Summary
Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.
Abstract
Qui, una nuova tecnica chiamata Tetrotoxin (TTX) Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS) viene applicata per verificare monosinaptica connessioni tra i neuroni bersaglio. Il metodo si basa sulla co-espressione di un attivatore transgenico con il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac, in un neurone presinaptico specifico. Connessioni con presunto partner post-sinaptico sono determinate dalle cellule intere registrazioni in presenza di TTX, che blocca l'attività elettrica nei neuroni che non esprimono NaChBac. Questo approccio può essere modificato per funzionare con qualsiasi attivatore o l'imaging del calcio come un reporter di connessioni. TERPS aggiunge il set crescente di strumenti disponibili per determinare la connettività all'interno di reti. Tuttavia, TERPS è unico in quanto segnala anche attendibilmente massa o volume trasmissione e trasmissione di spillover.
Introduction
Degli obiettivi principali delle neuroscienze è quello di mappare le connessioni tra i neuroni a comprendere il fluiscono di informazioni attraverso circuiti. Numerosi approcci e risorse sono diventati disponibili per testare la connettività funzionale tra neuroni in una gamma di sistemi modello1,2. Per generare gli schemi di collegamento più precisi utilizzando elettrofisiologia, è importante risolvere se osservate connessioni tra due cellule sono diretti e monosinaptica versus indiretto e polisinaptici. Un gold standard per fare questa distinzione nei neuroni dei mammiferi è di misurare la latenza tra singolo action potentials nelle cellule presinaptiche e l'insorgenza di correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) nel secondo neurone. Monosinaptica connessioni dovrebbero avere brevi latenze di pochi millisecondi e bassa variabilità3. Questo approccio può essere complicato in neuroni invertebrati poiché sinapsi possono verificarsi nel loro dendriti lontano dal sito di registrazione somatico, causando ritardi nel rilevamento a causa di distanze lungo elettrotoniche tra conduttanze postsinaptiche e la registrazione elettrodo. Tali ritardi possono introdurre ambiguità riguardo poli-versus monosinaptici contributi. Inoltre, piccoli eventi sinaptici può decadere prima di raggiungere il sito di registrazioni somatiche e guidano l'attività presinaptica più forte, è probabili reclutare polisinaptici eventi.
Varie tecniche sono state sviluppate per verificare le connessioni monosinaptica negli invertebrati. Un approccio utilizza soluzioni alta catione bivalente (Hi-Di) che contengono in eccesso Mg ++ e Ca+ +. Questa soluzione blocca le connessioni polisinaptici di riduzione probabilità di rilascio e crescente potenziale di azione soglia per favorire il rilevamento di monosinaptica ingresso4,5. Determinare il rapporto preciso di Mg Ca ++ ++ necessaria, tuttavia, non è banale e polisinaptici contributi possono persistere per stimolazione anche modesto6. Un approccio alternativo chiamato GFP ricostituzione attraverso partner sinaptica (stretta) sfrutta la vicinanza tra membrane pre- e postsinaptiche trovato alle sinapsi di dedurre una connessione monosinaptica 7. Qui, un componente della proteina fluorescente verde (GFP) è espresso in un neurone, e il frammento complementare della molecola è espressa in un presunto partner postsinaptico. La presenza di fluorescenza indica che i due neuroni sono nelle vicinanze per consentire la ricostituzione della molecola GFP e implica l'esistenza di una sinapsi. STRETTA può segnalare sinapsi falsamente, però, se due cellule strettamente hanno apposto membrane, come in un nervo o fascicolo. Varianti di impugnare eliminano tali falsi positivi tramite il tethering il frammento presinaptico della GFP direttamente alla sinaptobrevina, permettendo così la ricostituzione solo alle sinapsi attivo8. Mentre stretta e le sue varianti sono stati strumentali nel determinare la connettività funzionale in Drosophila CNS, alcuni collegamenti potrebbero non essere reso visibili da afferrare se le distanze tra i partner di pre- e postsinaptici è relativamente grande. Questo è particolarmente pertinente nella valutazione della trasmissione volume associato neuromodulation9 o di inibizione GABAergica10.
Qui, una tecnica complementare e romanzo è dimostrata per test connessioni dirette monosinaptica in Drosophila CNS. Questo metodo, chiamato tetrodotossina Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS), opera di co-espressione di tetrodotossina (TTX)-canale del sodio resistente, NaChBac e un attivatore di optogenetica in una cellula presinaptica durante la registrazione da presunti postsinaptica partner9. In presenza di TTX, tutte le attività di potenziale di azione-mediata è soppressa in cellule diverse da quelle che esprimono NaChBac. Il canale di NaChBac Ripristina selettivamente eccitabilità nelle celle presinaptiche mirate, permettendo la trasmissione sinaptica luce-evocati. Questo metodo consente la forte attivazione dei neuroni presinaptici, tale che le connessioni possono essere risolti postsynaptically registrando somatico, riducendo la probabilità di reclutamento circuiti polisinaptici. D'importanza, questa tecnica permette lo studio della trasmissione di volume e rivela la diffusione del trasmettitore liberato da un singolo neurone in tutto un circuito. Inoltre, TERPS può rivelare la natura chimica della connessione attraverso farmacologia convenzionale. TERPS è adatto ad uso in qualsiasi sistema di modello che permette l'espressione transgenica dei canali del sodio TTX-insensibile.
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Protocol
1. preparare mosche e identificare GAL4 promotore linee
- Selezionare una linea di promotore GAL4 e attraversarlo con mosche che trasportano il transgene UAS-NaChBac sia un transgene optogenetica per l'attivazione.
Nota: UAS-CsChrimson11 è selezionata a causa della sua alta conduttanza e la facilità con cui si attiva NaChBac-mediata dei potenziali di azione. UAS-NaChBac sia UAS-CsChrimson sono disponibili dal Repository di scorte di Bloomington. - Preparare tutto-trans retinico come una soluzione in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a-20 ° C.
- µ L di mix 28 di questo stock in circa 5 mL di patata reidratata fiocco cibo e aggiungere questa miscela alla parte superiore di una fiala di convenzionale media della drosofila .
- Sollevare le mosche adulte esprimendo csChrimson sul cibo contenente 0,2 mM all-trans-retinale per 1 – 3 giorni11.
2. preparare il brodo di TTX
- Creare una soluzione di riserva di 1mm TTX in acqua distillata o deionizzata. Conservare questa soluzione in un frigorifero di laboratorio per diversi mesi. Controllare le politiche di istituzioni per quanto riguarda lo stoccaggio di TTX come molte istituzioni classificano TTX come una sostanza pericolosa o controllata.
3. preparare mosche per elettrofisiologia
- Raccogliere 1 – 3 giorni adulto anziano mosche che vengono generati sul cibo con all-trans-retinale.
Nota: Consultare Murthy e Turner nel 2013 per una descrizione dettagliata della patch di bloccaggio della drosofila neuroni12,13. - Mettere le mosche in una fialetta di scintillazione. Posizionare la fiala sul ghiaccio per 1 min immobilizzare le mosche.
- Utilizzare pinze grossolane per inserire una Mosca in una camera di registrazione su misura. La camera è costituito da un 3 ½" cerchio taglio laser da 1/16" acrilico. Taglio un foro ¾" è il centro cui è collegato un foglio personalizzato con epossidica a 2 componenti. La pellicola contiene un triangolare a forma di speranza che viene inserito al volo.
- Applicare cera o resina epossidica curabile UV intorno all'animale di fissare saldamente all'interno della camera di registrazione.
- Illuminare la preparazione con una fibra ottica a collo di cigno per la visualizzazione sotto un microscopio stereoscopico. Impostare le fibre a collo di cigno per illuminazione obliqua regolandoli in modo che essi illuminano al volo direttamente dal lato.
- Regolare il livello di luce al più basso possibile che ancora permette la chiara visualizzazione della Mosca. Questa intensità luminosa varierà da singoli esperimenti.
Nota bene: Questo protocollo può essere adattato utilizzando un in situ cervello explant metodo14. - Recuperare la registrazione esterna salino. La soluzione salina contiene in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (idrossimetil) metil-2-aminoethane-solfonici, 8 trealosio, glucosio 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2e 4 MgCl2 (regolata a mΩ 270 – 275). La soluzione salina viene fatto gorgogliare con 95% O25% CO2 (carbogen) e ha un pH regolato a 7,315.
- Posto 4-6 gocce di soluzione fisiologica registrazione extracellulare sopra la preparazione vola. A questo punto, aumentare il livello di luce al microscopio di dissezione per una migliore visibilità.
- Affilare un filo di tungsteno mediante elettrolisi. Per rendere il filo, preparare una soluzione satura di KNO3 e applicare circa 20 V di AC corrente mentre la punta del filo nella soluzione 20 volte per 100 ms ogni di immersione fino a quando la punta è nitida. Utilizzare il filo di tungsteno affilata per rimuovere la cuticola sulla testa al volo ed esponendo così il cervello.
- Inoltre espone il cervello rimuovendo la trachea e corpi grassi che lo circondano. Se l'accesso ai lobi antennali, utilizzare un filo di tungsteno piegato o un attrezzo simile per infilare delicatamente antenne sotto il foglio di registrazione camera per aumentare la visibilità. Utilizzare pinze taglienti per strappare delicatamente la guaina glial che copre l'area di interesse in cui verranno effettuate registrazioni.
- Trasferire la camera di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Immediatamente inizio perfusione con soluzione fisiologica registrazione esterna gorgogliare con carbogen per preservare il cervello. Il serbatoio di soluzione salina è posizionato sopra il tavolino del microscopio e gravità-è alimentato alla preparazione. Utilizzare una linea del vuoto e un matraccio di Erlenmeyer 2L per raccogliere le saline dei rifiuti.
4. ottenere cellule intere registrazione
- Tirare pipette patch un estrattore commerciale pipetta. Consultare il manuale per le impostazioni ottenere un'appropriato pipetta con una resistenza di punta vicino a 7 mΩ.
- Aggiungere 4 µ l di soluzione di registrazione interna in una pipetta patch. La soluzione salina interna è costituito da 140 potassio aspartato, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl in mM.
- Impostare il patch clamp amplificatore per registrazione di cellule intere. Zero offset dell'amplificatore e impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova. Qui, viene utilizzato un amplificatore del morsetto di Patch dei sistemi AM 2.400.
- Applicare pressione positiva attraverso la pipetta e avvicinarsi alla cella. Utilizzare un micromanipolatore per indirizzare la pipetta e contattare la cella. Rilascio di pressione positiva. Insieme il potenziale della holding della membrana a -60 mV. La pipetta deve formare un sigillo gigaohm con membrana delle cellule come evidenziato da un sub-picoamp bassa corrente di tenuta.
Nota: Se usando GFP guidato delle cellule il targeting, tenta di ridurre al minimo utilizzo della luce epifluorescente per impedire l'attivazione ChR2 e potenziale depressione sinaptica. Attendere alcuni minuti prima di applicare il passaggio 5. - Impostare l'amplificatore per fornire impulsi di prova da -50 mV a -60 mV. Questa impostazione è standard su amplificatori di patch-clamp. Impulsi di prova rivelerà un grande transitorio capacitivo che rappresenta la corrente necessaria per ricaricare la pipetta di patch. Rimuovere capacitivi transitori regolando le manopole di compensazione di capacità su AM 2400 o simili amplificatore.
- Applicare brevi impulsi di pressione negativa a rottura della membrana cellulare e ottenere la configurazione di cellule intere.
Nota: Una configurazione di cellule intere è osservata quando c'è un grande aumento nei transienti capacitivi che mostra la capacità del neurone. Un piccolo aumento della corrente di mantenimento (baseline) sarà probabilmente anche osservato. Impostare l'amplificatore corrente morsetto modalità e regolare il potenziale della cella a -50 a -60 mV.
5. Verifica della connettività sinaptica
- Configurare il sistema di acquisizione dati per attivare un driver LED per generare impulsi di luce. Qui, un sistema DAQ di National Instruments è usato con Matlab per fornire un segnale analogico a un driver LED. L'intensità del LED è regolato tramite il segnale analogico per il driver. Il LED è una lunghezza d'onda di 620-630 nm LED.
- Posizionare il LED rosso ad alta potenza direttamente sotto la preparazione. Regolare l'intensità della luce in modo che 0,238 mW/mm2 raggiunge al volo.
- Attivare i neuroni presinaptici durante la registrazione dalla cellula postsinaptica di interesse. Raggiungere la cella attivazione optogenetically, pharmacogentically, o tramite la stimolazione del nervo. Qui, vengono applicati csChrimson e brevi impulsi di luce rossa.
Nota: Connessioni sinaptiche possono essere monitorate sia in tensione oppure morsetto corrente come EPSPs come EPSC. Una connessione sinaptica dovrebbe essere visibile prima di applicare TTX in risposta ad un impulso di luce di 40 ms. Se nessuna connessione è osservata, è improbabile che i neuroni sono sinapticamente connessi sia mono - o polysynaptically. L'azienda potenziale può essere regolata per sottolineare le connessioni eccitatori o inibitori di conseguenza. - Se una connessione è osservata in salino normale, aggiungere TTX per il sistema di perfusione per ottenere una concentrazione finale di 1 µM. utilizzare una pompa di ricircolo per acquisire e riutilizzare la soluzione fisiologica per conservare TTX. La pompa peristaltica sarà disegnare la soluzione salina dalla vasca e restituirlo al serbatoio salino.
- Regolare la velocità della pompa per fornire un forte vuoto costante che non consente tale livello salino nel bagno a salire e scendere.
Nota: L'applicazione di TTX dovrebbe comportare la cessazione di chiodare l'attività nel neurone che viene monitorato in cellule intere. Questo conferma che abbastanza TTX è stato aggiunto per la soluzione fisiologica. - Applicare di nuovo brevi impulsi di luce rossa (40 ms per ogni impulso). A questo punto, qualsiasi connessione sinaptica che rimane è probabile monosinaptica. Aggiungere farmacologici antagonisti per le saline a ricircolo per testare la natura chimica delle connessioni sinaptiche che rimangono in TTX.
Nota: Quando si combinano optogenetica e targeting fluorescente dei neuroni, può essere importante non attivare con insistenza la popolazione presinaptica dei neuroni durante il tentativo di ottenere una registrazione. Questo può portare alla depressione sinaptica e rende difficile vedere le connessioni. Perché csChrimson ha una banda di eccitazione lunga che si estende in linea di massima nella gamma della proteina fluorescente verde, un fluoroforo rosso può essere utilizzato per visualizzare i neuroni e channel2rhodopsin (Ch2R) possono essere usati per eccitare le popolazioni delle cellule. Questa operazione richiede specifica genetica e un cubo di filtro personalizzato. Per generare mosche adatti, è possibile rendere mosche che esprimono il fluoroforo rosso (RFP o mCherry) nell'ambito dei sistemi di espressione binaria sistema LexA o Q. Questi dovranno essere incrociate con le mosche che esprimono un promotore Gal4 e geni effettori UAS-Ch2R e UAS-NaChBac. Il cubo di filtro ottimale per epifluorescenza avrà una gamma stretta di eccitazione per eccitare il fluoroforo rosso, ma non eccitare Ch2R. Inoltre, il set di filtri deve includere un filtro di emissione di passaggio lungo per raccogliere più luce emessa. Abbiamo usato un filtro personalizzato impostato da Chroma che comprendeva parte numeri et580/25 x e t600lpxr (dal set 49306), ma con un filtro di barriera/emissione di et610lp.
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Representative Results
TERPS è utilizzato per distinguere tra mono - e polisinaptici contributi in connessioni sinaptiche tra i neuroni. Mentre la stimolazione debole di una cella può essere utilizzata per verificare le connessioni dirette, guidando una maggiore attività presinaptiche spesso reclute polisinaptici connessioni (Figura 1A). TERPS funziona cheesprimono il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac e un attivatore di optogenetica e test delle connessioni in presenza di TTX per eliminare connessioni polisinaptici (Figura 1B). TTX blocca efficacemente i potenziali di azione del cervello di Drosophila , rendendolo un'adeguata preparazione per TERPS (Figura 2A). Transgenici espressione del canale del sodio di NaChBac Salva eccitabilità nei neuroni e si traduce in un potenziale grande altopiano (Figura 2B).
Interneuroni locali (LN) nel lobo antenne mostrano robuste risposte alla stimolazione olfattiva (Figura 3A). Tuttavia, poiché EPSPs individuali non sono facilmente risolti presso la soma LN, rimane poco chiaro se tali risposte derivano direttamente dall'input di neurone olfattivo del ricevitore (ORN) o indirettamente input tramite neuroni di proiezione (PN) (Figura 3B). Utilizzando TERPS, ORNs mostrato qui, infatti rendere dirette connessioni sinaptiche con LNs (Figura 3).
Una caratteristica unica dei TERPS è la sua capacità di risolvere in particolare trasmissione extra-sinaptica volume che può verificarsi con GABA o neurotrasmettitori come la serotonina. Stimolazione di un neurone serotoninergico (il CSDn) nel lobo antennal Drosophila si traduce in un misto di eccitazione ed inibizione in un interneurone locale (Figura 4A e fig. 4B). L'eccitazione è meditato di acetilcolina del trasmettitore eccitatorio e l'inibizione è causato da serotonina (Figura 4 e Figura 4). TERPS può essere utilizzato per determinare se le connessioni sono monosinaptici eliminando polisinaptici connessioni (Figura 4E). In TTX, una forte inibizione è ancora osservata in LN, suggerendo che arriva da direttamente dall'attivazione di un neurone serotoninergico specifico (Figura 4F e Figura 4). Questa connessione è bloccata dalla metisergide antagonista della serotonina. La sinapsi eccitatoria mediata dall'acetilcolina è stata eliminata in TTX, suggerendo che ha presentato da fonti polisinaptici.
Figura 1 : TERPS Elimina collegamenti polisinaptici e isolati ingressi monosinaptici. (A). un diagramma schematico che aumentando l'attività presinaptica può reclutare polisinaptici connessioni. (B). un diagramma che illustra come TERPS può rimuovere contributi polisinaptici utilizzando TTX per eliminare attività spiking in neuroni. Eccitabilità esclusivamente viene ripristinato in una popolazione di neuroni che possono poi essere eccitato optogenetically. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : NaChBac ripristina l'eccitabilità neuronale in Drosophila neuroni. (A) l'applicazione di 1 µm che TTX abolisce chiodare in neuroni di Drosophila . Sia attività spontanea e inibizione di odore-evocati sono eliminati in TTX. (B) NaChBac e csChrimson sono espressi nella CSDn e il cervello è esposto a TTX. la stimolazione csChrimson depolarizza il CSDn e dopo una soglia, c'è grande aumento nella tensione di membrana CSDn non-lineare. Questa rapida depolarizzazione costituisce un potenziale di plateau-come (inset). Ogni colore attraverso intensità di simulazione corrisponde al colore stesso nell'inserto di tensione. Questa figura è stata modificata da Zhang e Gaudry 20169. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : TERPS rivela monosinaptica connessioni tra Rodolfo e LNs. (A), A registrazione di esempio mostrano una risposta di odore in un LN. Questa risposta può essere mono - o polisinaptici in natura. (B) TERPS possono essere testati presso il ORN a synapse LN. TTX è utilizzato per bloccare i potenziali di azione e l'eccitabilità in tutte le cellule nella preparazione. Eccitabilità esclusivamente viene ripristinato in ORNs tramite il canale del sodio di NaChBac. Il ORNs può quindi essere eccitato con channelrhodopsin a suscitare rilascio sinaptico. Eventi sinaptici sono misurati post-synaptically usando cellule intere registrazioni. (C) TERPS rivela che il ORN a synapse LN è monosinaptica. TERPS può anche essere combinato con farmacologia per mostrare che la sinapsi è colinergica e bloccati dalla Mecamilamina di antagonista del recettore nicotinico (200 µM). La barra grigia verticale indica la durata della stimolazione di ORN. Questa figura è stata modificata da Zhang e Gaudry nel 20169. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : TERPS è sensibile al rilascio di trasmissione di massa o volume dai neuroni modulatori. (A) la stimolazione dei risultati CSDn in un potenziale di azione da un LN registrato nel lobo antenne di Drosophila . (B) The LN è hyperpolarized modo che CSDn stimolazione provoca un'attività sottosoglia. La risposta di LN è costituito da una depolarizzazione veloce seguita da un hyperpolarization più lento. La barra grigia indica il tempo di stimolazione CSDn. Metisergide (50 µM), un antagonista del ricevitore 5-HT ampio, blocca il hyperpolarization lento ma non ha alcun effetto sulla depolarizzazione. Mecamilamina blocca la depolarizzazione veloce suggerendo che è colinergica in natura. TERPS (C) può essere utilizzato per risolvere i componenti chimici del CSDn a synapse LN sono mono-versus polisinaptici. (D) The CSDn è stimolata in presenza di TTX e postsinaptica LN risposte sono misurate nelle cellule intere registrazioni. Il hyperpolarization persiste in TTX suggerendo che è monosinaptica in natura. Questo hyperpolarization è bloccato anche da metisergide, costanti con la trasmissione serotoninergica. La depolarizzazione breve che rimane in TTX è probabilmente mediata da gap elettrico di accoppiamento, come esso non bloccati da antagonisti nicotinici. Questa figura è stata modificata da Zhang e Gaudry nel 20169. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementari 1: lamina di Drosophila. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
File supplementari 2: fisiologia camera. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Analisi TERPS complimenti attuale tecniche utilizzate per circuito cracking attivando il rilevamento delle sinapsi tra neuroni identificati. In particolare, l'approccio rivela connessioni monosinaptica largamente silenziamento potenziali di azione con TTX durante il ripristino di eccitabilità in una popolazione di seleziona dei neuroni con il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac. Rilascio sinaptico è tratta da stimolo optogenetica mentre eventi postsinaptici sono monitorati con cellule intere registrazioni. TERPS si distingue dagli altri approcci come stretta da essendo sensibile di massa o volume trasmissione ha suscitato alle distanze più lunghe e la capacità di eseguire manipolazioni farmacologiche. La tecnica è relativamente semplice da impiegare e richiede solo una registrazione dell'elettrodo e una fonte di luce per optogenetica stimolazione, che è più fattibile di ottenere duale cellule intere registrazioni su parti pre- e post-sinaptici della sinapsi. Un requisito fondamentale dei TERPS è che i potenziali di azione sono facilmente bloccati da TTX nel sistema in fase di studio. Ma, poiché TTX agisce sui neuroni attraverso una vasta gamma di phyla tassonomica, è probabile che TERPS potrebbe essere applicato in generale per entrambi i sistemi modello dei mammiferi e invertebrati marini.
TERPS può essere facilmente modificata in un certo numero di buone maniere per facilitare sia la stimolazione della popolazione presinaptica putativa o per la registrazione da bersagli postsinaptici. Qui, uno strumento di optogenetica è stato usato per stimolare le popolazioni, anche se l'attivazione di una varietà di meccanismi è possibile. Stimolazione del nervo di assoni sensoriali, ad esempio, è routine negli studi della trasmissione dal nervo antennale in Drosophila16 ed è adatta in altri sistemi sensoriali, tra cui i nervi periferici che contiene neuroni che mechanosensory. Un approccio simile al test connettività funzionale in Drosophila espresso GCaMP indicatori di calcio in una popolazione di neuroni mentre guidano l'attività in un'altra popolazione tramite i recettori ionotropici purinocettori P2X2 e ATP applicazione2. Questo approccio dovrebbe essere compatibile con TERPS semplicemente co-esprimendo il transgene di NaChBac con il ricevitore di P2X2 in un neurone e GCaMP in un'altra popolazione per un metodo privo di patch. Tuttavia, si deve usare cautela con approcci causando depolarizzazioni più lenti, come i recettori progettista muscarinici basati esclusivamente attivati da un designer drug (DREADDs)17,18. Depolarizzazione lenta potrebbe portare all'inattivazione di NaChBac prima della generazione del potenziale d'azione.
Metodi simili a TERPS sono state impiegate nei sistemi mammiferi. Tali tecniche si combinano TTX e channelrhodopsin a tracciare la connettività tra i neuroni. Channelrhodopsin attivazione solo generalmente non depolarizzarsi neuroni sufficientemente, e così il potassio canale blocco 4-AP è essere applicato con TTX per suscitare release19,20,21. Mentre questo funziona in molte sinapsi, potrebbe non funzionare in alcune sinapsi metabotropici se il bersaglio a valle del recettore è un canale del potassio sensibile 4-AP. Per esempio, serotoninergica modulazione della risposta olfattiva in falene si basa direttamente sulla modulazione di tale un 4-AP sensibili K+ corrente (IA)22. Questo approccio, inoltre, non funzionava a CSDn a synapse LN (dati non mostrati). Così, TERPS ha un vantaggio di richiedere meno intervento farmacologico rispetto ad altri metodi comunemente usati e potrebbero funzionare alla gamma più ampia o sinapsi.
Ci sono alcune limitazioni a TERPS che dovrebbero essere considerati. In primo luogo, ci possono essere effetti collaterali da espressione cronica del canale NaChBac durante lo sviluppo. Funzione e circuito corretto assemblaggio può essere confermate confrontando l'attività dei neuroni tra controllo vola manca il costrutto NaChBac e Vola con il costrutto in assenza di TTX. Per evitare tali problemi, espressione del transgene NaChBac potrebbe essere controllato temporaneamente via l'espressione del repressore GAL4 sensibili alla temperatura, GAL8023. Inoltre, se una sinapsi è osservata soltanto in un modo stato-dipendente, è concepibile che sopprimendo l'attività di rete con TTX potrebbe nascondere una tale connessione. È importante sottolineare che un collegamento positivo osservato con TERPS probabile rappresenta una vera connessione mono-sinaptica, mentre un risultato negativo non è prova dell'assenza di una connessione.
Mentre TERPS può rivelare la capacità del trasmettitore rilasciare da un neurone per interessare postsinaptica partner chiaramente, le dinamiche di canale lento di NaChBac e le potenzialità di altopiano associate sua attivazione rendono meno applicabile allo studio dei classici neurotrasmissione. Un approccio per alterare TERPS per più veloce, più naturale rilascio del trasmettitore sarà per esprimere una versione modificata di TTX-insensibile di endogeno della drosofila sodio canale para al contrario di NaChBac. Questa alterazione sarebbe risultato nell'attività naturalistiche chiodando nella cellula presinaptica e consentire un'analisi più convenzionale della trasmissione sinaptica in assenza di attività di rete. Questo avrebbe grandi potenzialità per gli studi delle sinapsi tasso di codifica, alle quali suscitando una vasta gamma di attività presinaptica senza reclutamento polisinaptici reti sarebbe auspicabile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Joshua Singer, Jonathan Schenk, come pure gli ospiti premurosi per i commenti sul manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Ben White e Harold Zakon per discussioni sulla tecnica. Jonathan Schenk ha fornito i dati per la Figura 3A. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Whitehall e un R21 NIH al QG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
References
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