत्तेजना या postsynaptic लक्ष्य से रिकॉर्डिंग के लिए सुविधा के लिए शिष्टाचार की एक संख्या में संशोधित किया जा सकता है । यहां, एक optogenetic उपकरण के लिए लक्ष्य आबादी को उत्तेजित किया गया था, हालांकि तंत्र की एक किस्म से सक्रियण संभव है । संवेदी axons की तंत्रिका उत्तेजना, उदाहरण के लिए, Drosophila16 में antennal तंत्रिका से संचरण के अध्ययन में नियमित है और परिधीय mechanosensory ंयूरॉंस युक्त नसों सहित अंय संवेदी प्रणालियों, में उपयुक्त है । Drosophila में कार्यात्मक कनेक्टिविटी परीक्षण के लिए एक समान दृष्टिकोण न्यूरॉन्स की एक आबादी में GCaMP कैल्शियम संकेतक व्यक्त करते हुए ionotropic purinoceptor P2X2 और एटीपी आवेदन2के माध्यम से एक और आबादी में गतिविधि ड्राइविंग. यह दृष्टिकोण बस सह द्वारा TERPS के साथ संगत होना चाहिए एक में P2X2 रिसेप्टर के साथ NaChBac transgene व्यक्त ंयूरॉन और एक और आबादी में एक पूरी तरह से पैच मुक्त विधि के लिए GCaMP. हालांकि, सावधानी ऐसे मस्करीनिक आधारित डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से एक डिजाइनर दवा (DREADDs)17,18द्वारा सक्रिय के रूप में धीमी ध्रुवीकरण के कारण दृष्टिकोण के साथ लिया जाना चाहिए । धीमे ध्रुवीकरण से कार्रवाई संभावित पीढ़ी से पहले NaChBac निष्क्रियता पैदा हो सकती है ।

TERPS करने के लिए इसी तरह के तरीके स्तनधारी प्रणालियों में नियोजित किया गया है । इस तरह की तकनीक TTX और channelrhodopsin को न्यूरॉन्स के बीच कनेक्टिविटी मैप करने के लिए संयोजित करता है । Channelrhodopsin सक्रियण अकेले ंयूरॉंस पर्याप्त रूप से ध्रुवीकरण नहीं है, और इस प्रकार पोटेशियम चैनल अवरोधक 4-एपी TTX के साथ लागू करने के लिए जारी19,20,21। हालांकि यह कई synapses में काम करता है, यह कुछ metabotropic synapses पर काम नहीं कर सकता है अगर रिसेप्टर के बहाव लक्ष्य एक 4-एपी संवेदनशील पोटेशियम चैनल है. उदाहरण के लिए, पतंगों में घ्राण प्रतिक्रिया के serotonergic मॉडुलन इस तरह के एक 4 एपी संवेदनशील K+ वर्तमान (मैंएक)22के मॉडुलन पर सीधे निर्भर करता है. इस दृष्टिकोण भी CSDn पर LN synapse के लिए काम नहीं किया (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस प्रकार, TERPS अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में कम औषधीय हस्तक्षेप की आवश्यकता का लाभ है और व्यापक रेंज या synapses पर काम कर सकते हैं ।

TERPS करने के लिए कुछ सीमाएं हैं, जिन पर विचार किया जाना चाहिए । सबसे पहले, वहां विकास के दौरान NaChBac चैनल की पुरानी अभिव्यक्ति से संभावित दुष्प्रभाव हो सकता है । उचित सर्किट विधानसभा और समारोह नियंत्रण मक्खियों की कमी NaChBac निर्माण और TTX के अभाव में निर्माण के साथ मक्खियों के बीच ंयूरॉंस की गतिविधि की तुलना द्वारा की पुष्टि की जा सकती है । किसी भी ऐसी समस्याओं से बचने के लिए, NaChBac transgene की अभिव्यक्ति को तापमान के प्रति संवेदनशील GAL4 दमन, GAL8023की अभिव्यक्ति के माध्यम से अस्थाई रूप से नियंत्रित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, यदि एक synapse केवल एक राज्य पर निर्भर तरीके से मनाया जाता है, यह है कि TTX के साथ नेटवर्क गतिविधि को दबा इस तरह के एक कनेक्शन छुपा सकता है कल्पनात्मक है । यह एक सकारात्मक कनेक्शन की संभावना एक सच मोनो-synaptic कनेक्शन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि एक नकारात्मक परिणाम एक कनेक्शन के अभाव का सबूत नहीं है, जबकि TERPS के साथ मनाया कि जोर देने के लिए महत्वपूर्ण है.

जबकि TERPS एक न्यूरॉन से ट्रांसमीटर रिहाई की क्षमता प्रकट कर सकते हैं postsynaptic साथी को प्रभावित करने के लिए स्पष्ट रूप से, NaChBac की धीमी गति से चैनल की गतिशीलता और अपने सक्रियण के साथ जुड़े पठार क्षमता यह शास्त्रीय के अध्ययन के लिए कम लागू प्रदान neurotransmission । तेजी से, अधिक प्राकृतिक ट्रांसमीटर रिहाई के लिए TERPS फेरबदल करने के लिए एक दृष्टिकोण को NaChBac के विरोध के रूप में अंतर्जात Drosophila सोडियम चैनल पैरा के एक संशोधित TTX असंवेदनशील संस्करण व्यक्त किया जाएगा । इस परिवर्तन presynaptic सेल में प्राकृतिक spiking गतिविधि में परिणाम और नेटवर्क गतिविधि के अभाव में synaptic संचरण के अधिक परंपरागत विश्लेषण की अनुमति होगी । इस दर के अध्ययन के लिए महान क्षमता-कोडिंग synapses, पर जो polysynaptic नेटवर्क की भर्ती के बिना presynaptic गतिविधि की एक व्यापक रेंज में लाना वांछनीय होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम यहोशू गायक, जोनाथन Schenk, साथ ही पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए विचारशील समीक्षक शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी बेन व्हाइट और हेरोल्ड Zakon तकनीक पर विचार विमर्श के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । जोनाथन Schenk चित्रा 3ए के लिए डेटा प्रदान की है । यह काम एक व्हाइटहॉल फाउंडेशन ग्रांट और QG के लिए एक NIH R21 द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-csChrimson Bloomington Drosophila Stock Center 55135 Used as a neural activator
UAS-NaChBac Bloomington Drosophila Stock Center 9466 Resotores excitibility in cells in TTX
Tetrodotoxin Tochris 1078 Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance
all trans-Retinal Sigma-Aldrichall trans-Retinal R2500 Require co-factor for channelrhodopsin
Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide McMaster Carr 3254K7 Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000-C Used for dissection of preparation
Waxer Almore Eectra Waxer 66000 Used during dissection to secure fly in foil
Paraffin Wax Joann 4917217 Used with waxer
Number 5 forceps Fine Science Tools #5CO Used for dissection and desheathing
Dissection Scissors Fine Science Tools 15001-08 Used to remove parts of the cuticle during dissection
Tungsten wire A-M Systems 797500 Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection
Reciculating Peristaltic Pump Simply Pumps (Amazon) PM200S for recirculating TTX
Speed Controller for peristaltic pump Zitrades (Amazon) N/A PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B
Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator McMaster Carr 1804T1 For applying positive pressure during patching
Glass capilaries World Precision Instruments TW150F-3 For patch pipettes
Multipurpose Gauge McMaster Carr 3846K431 Gauge for pressure regulator
Electrophysiology Camera Dage MTI  IR-1000 Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson
IR LED Thorlabs  M850F2 For oblique illumination
fiber optic for IR LED Thorlabs M89L01 Couples to IR LED
Objective lens  Olympus 40X LUMPlanFLN This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.
Amber LED Thorlabs M590L3d For visualizing RFP and mCherry
Blue LED Thorlabs M470L3d For visualizing GFP
GFP filter set Chroma 49011 For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin
Custom mCherry Filter Set Chroma  et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin
Dichroic to combine Amber and blue LED Thorlabs DMLP550R Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.
Red LED LEDSupply Cree XPE 620 - 630 nm Used to drive csChrimson
LED Driver LEDSupply 3021-D-E-1000 Used to drive LEDs for optogenetic stimulation
Manipulator Sutter Instruments MP-225 Used to position pipette during recordings
Patchclamp Amplifier A-M Systems Model 2400 An equivalent amplifier is suitable
Bessel Filter Warner Instruments  LPF 202A Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.
Data Acquisition System  National Instruments NI PCIe-6321       781044-01 Used to record data from amplifier to computer
Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A National Instruments 779556-01 Used to connect amplifier to DAQ card.
Steel Foil  McMaster Carr 3254K7 Steel foil for custom recording chamber
Magnets K&J Magnetics D42 To secure recording chamber to ring stand
1/16" Cell Cast Acrylic Clear Pololu Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३२ Drosophila tetrodotoxin monosynaptic कनेक्टिविटी NaChBac सर्किट connectomics
Tetrodotoxin प्रतिरोधी सोडियम चैनलों का उपयोग <em>Drosophila</em> में Monosynaptic कनेक्शन की जांच
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Zhang, X., Gaudry, Q. Examining… More

Zhang, X., Gaudry, Q. Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels. J. Vis. Exp. (132), e57052, doi:10.3791/57052 (2018).

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