Summary
אנו מתארים פרוטוקול פשוט וקל למדידת שיפור התלויים נוגדנים לזיהום על ידי Zika וירוס הבראה בנסיוב באמצעות וירוס דנגה כתב נגיפים.
Abstract
שיפור התלויים נוגדנים לזיהום הוכח לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה נגיפי קדחת דנגה. מבחני מסורתי המודדים את הקיבולת של נוגדנים או סרום כדי לשפר הידבקות שורות תאים שבידנו צריכים לסמוך על באמצעות פלט ויראלי בתקשורת ואחריו פלאק מבחני לכמת זיהום. לאחרונה, מבחני אלו בחנו דנגה זיהום בנגיף (DENV) בשורות תאים באמצעות נוגדנים fluorescently עם תוויות. שתי גישות אלה יש מגבלות שמגבילות את השימוש הנרחב של טכניקות אלה. כאן, אנו מתארים assay פשוט במבחנה באמצעות דנגה כתב ויראלי חלקיקי וירוס (RVPs) המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק ותאים K562 לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהום DENV השימוש סרום זה היה המתקבלים רזוס קופי מקוק 16 שבועות לאחר ההדבקה בנגיף Zika (ZIKV). טכניקה זו הוא אמין, כרוך מניפולציה מינימלי של תאים, אינו כרוך השימוש של וירוס המוסמכת שכפול בשידור חי, יכול להתבצע בתבנית תפוקה גבוהה כדי לקבל בדיקה כמותית באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, וזמינותו זו ניתן להתאים בקלות לבדוק נוגדנים התלויים שיפור (איד) של זיהומים נוספים flavivirus כגון נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס. קדחת מוח הסוסים יפני (JEEV), וירוס הנילוס המערבי (WNV) שבו זמינות RVPs וכו. הקלות של הגדרת וזמינותו, ניתוח הנתונים, ופרשנות תוצאות הופך לבצע רוב ההגדרות מעבדה.
Introduction
נוגדן התלויים שיפור (איד) של זיהום הוא תהליך לפיה תגובות נוגדנים cross-reactive חלקית המושרה על ידי serotype של וירוס משפר ספיגת של serotype נוספת של וירוס, המוביל שכפול ויראלי מוגברת viremia. אייד תועד בהרחבה דנגה זיהומים וירוס (DENV) שבו ארבע הגדולות אשר נגרמו מהזנים אליהם גם הם נפוצים. בקבוצת משנה של חולים, אייד משויכת קדחת דנגה מדמם (DHF). לאחרונה הראינו כי זיהום בנגיף (ZIKV) Zika המושרה רמות גבוהות באופן משמעותי של תגובות נוגדנים cross-reactive DENV גרם אייד של DENV חוץ גופית בתוך , סביר להניח תרמו שיפור DENV viremia in vivo1 , 2. מבחני שיפור התלויים נוגדנים הם כלי חשוב כדי להעריך את הקיבולת של נוגדנים כדי לשפר את זיהום משני עם וירוסים הקשורים ואת לספק תובנות לתוך בפתוגנזה של זיהומים flavivirus ליידע פיתוח חיסונים.
וזמינותו המתוארים כאן משתמש DENV RVPs יחד עם תאים K562, כי הם בדרך כלל שבידנו לזיהום. RVPs הם שכפול מבנית כשירים DENV חלקיקים נגיפיים אשר קידוד של replicon תת-גנומית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הבאה לידי ביטוי לאחר סבב אחד של שכפול3. ככזה, תאים נדבקים בנגיף RVPs לזרוח ירוק, ניתן בקלות להבחין באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ. RVPs בשימוש assay זו התקבלו ממקורות מסחריים. הם יכולים, לעומת זאת, להיות שנוצר נגד וירוסים אחרים, המשמשים וזמינותו המתואר בכתב היד. בינתיים, תאים K562 הם FcγIII-קולטן-הבעת ' לוקמיה תא קו לאגד האזור Fc של נוגדנים, להידבק בנוכחות תת נטרול ריכוזים של נוגדן4,5.
מבחני אייד שימשו בהרחבה מחקרים חוקרת את גורמי הסיכון עבור דנגה חמור וכדי ניסחו את המנגנונים של במבחנה אייד6,7,8. וזמינותו אייד המתוארים כאן יכול בקלות ובמהירות לשמש כדי לקבוע את הקיבולת של נסיוב flow cytometry, לעומת שאר מבחני בשימוש כיום, אשר דורשים גם הקביעה של פלאק ויוצרים ולשפר במבחנה זיהום באמצעות RVPs יחידות (pfu) ורו תאים או נוגדן כתמים נגוע תאים6,7,8,9,10,11, שניהם נמצאים זמן רב ודיני אינטנסיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הדוגמאות סרום בשימוש כדי להדגים את הפרוטוקול המתואר כאן, התקבלו קופי מקוק רזוס שהיו שוכנו, בהתאם במדינת מקומיים, ושלמישהו אכפת הפדרלית מדיניות שיוך עבור הערכת ולדאוג הסמכה של מעבדה חיה הבינלאומי (AAALAC)-מוכר מתקן. כל ניסויים בבעלי חיים היו נבדקו ואושרו על-ידי אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש, דגימות נרכשו דרך רקמה שיתוף פרוטוקול.
1. יום 1
הערה: בצע את כל השלבים המתוארים להלן ב- cabinet אבטחה בעל דירוג זרימה שכבתית סטרילי המשמש תרביות רקמה במעבדה BSL-2.
- להפשיר את הדוגמאות סרום בטמפרטורת החדר, להעביר µL 100 לכל דגימת נסיוב צינור סטרילי. חום הפוך ללא פעיל למשך 30 דקות ב 56° C באמבט מים או של thermomixer טמפרטורה מתכוונן. להפוך 10-fold דילולים טורי של דגימת נסיוב ועד 1:1 1:1,000 באמצעות RPMI קר-10 (RPMI עם 10% סרום שור עוברית).
- העברת µL 10 דגימת נסיוב באופן סדרתי מדולל כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן סטרילי. כוללים שתי קבוצות של שליטה וולס, RPMI-10 עם RVPs בלבד, ללא דגימת נסיוב, ו RPMI-10 רק בלי RVPs ובלי דגימת נסיוב. להגדיר כל דגימת נסיוב ופקדים RPMI-10 ב- triplicates.
- להסיר את קדחת דנגה-1, 2, 3 ו 4 RVPs מן המקפיא-80 ° C ו להפשיר אותם בתוך אמבט מים 37 º C. להעביר את RVPs המופשרים מיד לקרח. להשיג כ 170 µL RVPs עבור כל דגימה סרום (10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל בסרום (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) 10 µL של בארות RVPs x 3 עבור כל אחד ה-RPMI-10 עם RVP רק לשלוט וולס).
- פיפטה 10 µL של RVPs לתוך כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן המכיל את דגימת נסיוב, כדי RPMI-10 עם RVPs (ללא סרום) שליטה וולס. אל תוסיף בארות RVPs RPMI-10 בלבד (אין דגימת נסיוב, אין RVP). לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להוסיף 10 µL קר RPMI-10 במקום RVPs על כל RPMI-10 קר בלבד (אין דגימת נסיוב RVP אין) ובקרת בארות.
- להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של שעה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2. בעוד צלחת V-התחתון 96-ובכן הוא המקננת, לנקות את השטח של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ולהפעיל את אולטרא סגול למשך 15 דקות.
- הסר בקבוקון T75 באופן מלא confluent של תאים K562 החממה, לערבב את התאים היטב באמצעות pipet מ ל סטרילי ולאחר להעביר 5 מ של תאים צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
הערה: התאים K562 הם שמרו ב- RPMI-10, subcultured-עונה 1 פרק 106/mL. - לספור את מספר תאים על-ידי הסרת תאים µL 10 מהצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל ומערבבים עם 10 כחול tryphan µL. לספור את התאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים בצינור חרוט 15 מ"ל.
- Centrifuge 15 mL חרוט עם תאים ב ~ 1,200 x g למשך 10 דקות, decant את תגובת שיקוע, resuspend תאי RPMI חמים-10-ריכוז של 80,000 µL תאים/30 של מדיה (2.66 x 106 תאים /mL).
- הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן של החממה (שלב 1.6), להעביר 30 µL של תאים K562 כל טוב של צלחת V-התחתון 96-ובכן, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 – 10 פעמים. להעביר את הצלחת התחתונה V 96-ובכן אינקובטור, תקופת דגירה לצלחת של 1שעות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2.
- לאחר המקננת עבור 1 h, הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן מן החממה צנטריפוגה ב ~ 1,200 x g למשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, decant המדיה מן הבארות מאת מתהפך לגמרי את הצלחת לתוך מיכל המכיל 10% מלבין.
- לשטוף את התאים היטב כל מאת resuspending אותם ב- 125 µL של RPMI חמים-10, לערבב היטב עם פיפטה ולאחר centrifuge את הצלחת ב g ~ 1,200 x עבור 5 דק Decant התקשורת על-ידי הפעלת את הצלחת במהופך לתוך מיכל המכיל 10% מלבין. חזור על שלב זה לשטוף פעמיים.
- לאחר הרחצה, להוסיף 100 µL חמים RPMI-10 לכל אחת, לערבב למעלה ולמטה עם pipet, דגירה את הצלחת. בשביל h 48-37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5%2.
2. יום 3
- הסר את לוחית V-התחתון 96-ובכן המכיל 100 µL של תאים, מדיה/טוב מן החממה והעברתו אבטחה בארון. שימוש של פיפטה רב-ערוצי, לערבב התוכן של כל אחד טוב ולהעביר את התאים ואת מדיה 96 טוב U-תחתון צלחת או כדי הנקרא מראש 5 מ ל צינורות פוליפרופילן.
- לשטוף כל טוב ב 96-ובכן V-תחתית לצלחת עם µL 100% 1 Paraformaldehyde (PFA) ב- 1-פוספט Buffered מלוחים (PBS) והעברת הבארות בהתאמה גם צלחת U-התחתון או צינורות פוליפרופילן שכותרתו מ ל 96 מ שלב 2.1 להניב סופית ריכוז של 0.5% מחברים/טוב או ברכבת התחתית. לערבב ביסודיות באמצעות פיפטה רב-ערוצי עם כיסוי לצלחת עם נייר אלומיניום, תן לזה לנוח בחממה במשך 30 דקות לתקן את התאים.
- להכין את cytometer זרימה (ראה טבלה של חומרים לדוגמה) על-ידי הפעלת מוכתם K562 תאים כדי לכייל את הצד ופיזור קדימה יחד עם ההגדרות זריחה. הערוץ היחיד פלורסצנטיות הנדרש הוא FL1, כמו GFP היחידה ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט מהתאים. לרכוש ~ 30, 000 – 50,000 תאים מחלון כל דגימה.
הערה: כל cytometer זרימה היכול לקרוא פלורסצנטיות יחיד יכול לשמש עבור רכישת הנתונים, כפי תאים נגועים RVPs רק פולט קרינה פלואורסצנטית ירוק בשל נוכחותם של ה-GFP, אין ערוץ פלורסצנטיות אחרים נדרשים.
3. ניתוח נתונים
-
ניתוח נתונים רכשה ב- cytometer זרימה באמצעות תוכנות ניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים).
- ערכת בשער הראשון מבוססת על FSC-A (קדמי פיזור – אזור) לעומת FSC-H (פיזור קדימה – גובה) כדי לכלול תאים בודדים או להשמיט אוטומטית-פלורסנט doublets ניתוח12. לאחר מכן, שער תאים ממותגת גופיה בהתבסס על האס-A (לצד פיזור – אזור) לעומת FSC-A כדי לא לכלול כל פסולת autofluorescent.
- לנתח האס-A לעומת תאים מגודרת FSC-A עבור הביטוי של GFP בהתבסס על האס-A vs GFP-א לקבוע את אחוז ה-GFP + תאים עבור כל דילול של הדוגמאות סרום ושליטה על-ידי הגדרת שער סביב GFP + התאים.
- לקבוע את האחוז הממוצע של GFP + תאים עבור כל דגימה בסרום שליטה בארות על-ידי חלוקת האחוז הכולל של GFP + בתאים הבארות triplicate ע י 3.
- לחשב קיפול-שיפור של זיהום על ידי חלוקת האחוז הממוצע של GFP + בתאים הדוגמאות סרום עבור כל דילול חלקי האחוז הממוצע של GFP + תאי ה-RPMI-10 עם RVPs (אין דוגמה סרום) שליטה וולס.
- גרף קיפול-שיפור (ציר y) נגד דילול (ציר x), ולבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות ANOVA ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות מרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שרה מ 4 רזוס קופי מקוק היו שנאספו 16 שבועות לאחר ההדבקה עם ZIKV ונבדק את הפוטנציאל שלהם לשפר את DENV-1, 2, 3 ו 4 זיהום בתאים K562. החיות היו נגיפי ~ 1 x 105 עותקים של RNA ZIKV/mL של פלסמה ביום 3 לאחר זיהום ירדו לרמות שהיו מתחת לגבול של זיהוי על ידי 7 ימים לאחר ההדבקה. Viremia לא זוהה הפלזמה-16 שבועות לאחר הפגיעה. לאחר מכן, וזמינותו RVP בוצעה, נותחו הנתונים שנאספו, כמפורט בפרוטוקול לעיל.
האסטרטגיה המגביל המשמש לזיהוי GFP + תאים מוצגים באיור1. השער הראשוני נקבע שלא לכלול autofluorescent doublets וכלול רק תאים בודדים בהתבסס על FSC-A vs FSC-ה העלילה הבאה מציגה רק תאים מהשער תא בודד; השער היה נמשך vs האס-A על בסיס FSC-A כדי לא לכלול כל פסולת autofluorescent. אלה מגודרת תאים הוצגו לאחר מכן בחלקה השלישי מבוסס על האס-A vs FL1-A כדי לזהות GFP + תאים. תאים נגועים RVPs אקספרס GFP, האחוז של GFP + תאים נקבע על-ידי הגדרת שער מסביב תאים אלה. כ- 12.2% GFP + תאים הן לזיהוי בדוגמת סרום נגוע ZIKV, לעומת אף GFP + תא במדגם שליטה. אסטרטגיה זו חסימה ואחריו במשך כל סרום דילול ושליטה מדגם הכלולים וזמינותו.
האחוז של GFP + תאים נקבע לכל דגימה דילול או דגימת הבקרה כמתואר לעיל (איור 1). נתונים מחיה נציג באמצעות RVPs DENV-1 מוצגים באיור2. לעומת ללא סרום שליטה המדגם היה 0.253% GFP + תאים, האחוז של GFP + התאים היו 2.58% במדגם מדולל, 12.8% בעשר: 1, 0.735% בטחונות ו 0.022%-דילול 1:1,000. האחוז של GFP + תאים ישתנה כפי הסרום הוא מדולל עקב הפחתת ריכוז נוגדן במדגם.
כמו שיפור של זיהום משויך ריכוז נוגדן זה הוא אידיאלי כדי להגביר את ספיגת של וירוסים, הבחנו עלייה דרמטית באחוז התאים GFP + 1:10 דילול לעומת או מדולל דילולים דוגמה או אחרים, רומז כי המדגם מדולל היה ריכוז גבוה של נוגדנים, ואילו דילולים בטחונות ו 1:1,000 היו רמות נמוכות של נוגדנים שלא היה מספיק כדי לגרום אייד של זיהום. אם נוגדן ריכוזים גבוהים באופן משמעותי, אז דילולים נוספים של נסיוב צריך להיות כלול לקבוע דילול בו איד הופך נראית לעין. הדגימות סרום שבדקנו, הבחנו אייד-לדילול של 1:10. מצד שני, אייד ייבחנו-דילולים נמוכים יותר אם ריכוז נוגדן בנסיוב הוא גבוה למדי.
בשלב הבא, אנחנו מחושב הקיפול-השיפור של זיהום על ידי חלוקת האחוז הממוצע של GFP + בתאים הבארות triplicate עבור כל דילול עם האחוז הממוצע של GFP + בתאים הבארות triplicate עבור שליטה סרום. קינטיקה של איד נגד DENV-1, 2, 3 ו 4 אשר נגרמו מהזנים אליהם נקבעו על ידי יצירת גרפים קיפול-שיפור על הדילול-y ואת סרום בציר ה-x (איור 3). מציג נתונים הנסיוב. שנאספו ב 16 שבועות פוסט זיהום משמעותי משופרת זיהום של K562 תאים על-ידי-DENV-1, 2, 3 ו 4 אשר נגרמו מהזנים אליהם-לדילול של 1:10.
איור 1: Gating אסטרטגיה עבור רכישת וניתוח מאת cytometry זרימה. K562 תאים נגועים DENV RVPs אקספרס GFP ניתחנו באמצעות cytometer של זרימה. (א) אין סרום ובקרה (B) בשבוע 16 פוסט-ZIKV נגוע סרום. התאים הראשונים היו מגודרת המבוססת על פיזור קדימה אזור (FSC-A) לעומת פיזור קדימה גובה (FSH-H) כדי לא לכלול doublets עקב לצד פיזור (האס-A) vs FSC-A כדי לא לכלול פסולת. האס-A לעומת תאים מגודרת FSC-A היו אז פיקוח המבוסס על האס-A vs GFP-A (ירוק פלורסצנטיות חלבון-אזור). שחור מלבנים, אליפסות לייצג את השערים, המספרים מעל השערים האחוז של תאים נופלים בתוך השער. החץ השחור בין החלקות FACS מציגה את רצף השערים בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מגרשים נקודה נציג מציג בתדר של DENV RVP + תאים. האחוז של תאים K562 היו נגועים DENV-1 RVPs נקבע על ידי cytometry זרימה. סרום שנאסף מקוק רזוס נציג ב 16 שבועות פוסט הזיהום מתפשט עם RVPs DENV-1 או מדולל או 1:10, 1: 100, ו 1:1,000 דילולים, לעומת דגימות הבקרה ללא סרום. אחוז תאים GFP + על כל ריכוז של סרום מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שיפור משמעותי של קדחת דנגה-1, 2, 3 ו 4 זיהום נצפית ב 1:10 דילול של נסיוב. שיפור התלויים נוגדנים לזיהום דנגה נבדק עבור אשר נגרמו מהזנים 4 DENV אליהם על ידי ההתוויה דילולים סרום על ציר ה-x, קיפול-שיפור (יחסית אין פקדי דגימת נסיוב) בציר ה-y. סרה שנאסף 4 קופי מקוק רזוס המערכת החיסונית ZIKV בן 16 שבועות לאחר הזיהום היה בשימוש זה וזמינותו. קווי שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית ו * מייצג p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flaviviruses כגון DENV ו- ZIKV לשתף עדויות משמעותיות של הומולוגיה בחלבונים שני שלהם מבניים שאינן מבניות המייצרים נוגדנים cross-react אחד עם השני13,14. תגובות cross-reactive נוגדנים אלה הוכחו לשפר לזיהום הן ויוו והן במבחנה עם heterologous serotype או אחרים הקשורים flaviviruses1,2. הפוטנציאל לשיפור צלב זיהום יש השלכות משמעותיות עבור ניהול של המחלה וכן לפיתוח חיסון.
התרבות המסורתית מבוססת מבחני להשתמש שאינם מתירניות התאים שהודבקו עם זיהומיות בשידור חי DENV בנוכחות סרום. שיפור של זיהום נמדד על ידי לכימות הכמות של נגיף תגובת שיקוע באמצעות שלט רגיל מבחני11. Assay הזה דורש תרבות של וירוס בשתי שורות תאים ודורש באופן משמעותי תקופות זמן לבצע. בנוסף, לא כל DENV אשר נגרמו מהזנים אליהם פלאק באותו האופן, הוספת רמה נוספת של המורכבות מבחני אלה.
מבחני אחרים ששינית את פרוטוקול assay פלאק מבוסס כדי למדוד זיהום של שורות תאים על-ידי שילוב מכתים תאיים על DENV באמצעות נוגדנים fluorescently שכותרתו, לזרום cytometry9,10,14. למרות זה מפחית את הזמן הנדרש כדי לקבוע את רמת זיהום לעומת לוח המבוסס על מבחני שם הם מספר פעולות אופטימיזציה הדרושים עבור אלה מבחני לעבוד באופן עקבי. פרוטוקולים מכתימים תאיים הן זמן רב, הם דורשים תיקון, permeabilizing של תאים ואחריו מכתים תאיים ודורשים היטב titrated נוגדנים ספציפיים DENV בבירור יכול להפלות את כל serotype. בנוסף, מבחני אלה לא ממושמעים בקלות לתבנית תפוקה גבוהה, סובלים רמות גבוהות של השתנות אינטרה-וזמינותו.
בניגוד מבחני שתואר לעיל, וזמינותו RVPs DENV מבוסס קל להגדיר, אינו משתמש וירוס מדבק, לבצע תפוקה גבוהה יכול לשמש בקלות למדוד את הפוטנציאל של הסרום להגברת הזיהום. בנוסף, assay זו אינה כפי עמל רב כמו מבחני אחרים, יכול להסתיים בתוך 2-3 ימים, אשר מציע יתרון גדול על פרוטוקולים assay אייד הנוכחי. למרות וזמינותו המתואר בכתב היד בחן את היכולת של ZIKV נגוע בסרום להגברת זיהום של DENV-1, 2, 3 ו 4 אשר נגרמו, מהזנים אליהם וזמינותו ניתן להתאים בקלות לבחון סרום של שנינו ניסיוני, דוגמאות קליניות המתקבל השני זיהומים flavivirus כמו נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס. קדחת מוח הסוסים יפני (JEEV) ו וירוס הנילוס המערבי (WNV) אם RVPs זמינים, ועם שורות תאים אחרים. חיוני, עם זאת, כדי למטב את הבדיקה על-ידי titrating את עוצמת הקול של RVP ', ' מספר תאים/טוב, ואת משך הדגירה כדי לאפשר מכתים אופטימלית של תאים ללא רקע מכתים.
Titrations צריך להתבצע על ידי המקננת מספר מוגדר של התאים היעד (לדוגמה, תאים K562 80,000 או קו תא הנבדקת) עם אמצעי האחסון משתנה של RVPs (לדוגמה, 2.5 µL 5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 20 µL, וכו '). ברגע כייל הנכון עבור כל RVPs מתקבל, ניתן לקבוע את משך הדגירה בעזרת כייל את שהושג יחד עם מספר מוגדר של תאים, המקננת בהם כמפורט בפרוטוקול לפרקי משתנה (לדוגמה, 24 שעות ביממה, 48 שעות 72 h, וכו ').
הבחנו אייד של זיהום כל 4 אשר נגרמו מהזנים אליהם של DENV-לדילול 1:10, רומז רמות נוגדן בנסיוב צריך להיות מדולל 10-fold כדי לזהות שיפור של זיהום. מצד שני, מחקרים אחרים דיווחו על שיפור-דילולים נמוכים יותר, מה שמצביע כי הריכוזים של נוגדן במדגם סרום היו סיכוי גבוה מדי, הזקוקים דילולים נמוכים יותר כדי לזהות אייד במבחנה. כמו אייד תלוי הריכוז הנכון של נוגדן במדגם סרום, דגימות רוב נוטים להציג אייד-דילולים נמוך יותר מאשר הנסיוב מדולל.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה היא פשוטה וקלה לאמץ, והיא מאפשרת שינוי גודל כדי לאפשר הקרנה תפוקה גבוהה של מספר רב של דוגמאות במסגרת זמן תקופה קצרה להניב נתונים באיכות גבוהה בקלות יכול להיות מנותח, מפרשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט המתוארת נתמכה על ידי כספים באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות כדי JJM. דעתם או את הנחרצות הכלול הם אלה פרטי של המחברים ואינם להיות לפרש הרשמי או המשקף את הנופים של משרד ההגנה, באוניברסיטת שירותי במדים של מדעי הבריאות או בכל חברה אחרת של ארצות הברית הממשלה.
WGV ביצע את כל הניסויים וניתח את הנתונים; JJM עוצב והשגחת המחקר; WGW JJM כתבו בעיתון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
