Vi beskriver en enkel og nem protokol til måling af antistof afhængig af forbedring af infektion af Zika virus rekreationshjem serum ved hjælp af Dengue virus Reporter viruspartikler.
Antistof afhængig af forbedring af infektion har vist sig at spille en større rolle i Dengue viral patogenese. Traditionelle assays, der måler antistoffer eller serum evne til at øge infektion i utilladelig cellelinjer har påberåbt sig bruger viral output i medierne efterfulgt af plaque assays til at kvantificere infektion. For nylig, har disse assays undersøgt Dengue virus (DENV) infektion i celle linjerne ved hjælp af fluorescently mærket antistoffer. Begge disse tilgange har begrænsninger, der begrænser den udbredte brug af disse teknikker. Her, beskriver vi en simpel i vitro assay ved hjælp af Dengue virus reporter viruspartikler (RVP), express grøn fluorescerende proteiner og K562 celler til at undersøge antistof afhængig enhancement (ADE) af DENV infektion ved hjælp af serum, der var fremstillet af rhesus makakaber 16 uger efter infektion med Zika virus (ZIKV). Denne teknik er pålidelige, involverer minimal manipulation af celler, indebærer ikke anvendelse af levende replikering kompetente virus og kan udføres i en høj overførselshastighed format til at få en kvantitativ udlæsning bruger flowcytometri. Derudover kan dette assay tilpasses nemt for at undersøge antistof afhængig enhancement (ADE) af andre flavivirus infektioner som gul feber virus (YFV), japansk Equine Encephalitis virus (Kathrine VINDUM), West Nile-virus (VNV) etc. hvor RVP er tilgængelige. Lethed af opsætning af analysen, analysere data og fortolkning af resultater gør det meget åbne over for de fleste laboratorium indstillinger.
Antistof afhængig enhancement (ADE) af infektion er en proces, hvorved delvist cross-reactive antistof svar induceret af en serotype af virus øger optagelsen af en anden serotype af virus, fører til øget viral replikation og viræmi. ADE er blevet udførligt dokumenteret i Dengue virus (DENV) infektioner hvor fire store serotyper er fremherskende. I en delmængde af patienter er ADE forbundet med Dengue hæmoragisk feber (DHF). Vi har for nylig vist, at Zika virus (ZIKV) infektion induceret betydeligt høje niveauer af DENV cross-reactive antistof reaktioner, der forårsagede ADE af DENV in vitro og sandsynligvis bidraget til en forbedring af DENV viræmi i vivo1 , 2. antistof afhængig enhancement assays er et værdifuldt redskab til at vurdere kapaciteten af antistoffer til at forbedre sekundær infektion med relaterede virus og give værdifuld indsigt i patogenesen af flavivirus infektioner og informere den udviklingen af vacciner.
Analysen beskrives bruger her DENV RVP sammen med K562 celler, der normalt utilladelig til infektion. RVP er strukturelt intakt replikering inkompetente DENV virale partikler at indkode en sub-genomisk grøn fluorescerende proteiner (NGL) replikon, der kommer til udtryk efter en enkelt runde af replikering3. Som sådan er celler, der bliver smittet med RVP fluorescerer grønt og let kan påvises ved hjælp af flowcytometri eller mikroskopi. RVP bruges i denne analyse blev indhentet fra kommercielle kilder. De kan dog være genereret mod andre vira og brugt i analysen beskrives i dette håndskrift. I mellemtiden, K562 celler er en FcγIII-receptor-udtrykker leukæmi cellelinie der binder til regionen Fc af antistoffer og blive smittet i overværelse af sub neutralisere koncentrationer af antistof4,5.
ADE assays har været flittigt brugt i studier undersøger risikofaktorer for svær denguefeber og afgrænse mekanismerne af in vitro- ADE6,7,8. ADE analysen beskrives her kan hurtigt og nemt bruges til at bestemme kapaciteten af serum til at styrke in vitro- infektion ved hjælp af RVP og flow flowcytometri, sammenlignet med andre assays anvendes i øjeblikket, som kræver enten bestemmelse af plak danner enheder (pfu) i Vero celler eller antistoffarvning af inficerede celler6,7,8,9,10,11, som begge er tidskrævende og labor intensiv.
Flavivira som DENV og ZIKV dele omfattende dokumentation af homologi i begge deres strukturelle og non-strukturelle proteiner, der genererer antistoffer, der krydsreagere med hinanden13,14. Disse cross-reactive antistof reaktioner har vist sig at øge infektion både i vivo og in vitro- med enten en heterolog serotype eller andre relaterede flavivira1,2. Potentiale til at krydse øge inf…
The authors have nothing to disclose.
Beskrevet projektet var støttet af midler fra Uniformed tjenester University of Health Sciences at JJM. Udtalelser eller påstande heri er privat dem af forfatterne og ikke skal fortolkes som officielle eller reflekterende visninger af Department of Defense, Uniformed tjenester University of Sundhedsvidenskab eller ethvert andet agentur i USA Regeringen.
WGV udførte alle eksperimenter og analyseret data; JJM udviklet og overvåget undersøgelse; WGW og JJM skrev avisen.
DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
RPMI | Corning | 10-040-CV | |
FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |