Desarrollo de dispositivos microfluídicos para estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en espacios extremadamente pequeños
Summary
Se describe un método para investigar la capacidad de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz y musgo protonemata, para alargar a través de espacios estrechos (~ 1 μm) en un dispositivo de microfluidos.
Abstract
In vivo, células de la planta creciendo de punta necesitan superar una serie de barreras físicas; sin embargo, los investigadores carecen de la metodología para visualizar el comportamiento celular en esas condiciones restrictivas. Para solucionar este problema, hemos desarrollado cámaras de crecimiento de la punta de crecimiento de células de vegetales que contienen una serie de brechas estrechas, fabricado de micro (~ 1 μm) en un sustrato de poly-dimethylsiloxane (PDMS). Este material transparente permite al usuario monitorizar procesos de alargamiento de punta en celdas individuales durante la penetración de microespacios por proyección de imagen de Time-lapse. Usando esta plataforma experimental, observamos cambios morfológicos en los tubos de polen como penetraron los microespacios. Capturamos los cambios dinámicos en la forma de un núcleo vegetativo fluorescencia etiquetada y espermatozoides en un tubo de polen durante este proceso. Además, hemos demostrado la capacidad de pelos radicales y musgo protonemata para penetrar el espacio μm 1. Esta plataforma en vitro puede utilizarse para estudiar cómo individuales las células responden a espacios físicamente limitados y puede proporcionar penetraciones en los mecanismos de crecimiento de la punta.
Introduction
Después de los granos de polen germinan en un estigma, cada grano produce un solo tubo de polen que transporta espermatozoides el óvulo y la célula central en el óvulo para la fertilización doble. Tubos de polen alargado a través del estilo y eventualmente alcanzar el óvulo detectando múltiples señales de orientación a lo largo de la manera1. Durante la elongación, tubos de polen se encuentran una serie de barreras físicas; la pista que está llena de células y tubos de polen debe entrar en el minuto abertura micropilar del óvulo para llegar a su destino (figura 1A)2. Por lo tanto, tubos de polen deben tener la capacidad de penetrar obstáculos físicos, mientras se tolera el esfuerzo de compresión de su entorno. Pelos de la raíz son otro tipo de célula vegetal crece en punta que debe soportar obstáculos físicos en el ambiente, en forma de partículas de suelo compacto (figura 1B).
Se han estudiado diversas propiedades mecánicas del tubo polínico, incluyendo presión de turgencia y rigidez de la región apical de la célula, que puede ser medida usando el método de plasmólisis incipiente3,4 y microscopía de fuerza celular (CFM) 5 , 6, respectivamente. Sin embargo, estos métodos solos no revelan si los tubos de polen son capaces de alargar a través de barreras físicas a lo largo de sus trayectorias de crecimiento. Una técnica alternativa que permite el alargamiento del tubo polínico ser monitoreado en vivo es de microscopia de dos fotones7. Sin embargo, con este método, es difícil de observar los cambios morfológicos en los tubos de polen dentro del tejido del óvulo. Además, crecimiento de pelos en el suelo puede ser visualizado usando el tomography de la radiografía computada (CT) y resonancia magnética (MRI)8, aunque con baja resolución. Aquí, presentamos un método que puede utilizarse para adquirir imágenes de alta resolución del proceso de deformación de las células en un microscopio convencional.
El objetivo general del método descrito aquí es visualizar la capacidad de elongación de células de la planta de cultivo de punta, incluyendo tubos de polen, pelos de la raíz, y musgo protonemata, en espacios muy pequeños. Los microdispositivos de poly-dimethylsiloxane (PDMS) presentadas en este manuscrito son ópticamente transparentes y de aire permeable, podemos cultura células vivas dentro del aparato y observar sus comportamientos de crecimiento bajo un microscopio. También es posible crear micro ~ espacios de escala nanométrica por la técnica de litografía blanda9 con el uso de moldes. Estas características nos permiten estudiar la capacidad de elongación de la punta de crecimiento de las células vegetales en un entorno físicamente confinado.
En este trabajo, había construido 1 μm ancho vacíos (a 4 μm de altura) en dispositivos microfluídicos y examinó la capacidad de los tubos de polen para penetrar estos obstáculos artificiales que son mucho más pequeños que el diámetro del tubo polínico cilíndrico (aproximadamente 8 μm). Esta plataforma experimental nos permite visualizar ante del tubo polen microgaps y capturar imágenes de lapso de tiempo de la respuesta, que proceso de deformación de la célula. También desarrollamos los microdispositivos que pueden utilizarse para investigar la capacidad de penetración de pelos radicales y musgo protonemata. Microdispositivos varios se han divulgado hasta la fecha que permiten la visualización de las plantas raíz10,11,12,13 y musgo protonemata14 en alta resolución. En nuestro dispositivo, una serie de canales de crecimiento del pelo de la raíz perpendicular está conectado a una cámara de crecimiento de la raíz, y los pelos de la raíz (aproximadamente 7 μm de diámetro) son guiados a canales fluídicos con una brecha amplia de 1 μm. También cultiva musgo protonemata (aproximadamente 20 μm de diámetro) en una microdevice que contiene microgaps para examinar sus respuestas a estas barreras físicas. El enfoque propuesto de microfluidos nos permite explorar la capacidad de varias células de plantas de cultivo de punta de alargar por espacios extremadamente pequeños, que no pueden ser examinadas por cualquier otro método disponible actualmente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios pasos críticos en el protocolo deben seguirse exactamente para obtener los resultados presentados arriba. En primer lugar, el PDMS vidrio y capa inferior plato las superficies deben ambos ser tratadas con plasma una suficiente cantidad de tiempo antes de la adhesión. De lo contrario, la capa PDMS localmente puede separarlo de la superficie de cristal mientras que la punta de crecimiento de las células atraviesan el microgaps. Otro paso crucial en el protocolo de pelos y musgo protonemata es la esterilización d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a H. Tsutsui y D. Kurihara por facilitarnos las plantas transgénicas, como el T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato y la línea de a. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Instituto de transformación biomoléculas de la Universidad de Nagoya y la red de la ciencia de planta avanzada de Japón. Apoyo financiero para este trabajo fue proporcionada por subvenciones de la Agencia de tecnología y ciencia de Japón (no de la concesión del proyecto de ERATO. JPMJER1004 para T.H.), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (Nos. JP16H06465 y JP16H06464 para T.H.) y la sociedad japonesa para las promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para investigación desafiante (grant no. 26600061 de Nueva York y beca Nº 25650075 y 15 K 14542 de Y.S.).
Materials
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| Murashige & Skoog Medium | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm glass-bottom dish | Iwaki | 3971-035 | |
| Surgical blade | Feather | No.11 | |
| biopsy punches | Harris | Uni-Core | |
| Gel loading tips | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | No Catalog number is avairable for this customized microscope | |
| MetaMorph imaging software | Molecular Devices |
References
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