Summary
Wir beschreiben eine einfache und leichte Protokoll zur Messung der Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion durch Zika Virus genesenden Serum mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel.
Abstract
Antikörper abhängige Verstärkung der Infektion hat sich gezeigt, eine wichtige Rolle in Dengue-virale Pathogenese zu spielen. Traditionelle Assays, die die Kapazität von Antikörpern oder Serum Infektion in unzulässige Zelllinien zu messen haben stützte sich auf mit viralen Ausgabe in den Medien, gefolgt von Plaque-Assays, um Infektion zu quantifizieren. Diese Tests haben in jüngerer Zeit, Dengue-Virus (DENV) Infektion in die Zell-Linien mit Gewebekulturen beschriftete Antikörper untersucht. Beide Ansätze haben Einschränkungen, die den weit verbreiteten Einsatz dieser Techniken einschränken. Hier beschreiben wir einen einfachen in Vitro Assay mit Dengue-Virus Reporter Viruspartikel (RVP), die Ausdrücken grün fluoreszierendes Protein und K562-Zellen zu Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der DENV Infektion mit Serum, das Rhesus entnommen wurde Makaken 16 Wochen nach der Infektion mit Zika-Virus (ZIKV). Diese Technik ist zuverlässig, beinhaltet minimale Manipulation von Zellen, beinhaltet jedoch nicht die Verwendung von live Replikation zuständigen Virus und in einem hohen Durchsatz-Format für eine quantitative Auslesen mit Durchflusszytometrie erhalten durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann dieser Assay leicht angepasst werden, um Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der andere Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV), West-Nil-Virus (WNV) etc., RVP vorliegen, zu untersuchen. Die einfache Einrichtung der Assay, Datenanalyse und Interpretation der Ergebnisse macht es sehr geeignet, um die meisten Labor-Einstellungen.
Introduction
Antikörper abhängige Verstärkung (ADE) der Infektion ist ein Prozess, wobei teilweise kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert durch einen Serotyp des Virus verbessert die Aufnahme von einem anderen Serotyp des Virus, was zu erhöhten Virusreplikation und Virämie. ADE wurde ausgiebig in Dengue-Virusinfektionen (DENV) dokumentiert, wo die vier wichtigsten Serotypen weit verbreitet sind. Bei einem Teil der Patienten ist ADE Dengue hämorrhagisches Fieber (DHF) zugeordnet. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Zika-Virus (ZIKV)-Infektion signifikant hohe DENV kreuzreaktiven Antikörperantworten induziert, die ADE DENV in Vitro verursacht und wahrscheinlich dazu beigetragen, die Verbesserung der DENV Virämie in Vivo1 , 2. Antikörper-abhängige Verstärkung-Assays sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der Kapazität von Antikörpern gegen Sekundärinfektion mit verwandten Viren erweitern und wertvolle Einblicke in die Pathogenese der Flavivirus Infektionen und informieren die Entwicklung von Impfstoffen.
Der Test beschrieben verwendet hier DENV RVP zusammen mit K562-Zellen, die normalerweise unzulässig für Infektionen sind. RVP sind strukturell intakt Replikation inkompetenten DENV Viruspartikel, die ein Sub-genomische grün fluoreszierendes Protein (GFP) Replicon zu kodieren, die nach einer Runde Replikation3ausgedrückt wird. Als solche Zellen, die mit RVP infiziert fluoreszieren grün und leicht detektiert werden mittels Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Die RVP in diesem Assay verwendet wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen. Sie können gegen andere Viren generiert und verwendet in der Probe in diesem Manuskript beschrieben. Unterdessen sind K562 Zellen einer FcγIII Rezeptor-exprimierenden Leukämie Zelllinie, die an die Fc-Region von Antikörper binden und im Beisein von Sub-Neutralisierung Konzentrationen von Antikörpern4,5infiziert werden.
ADE-Assays wurden ausgiebig in Studien zur Untersuchung der Risikofaktoren für schwere Dengue-Fieber und die Mechanismen der in-vitro- ADE abzugrenzen verwendet6,7,8. Der hier beschriebenen ADE-Assay schnell und einfach lässt sich die Kapazität des Serum zur Verbesserung von in-vitro- Infektion mit RVP und flow Cytometry, im Vergleich zu anderen Assays verwendet derzeit, die entweder erfordern die Bestimmung der Bildung von Plaque zu bestimmen Einheiten (Pfu) in Vero-Zellen oder Antikörper Färbung der infizierten Zellen6,7,8,9,10,11, beide zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind intensive.
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Protocol
Die Serumproben verwendet, um die hier beschriebenen Protokoll demonstrieren wurden von Rhesus-Makaken erhalten, die untergebracht und umsorgt in Übereinstimmung mit lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Richtlinien in einem Verein für die Bewertung und Zulassung von Laboratory Animal Care International (AAALAC)-akkreditierten Einrichtung. Alle Tierversuche wurden überprüft und durch institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und Proben wurden durch eine sharing-Protokoll übernommen.
1. Tag 1
Hinweis: Führen Sie die Schritte, die unten beschriebenen in einem sterilen Laminar-Flow Biosafety Kabinett für Gewebekultur in einem Labor BSL-2 verwendet.
- Tauen Sie die Serumproben bei Raumtemperatur auf und 100 µL jeder Serum-Probe in ein steriles Röhrchen. Wärme für 30 min bei 56° C in einem Wasserbad oder einer Temperatur einstellbar Thermomixer zu inaktivieren. 10-divisibel serielle Verdünnungen der Serumprobe von 1:1 bis hin zu 1:1,000 mit kalten RPMI-10 (RPMI mit 10 % fötalen Rinderserum) zu machen.
- 10 µL seriell verdünnte Serumprobe in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-V-Boden-Platte zu übertragen. Gehören Sie zwei Sätze von Kontroll-Vertiefungen, RPMI-10 mit RVP nur und ohne Serumprobe und RPMI-10 nur ohne RVP und Serumprobe. Jede Serumprobe und RPMI-10 Kontrollen in Triplicates einrichten.
- Das Dengue-Fieber-1, 2, 3 und 4 RVP von-80 ° C Gefrierschrank und Tauwetter zu entfernen Sie in einem 37 ° C-Wasserbad. Übertragen Sie die aufgetauten RVP sofort zu Eis. Erhalten rund 170 µL RVP für jede Serumprobe (10 µL des RVP X 3 Brunnen für jeden Serum-Verdünnung (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) und 10 µL des RVP X 3 Brunnen für jeden RPMI-10 mit RVP Steuern nur Brunnen).
- Pipette 10 µL des RVP in jede gut der 96-Well V-Bodenplatte mit der Serumprobe und RPMI-10 mit RVP (kein Serum) Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine RVP RPMI-10 nur (keine Serumprobe und keine RVP) Brunnen. Mischung gründlich von oben und unten pipettieren 5 – 10 mal. Fügen Sie 10 µL kalter RPMI-10 anstelle von RVP auf jedes kalte RPMI-10 nur (keine Serumprobe und keine RVP) Brunnen kontrollieren.
- Übertragen Sie 96-Well-V-Boden-Platte auf einem Inkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2. Während die 96-Well-V-Bodenplatte Inkubation ist, reinigen Sie die Oberfläche der Biosicherheit Schrank mit 70 % Ethanol und laufen Sie das UV-Licht für 15 min.
- Entfernen Sie eine vollständig konfluierende T75 Flasche K562 Zellen aus dem Inkubator, mischen Sie die Zellen, die nun mit einer sterilen 5 mL pipettieren und übertragen Sie 5 mL der Zellen auf eine sterile 15 mL konische Rohr.
Hinweis: Die K562-Zellen sind in RPMI-10 verwaltet und subkultiviert auf 1 x 106/mL. - Die Anzahl der Zellen durch das Entfernen von 10 µL Zellen aus dem sterilen 15 mL konische Röhrchen und mischen mit 10 µL Tryphan blau. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer um zu bestimmen, die Gesamtzahl der Zellen in der 15 mL konische Röhre.
- Die 15 mL konisch mit Zellen bei ~ 1.200 x g für 10 Minuten zentrifugieren, überstand abgießen und Aufschwemmen der Zellen im warmen RPMI-10 in einer Konzentration von 80.000 Zellen/30 µL Medien (2,66 x 106 -Zellen-/mL).
- Entfernen der 96-Well-V-Boden-Platte aus dem Inkubator (Schritt 1.6), 30 µL K562 Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-V-Boden-Platte übertragen und Mischen von pipettieren rauf und runter 5 – 10 mal. Übertragen Sie 96-Well-V-Boden-Platte auf einem Inkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2.
- Entfernen Sie nach Inkubation für 1 h die 96-Well-V-Boden-Platte aus dem Inkubator und Zentrifuge bei ~ 1.200 x g für 5 Minuten. Nach Zentrifugation Dekantieren der Medien aus den Vertiefungen durch die Platte in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel auf den Kopf drehen.
- Waschen Sie die Zellen in jedem Bohrloch von resuspending sie in 125 µL warm RPMI-10, mischen mit einer Pipette und Zentrifugieren der Platte ~ 1.200 x g für 5 min. Dekantieren der Medien durch die Platte in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel auf den Kopf drehen. Wiederholen Sie diese Waschschritt zwei Mal.
- Nach dem Waschen, fügen Sie 100 µL der warmen RPMI-10 zu jedem mix gut, rauf und runter mit dem pipettieren und inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2.
2. Tag 3
- Entfernen Sie die 96-Well-V-Boden-Platte mit 100 µL Zellen und Medien/Brunnen aus dem Inkubator und verschieben Sie ihn auf eine biologische Kabinett. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Mischung der Inhalt der einzelnen gut und die Zellen zu übertragen und Medien zu einem 96 gut U-Boden Platte oder, vorab mit der Bezeichnung 5 mL Polypropylenröhrchen.
- Spülen Sie jedem Bohrloch in der 96-Well-V-Boden-Platte mit 100 µL 1 % Paraformaldehyd (PFA) 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Transfer in die jeweiligen Vertiefungen in den 96 gut U-Bodenplatte oder beschrifteten 5 mL Polypropylenröhrchen vom Schritt 2.1 eine endgültige Ausbeute Konzentration von 0,5 % PFA/Brunnen oder Rohr. Mischen Sie gründlich mit einer Mehrkanal-Pipette, decken Sie die Platte mit Alu-Folie ab, und lassen Sie es sich in den Inkubator für 30 Minuten, die Zellen zu beheben.
- Bereiten Sie das Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien zum Beispiel) durch Ausführen von ungefärbten K562-Zellen, um die Seite und forward Scatter zusammen mit der Fluoreszenz-Einstellungen zu kalibrieren. Der einzige Fluoreszenz-Kanal erforderlich ist FL1, wie GFP die einzige Fluoreszenz emittiert aus den Zellen ist. Erwerben von ~ 30, 000-50.000 Zellen von jeder Probe.
Hinweis: Jeder kann Lesen einer einzigen Fluoreszenz Durchflusszytometer kann verwendet werden, für die Datenerfassung, wie Zellen infiziert mit RVP nur grün fluoreszieren aufgrund des Vorhandenseins von GLP ertönt, und keine Fluoreszenz-Kanal benötigt.
(3) Datenanalyse
-
Analysieren Sie Daten, die auf die Verwendung von Flow Cytometry Analysesoftware Durchflusszytometer (siehe Tabelle der Materialien).
- Gruppe das erste Tor basiert auf FSC-A (forward Scatter – Bereich) Vs FSC-H (forward Scatter – Höhe) Einzelzellen und Analyse12Auto-fluoreszierende Dubletten ausschließen. Dann Tor Singulett-gated Zellen basierend auf SSC-A (Side Scatter – Bereich) Vs FSC-A Fremdkörper Autofluorescent auszuschließen.
- SSC-A Vs FSC-A geschlossene Zellen analysieren, für die der Ausdruck der GLP SSC-A Vs basiert GFP-A. Bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP + Zellen für jede Verdünnung der Proben Serum und Kontrolle durch ein Tor um GFP + Zellen festlegen.
- Der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen pro Serum Probenverdünnung und Kontroll-Vertiefungen durch Division der Gesamtprozentsatz der GFP +-Zellen in dreifacher Ausfertigung Brunnen durch 3 zu bestimmen.
- Falte-Verbesserung der Infektion durch die Aufteilung der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen in Serumproben für jede Verdünnung geteilt durch den durchschnittlichen Prozentsatz der GFP +-Zellen in den RPMI-10 mit RVP (keine Serumprobe) Kontroll-Vertiefungen zu berechnen.
- Graph Falte-Erweiterung (y-Achse) versus Verdünnung (x-Achse), und führen Sie statistische Auswertung ANOVA, gefolgt von Tukey Post-hoc-Test für multiple Vergleiche mit.
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Representative Results
Seren von 4 Rhesus Makaken und auf ihr Potenzial zur Verbesserung DENV-1 getestet wurden gesammelt 16 Wochen nach Infektion mit ZIKV, 2, 3 und 4 Infektion in K562-Zellen. Die Tiere hatten Spitze Virämie von ~ 1 x 105 Exemplare von ZIKV RNA/mL Plasma vom 3. Tag nach der Infektion, die auf ein Niveau gesunken, die unter der Nachweisgrenze von 7 Tage nach der Infektion lagen. Keine Virämie wurde im Plasma auf 16 Wochen nach der Infektion festgestellt. Dann die RVP-Assay wurde durchgeführt und die gesammelten Daten wurden analysiert, wie im obigen Protokoll beschrieben.
Die gating Strategie zur Identifikation von GFP +-Zellen sind in Abbildung 1dargestellt. Das erste Tor wurde gegründet, um Autofluorescent Dubletten auszuschließen und nur einzelne Zellen basierend auf FSC-A Vs FSC-H. Die nächste Grafik zeigt nur Zellen aus der Einzelzelle Tor; dort war ein Tor gezogenen basierend auf SSC-A Vs FSC-A Fremdkörper Autofluorescent auszuschließen. Diese geschlossene Zellen wurden dann in einem dritten Grundstück basierend auf SSC-A Vs angezeigt FL1-A, GFP +-Zellen zu identifizieren. Zellen, die infizierte RVP express GFP und der Anteil der GFP + Zellen wurde durch ein Tor festlegen, um diese Zellen bestimmt. Ca. 12,2 % der GFP +-Zellen sind im ZIKV infizierten Serumprobe, im Vergleich zu keine GFP +-Zellen in der Kontrollprobe nachweisbar. Diese gating Strategie folgt für jede Verdünnung und Kontrolle Serumprobe in der Probe enthalten.
Der Anteil der GFP + Zellen wurde für jede Probenverdünnung und Kontrollprobe wie beschrieben (Abbildung 1) ermittelt. Daten aus einem repräsentativen Tier mit DENV-1 RVP sind in Abbildung 2dargestellt. Im Vergleich zu keine Kontrolle Serumprobe, die 0.253 % GFP + Zellen hatten, der Anteil der GFP + Zellen waren 2,58 % in unverdünnten Probe, 12,8 % bei 01:10, 0.735 % bei 1: 100, und 0,022 % bei 1:1,000 Verdünnung. Der Anteil der GFP + Zellen ändert sich das Serum aufgrund der abnehmenden Konzentrationen der Antikörper in der Probe verdünnt wird.
Als Erweiterung der Infektion der antikörperkonzentration zugeordnet, die ideal zur Aufnahme des Virus zu erhöhen ist, beobachteten wir einen dramatischen Anstieg der Anteil der GFP + Zellen bei 01:10 Verdünnung im Vergleich zu entweder Probe oder andere Verdünnungen unverdünnt, was darauf hindeutet, dass die unverdünnte Probe höhere Konzentrationen der Antikörper hatten, während die Verdünnungen von 1: 100 und 1:1,000 untere Ebenen des Antikörpers, die war nicht ausreichend hatte, um ADE Infektion auslösen. Wenn Antikörper-Konzentrationen signifikant hoch sind, dann sollte weitere Verdünnungen des Serums enthalten, um die Verdünnung zu bestimmen, an der ADE erkennbar wird. In den Serumproben, die wir untersucht, beobachteten wir ADE bei einer Verdünnung von 01:10. Auf der anderen Seite kann bei niedrigeren Verdünnungen ADE beobachtet werden, wenn die antikörperkonzentration im Serum recht hoch ist.
Als nächstes dividiert wir Fach-Verbesserung der Infektion den durchschnittlichen Anteil der GFP +-Zellen in dreifacher Ausfertigung Brunnen für jede Verdünnung mit der durchschnittliche Anteil der GFP + Zellen in dreifacher Ausfertigung Brunnen für keine Serum Kontrolle. Die Kinetik von ADE gegen DENV-1, 2, 3 und 4 Serotypen wurden bestimmt durch Diagrammerstellung Falte-Verbesserung auf der y-Achse und Serum Verdünnung auf der x-Achse (Abbildung 3). Die Daten zeigen, dass das Serum auf 16 Wochen Post Infektion deutlich erfasst verbessert Infektion der K562 Zellen durch DENV-1, 2, 3 und 4 Serotypen bei einer Verdünnung von 01:10.
Abbildung 1: Strategie für die Beschaffung und Analyse von Durchflusszytometrie Gating. K562 Zellen infiziert mit DENV RVP express GFP, die mit einem Durchflusszytometer analysiert wurde. (A) kein Serum Kontrolle und (B) 16 Wochen Post-ZIKV Serum infiziert. Zellen wurden zuerst gated basierend auf forward Scatter Fläche (FSC-A) Vs forward Scatter Höhe (FSH-H) auszuschließende Dubletten, gefolgt von einem Side Scatter (SSC-A) Vs FSC-A um Verunreinigungen auszuschließen. Die SSC-A Vs FSC-A geschlossene Zellen wurden dann gated basierend auf SSC-A Vs GFP-A (grüne Fluoreszenz Protein-Bereich). Die schwarzen Rechtecke und Ellipsen repräsentieren die Tore, und die Zahlen über den Toren sind der Anteil der Zellen, die in das Tor fallen. Der schwarze Pfeil zwischen den Parzellen FACS zeigt die Reihenfolge der Tore benutzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Punkt plottet zeigt Frequenz von DENV RVP + Zellen. Der Anteil der K562 Zellen, die mit DENV-1 RVP infiziert waren wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Serum eine repräsentative Rhesus-Makaken auf 16 Wochen Post Infektion abgeholt wurde mit DENV-1 RVP unverdünnt oder auf einem 01:10, 1: 100 und 1:1,000 Verdünnungen inkubiert und keine Serumproben Kontrolle verglichen. Der Anteil der GFP + Zellen bei jeder Konzentration des Serums wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: deutliche Verbesserung von Dengue-Fieber-1, 2, 3 und 4 Infektion wird beobachtet, um 01:10 Verdünnung des Serums. Antikörper abhängige Verstärkung der Dengue-Infektion wurde vom Plotten Serum Verdünnungen auf die x-Achse und Falten-Verstärkung (bezogen auf keine Serum-Probe-Steuerelemente) auf der y-Achse für die 4 DENV-Serotypen geprüft. Seren gesammelt von 4 ZIKV immun Rhesus-Makaken 16 Wochen nach Infektion in diesem Assay verwendet wurde. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler und * stellt p < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Flaviviren wie DENV und ZIKV Teilen deutlichen Anzeichen Homologie in ihre strukturelle und nicht strukturelle Proteine, die Antikörper zu erzeugen, die mit einander13,14Kreuzreaktion. Diese kreuzreaktiven Antikörperantworten nachweislich zur Verbesserung der Infektion in Vivo und in Vitro mit einer heterologen Serotyp oder andere im Zusammenhang mit Flaviviren1,2. Kreuz zu verbessern, Infektion hat erhebliche Auswirkungen für die Behandlung der Krankheit und auch für die Impfstoffentwicklung.
Traditionelle Kultur basierte Testsysteme verwenden non-permissive Zellen, die infiziert sind mit ansteckenden live DENV in Anwesenheit von Serum. Verbesserung der Infektion wird durch Quantifizierung der Virusmenge im überstand mit standard Plaque Assays11gemessen. Dieser Test erfordert Kultur des Virus in zwei Zelllinien und deutlich längere Zeit durchführen. Darüber hinaus Serotypen nicht alle DENV Plaque die gleiche Weise, diese Tests eine weitere Ebene der Komplexität hinzufügen.
Andere Tests haben die Plaque basierte Assay Protokoll zur Infektion der Zell-Linien durch die Kombination von intrazelluläre Färbung für DENV mit fluoreszent markierten Antikörpern zu messen und flow Cytometry9,10,14geändert. Obwohl dies den Zeitaufwand reduziert für den Grad der Infektion im Vergleich zu Plaque Basis bestimmen gibt Assays es eine Reihe von Optimierungsschritte erforderlich für diese Assays, konsequent zu arbeiten. Intrazelluläre Färbung Protokolle sind zeitaufwendig, da sie Befestigung und permeabilizing Zellen, gefolgt erfordern von intrazelluläre Färbung und erfordern gut betitelten DENV spezifische Antikörper, die jeden Serotyp deutlich unterscheiden können. Darüber hinaus diese Tests sind nicht leicht zugänglich, ein hoher Durchsatz-Format und hohes Maß an Variabilität der Intra-Assay leiden.
Im Gegensatz zu der oben beschriebenen Assays DENV RVP basierte Assay ist einfach einzurichten, verwendet keine ansteckenden Virus und ist sehr offen für hohen Durchsatz, der leicht verwendet werden kann, um das Potenzial des Serums, Infektion erhöhen zu messen. Darüber hinaus dieser Assay ist nicht als arbeitsintensiv als andere Tests und kann innerhalb von 2-3 Tagen, das einen wesentlicher Vorteil gegenüber aktuellen ADE-Assay-Protokolle bietet abgeschlossen werden. Wenn der Test im Manuskript beschrieben die Kapazität des ZIKV infiziert Serum zur Verbesserung der Infektion von DENV-1, 2 geprüft, 3 und 4 Serotypen, Assays lässt sich leicht anpassen, Serum von beiden experimentell zu untersuchen und klinische Proben von anderen erhalten Flavivirus Infektionen wie Gelbfieber-Virus (YFV), japanische Equine Enzephalitis-Virus (JEEV) und West-Nil-Virus (WNV) Wenn RVP verfügbar sind und mit anderen Zelllinien. Es ist jedoch entscheidend für den Assay zu optimieren, indem Sie das Volumen des RVP, Anzahl der Zellen/Brunnen und die Dauer der Inkubation ermöglichen optimale Färbung der Zellen ohne Hintergrundfärbung titrieren.
Titrationen durch Inkubation eine definierte Anzahl von Zielzellen (z.B. 80.000 K562-Zellen oder eine Zelllinie getestet) mit Variablen Mengen von RVP (z. B. 2,5 µL, 5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 20 µL, etc.) durchgeführt werden müssen. Sobald die richtige Titer für jedes RVP vorliegt, kann die Dauer der Inkubation bestimmt werden, mit den erhaltenen Titer zusammen mit der definierten Anzahl von Zellen und Bebrüten sie wie beschrieben in das Protokoll für Variable Zeiträume (z. B. 24 h, 48 h 72 h, etc.).
Wir beobachteten ADE der Infektion durch alle 4 Serotypen des DENV bei einer Verdünnung von 01:10, was darauf hindeutet, dass ein Antikörpertiter im Serum benötigt 10-fach verdünnt werden, um Verbesserung der Infektion zu erkennen. Auf der anderen Seite, haben andere Studien Verbesserung bei niedrigeren Verdünnungen berichtet, die darauf hinweisen würden, dass die Konzentrationen von Antikörpern im Serum Beispiel wahrscheinlich zu hoch, brauchen niedrigere Verdünnungen, ADE in Vitrozu erkennen. Da die richtige Konzentration des Antikörpers in der Serumprobe ADE abhängt, dürften die meisten Proben ADE bei Verdünnungen niedriger als das unverdünntes Serum zeigen.
Abschließend das Protokoll beschrieben in diesem Manuskript ist einfach und leicht zu verabschieden, und erlaubt für die Aufstockung um Hochdurchsatz-Screening von einer großen Anzahl von Proben in einem kurzen Zeitraum Zeitrahmen zu ermöglichen, qualitativ hochwertige Daten liefern, die leicht analysiert werden können und interpretiert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Das beschriebene Projekt wurde aus Mitteln der Sonstiges Services University of Health Sciences, JJM unterstützt. Meinungen oder Aussagen, die hierin enthaltenen sind die privaten, der Autoren und nicht um sein als offizielle oder reflektierenden die Aussicht auf das Department of Defense, Sonstiges Dienstleistungen University Health Sciences oder einer anderen Agentur der USA ausgelegt Regierung.
WGV alle Experimente durchgeführt und analysiert die Daten; JJM konzipiert und betreut die Studie; WGW und JJM, schrieb die Zeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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