Summary
Les auteurs décrivent un protocole simple et facile pour mesurer enhancement dépendante anticorps d’infection par virus de Zika sérum convalescent à l’aide de particules virales journaliste virus de la Dengue.
Abstract
Amélioration dépendante anticorps d’infection a été démontrée à jouer un rôle majeur dans la pathogénie virale de la Dengue. Traditionnels tests qui mesurent la capacité d’anticorps ou de sérum d’augmenter l’infection dans les lignées cellulaires inadmissible ont compté sur l’utilisation de production virale dans les médias, suivies par des essais de plaque pour quantifier l’infection. Plus récemment, ces tests ont examiné infection par le virus (DENV) la Dengue dans les lignées cellulaires à l’aide d’anticorps fluorescent étiquetés. Ces deux approches ont des limites qui restreignent l’utilisation généralisée de ces techniques. Nous décrivons ici un essai simple in vitro à l’aide de Dengue virus journaliste particules virales (VPR) qui expriment la protéine fluorescente verte et les cellules K562 à examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’infection DENV sérum obtenu à partir de rhésus macaques 16 semaines après l’infection par le virus Zika (ZIKV). Cette technique est fiable, implique la manipulation des cellules, ne nécessite pas l’utilisation de virus compétente de réplication direct et peut être effectuée dans un format haut débit pour obtenir une lecture quantitative à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce test peut être facilement adapté pour examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’autres infections flavivirus tels que les virus de la fièvre jaune (SVA), virus de l’encéphalite équine japonais (tarek), virus du Nil occidental (VNO) etc. où les VPR est disponibles. La facilité de mise en place du test, analyse des données et interprétation des résultats rendent très favorable à la plupart des paramètres de laboratoire.
Introduction
Amélioration dépendante des anticorps (ADE) de l’infection est un processus par lequel partiellement une réaction croisée d’anticorps induits par un sérotype de virus augmente l’absorption d’un autre sérotype du virus, conduisant à une virémie et une augmentation de la réplication virale. ADE a été largement documenté dans les infections de virus (DENV) la Dengue où quatre principaux sérotypes sont fréquentes. Dans un sous-groupe de patients, l’ADE est associée à une fièvre hémorragique (DHF). Nous avons récemment démontré que Zika infection par le virus (ZIKV) induit des réponses en anticorps croisée DENV origine ADE de DENV in vitro et probablement contribué à l’amélioration de la virémie DENV in vivo1 significativement élevés , 2. dosages d’anticorps dépendant d’amélioration constituent un outil précieux pour évaluer la capacité des anticorps à améliorer une infection secondaire avec des virus apparentés et donnent des indications précieuses sur la pathogenèse des infections par un flavivirus et informer le développement de vaccins.
Le test décrit ici utilise DENV VPR ainsi que les cellules K562 qui sont normalement inadmissibles à l’infection. VPR est structurellement intact réplication incompétent DENV particules virales qui codent un réplicon sub-génomique protéine fluorescente verte (GFP) qui s’exprime après un seul tour de réplication3. Ainsi, les cellules qui deviennent infectées par VPR réagissant en vert et peuvent être facilement détectés à l’aide de la cytométrie en flux ou la microscopie. La VPR utilisé dans cet essai ont été obtenues de sources commerciales. Ils peuvent, toutefois, être produites contre les autres virus et utilisés dans le test décrit dans ce manuscrit. Pendant ce temps, les cellules K562 sont une lignée de cellules leucémie FcγIII-exprimant le récepteur qui se lient à la région Fc des anticorps et s’infectent en présence de neutraliser des concentrations d’anticorps4,5.
ADE dosages ont été largement utilisés dans les études portant sur les facteurs de risque pour la dengue sévère et pour délimiter les mécanismes de in vitro ADE6,7,8. Le dosage de l’ADE décrit ici peut être utilisé rapidement et facilement pour déterminer la capacité du sérum pour améliorer l’infection in vitro à l’aide de VPR et cytométrie en flux, par rapport à d’autres tests utilisés actuellement, qui nécessitent soit la détermination de la formation de plaque unités (pfu) dans les cellules Vero ou souillure d’anticorps infecté les cellules6,7,8,9,10,11, qui sont tous deux beaucoup de temps et du travail intensif.
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Protocol
Les échantillons de sérum utilisés pour démontrer le protocole décrit ici proviennent de macaques rhésus qui étaient logés et pris en charge conformément à l’état local et fédérales politiques dans une Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC)-accrédités par facilité. Toutes les expériences animales ont été examinées et approuvées par animalier institutionnel et Comité de l’emploi et des échantillons ont été acquis par un protocole de partage des tissus.
1. jour 1
Remarque : Effectuez toutes les étapes décrites ci-dessous dans une armoire de biosafety stérile à flux laminaire utilisé pour culture de tissus dans un laboratoire BSL-2.
- Décongeler les échantillons de sérum à la température ambiante et transférer 100 µL de chaque échantillon de sérum dans un tube stérile. Chaleur inactive pendant 30 minutes à 56° C dans un bain d’eau ou une température réglable thermomixer. Faire 10 fois des dilutions de l’échantillon de sérum allant de 1:1 à 1 : 1 000 à l’aide de froid RPMI-10 (RPMI avec 10 % sérum de veau fœtal).
- Transférer 10 µL de l’échantillon de sérum dilué en série à chaque puits d’une plaque de fond en V 96 puits stérile. Comprend deux ensembles de puits de contrôle, RPMI-10 avec VPR seulement et sans échantillon de sérum et RPMI-10 seulement sans VPR et sans échantillon de sérum. Mettre en place chaque échantillon de sérum et RPMI-10 témoins en géométrie.
- Retirer la Dengue-1, 2, 3 et 4 VPR du congélateur-80 ° C et dégel dans un bain-marie à 37 ° C. Transférer la VPR dégelé immédiatement à la glace. Obtenir environ 170 µL VPR pour chaque échantillon de sérum (10 µL de VPR x 3 puits pour chaque dilution du sérum (1:1, 01:10, 1/100, 1 / 1 000) et 10 µL de VPR x 3 wells pour chacune des RPMI-10 avec RVP seulement contrôler les puits).
- Déposer 10µl de VPR dans chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits contenant l’échantillon de sérum et au RPMI-10 avec puits de contrôle VPR (pas de sérum). N’ajoutez pas de puits de VPR avec le RPMI-10 seulement (aucun échantillon de sérum et sans RVP). Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas 5 à 10 fois. Ajouter 10 µL de froid RPMI-10 au lieu de VPR à chaque froid RPMI-10 seulement (aucun échantillon de sérum et sans RVP) contrôle des puits.
- La plaque de fond en V 96 puits de transfert à un incubateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C en présence de 5 % de CO2. Alors que la plaque de fond en V 96 puits est en incubation, nettoyer la surface de la biosécurité armoire avec 70 % d’éthanol et exécuter les ultraviolets pendant 15 min.
- Sortir une fiole T75 entièrement confluente de cellules K562 de l’incubateur, mixer les cellules bien à l’aide d’une pipette stérile 5 mL et transférer 5 mL de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL.
Remarque : Les cellules K562 sont maintenus en milieu RPMI-10 et repiqués à 1 x 106/ml. - Compter le nombre de cellules en enlevant les 10 cellules µL du tube conique stérile de 15 mL et mélanger avec le bleu de tryphan 10 µL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules dans le tube conique de 15 mL.
- Centrifuger les 15 mL conique avec cellules à ~ 1 200 x g pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules chaudes RPMI-10 à une concentration de 80 000 cellules/30 µL de médias (2,66 x 106 cellules/ml).
- Retirez la plaque de fond en V 96 puits de l’incubateur (étape 1.6), de transférer 30 µL de cellules K562 dans chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits et mélanger soigneusement en pipettant également monter et descendre 5 à 10 fois. La plaque de fond en V 96 puits de transfert à un incubateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C en présence de 5 % de CO2.
- Après incubation pendant 1 h, enlever la plaque de fond en V 96 puits de l’incubateur et centrifuger à ~ 1 200 x g pendant 5 minutes. Après centrifugation, décantation des médias provenant des puits en tournant la plaque à l’envers dans un récipient contenant 10 % eau de Javel.
- Laver les cellules dans chaque puits par eux resuspendant dans 125 µL de RPMI-10 chaud, bien mélanger avec une pipette et centrifuger la plaque à ~ 1 200 g pendant 5 min. décanter les médias en tournant la plaque à l’envers dans un récipient contenant 10 % eau de Javel. Répétez cette étape de lavage deux fois.
- Après le lavage, ajouter 100 µL de chaud RPMI-10 à chacun se mélangent bien, Monte et descend avec la pipette et incuber la plaque pendant 48 h à 37 ° C en présence de 5 % de CO2.
2. jour 3
- Retirez la plaque de fond en V 96 puits contenant 100 µL de cellules et médias/puits de l’incubateur et déplacez-le dans une armoire de sécurité biologique. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélange le contenu de chaque bien et transférer les cellules et médias à 96 puits U fond sur plaque ou au préalable étiquetés tubes en polypropylène de 5 mL.
- Rincer chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits avec 100 µL de 1 % paraformaldéhyde (PFA) dans 1 x Saline tamponnée au Phosphate (PBS) et transfert vers les puits respectifs dans le 96 bien U-plaque ou marqués 5 mL tubes en polypropylène à l’étape 2.1 de céder une finale concentration de 0,5 % PFA/puits ou tube. Mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux, couvrir la plaque avec du papier aluminium et laisser reposer dans l’incubateur pendant 30 minutes pour fixer les cellules.
- Préparer le cytomètre de flux (voir Table des matières par exemple) en exécutant les cellules K562 incolores pour étalonner le côté et vers l’avant dispersion ainsi que les paramètres de fluorescence. Le canal de fluorescence seul requis est FL1, comme GFP est la seule fluorescence émise par les cellules. Acquisition de ~ 30, 000-50 000 cellules de chaque échantillon.
Remarque : Un cytomètre de flux capable de lire une fluorescence unique peut être utilisé pour l’acquisition des données, cellules infectées avec VPR seulement émet une fluorescence verte due à la présence de GFP, et aucun autre canal de fluorescence ne sont nécessaires.
3. analyse des données
-
Analyser les données acquises sur le cytomètre en flux à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir Table des matières).
- Ensemble le premier portail basé sur FSC-A (forward scatter – zone) vs FSC-H (forward scatter – hauteur) comprennent des cellules individuelles et exclure les doublets auto-fluorescent analyse12. Puis, la porte cellules bloquées singulet issus des SSC-A (diffusion latérale – zone) vs FSC-A exclure tout débris auto-fluorescente.
- Analyser les SSC-A vs FSC-A cellules fermées pour l’expression de la GFP basé sur SSC-A vs GFP-A. Déterminer le pourcentage de cellules GFP + pour chaque dilution des échantillons de sérum et de contrôle en définissant une barrière autour de GFP + cellules.
- Déterminer le pourcentage moyen de GFP + cellules pour chaque dilution des échantillons sériques et les puits de contrôle en divisant le pourcentage total de GFP + cellules dans les puits en triple par 3.
- Calculer pli-amélioration de l’infection en divisant le pourcentage moyen de GFP + cellules dans les échantillons de sérum pour chaque dilution divisé par le pourcentage moyen des cellules GFP + dans le RPMI-10 avec puits de contrôle VPR (aucun échantillon de sérum).
- Graphique de pli-perfectionnement (axe y) contre la dilution (axe x) et effectuer une analyse statistique en utilisant ANOVA suivie de test post hoc de Tukey à comparaisons multiples.
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Representative Results
Des sérums provenant de 4 rhésus macaques ont été recueillies à 16 semaines après l’infection avec ZIKV et testés pour leur potentiel d’amélioration DENV-1, 2, 3 et 4 infection dans les cellules K562. Les animaux avaient une virémie pic de ~ 1 x 105 copies de ZIKV RNA/mL de plasma par jour 3 après l’infection qui a diminué à des niveaux inférieurs à la limite de détection de 7 jours après l’infection. Aucun virémie a été détectée dans le plasma à l’infection après 16 semaines. Ensuite, le test RVP a été réalisé et les données recueillies ont été analysées, comme décrit dans le protocole ci-dessus.
La stratégie de blocage utilisée pour identifier les cellules GFP + sont indiquées à la Figure 1. Le portail initial a été fixé à exclure les doublets auto-fluorescente et comprennent seulement les cellules uniques basés sur FSC-A vs FSC-H. Le graphique suivant montre uniquement les cellules de la porte de la cellule ; là, une porte a été dessiné sur la base SSC-A vs FSC-A exclure tout débris auto-fluorescente. Ces gated cellules ont ensuite été affichés dans un troisième terrain basé sur SSC-A vs FL1-a pour identifier les cellules GFP +. Cellules infectées par VPR expriment GFP et le pourcentage de cellules GFP + a été déterminé en définissant une barrière autour de ces cellules. Environ 12,2 % des cellules GFP + sont détectables dans l’échantillon de sérum infecté ZIKV, comparativement à aucune cellule GFP + dans l’échantillon de contrôle. Cette stratégie de blocage est suivie pour chaque échantillon de sérum de dilution et de contrôle inclus dans l’essai.
Le pourcentage de cellules GFP + a été déterminé pour chaque dilution de l’échantillon et l’échantillon de contrôle tel que décrit ci-dessus (Figure 1). Données provenant d’un animal représentatif à l’aide de VPR DENV-1 sont indiquées à la Figure 2. Par rapport à aucun Sérum témoin qui avait des cellules GFP + 0,253 %, le pourcentage de cellules GFP + étaient 2,58 % dans l’échantillon non dilué, 12,8 % à 01:10, 0.735 % au 1/100 et 0,022 % à dilution de 1 : 1 000. Le pourcentage de cellules GFP + changera comme le sérum est dilué en raison des baisse des concentrations d’anticorps dans l’échantillon.
Comme l’amélioration de l’infection est associée à la concentration en anticorps qui est idéale pour augmenter l’absorption du virus, nous avons observé une augmentation spectaculaire du pourcentage de cellules GFP + à 01:10 dilution par rapport à soit non dilué de dilutions de l’échantillon ou autres, ce qui laisse supposer que l’échantillon non dilué avait des concentrations plus élevées d’anticorps alors que les dilutions au 1/100 et 1 : 1 000 ont des niveaux inférieurs d’anticorps qui n’était pas suffisante pour induire l’ADE de l’infection. Si les concentrations d’anticorps sont significativement élevées, puis autres dilutions du sérum devraient être incluses afin de déterminer la dilution où ADE devient apparente. Dans les échantillons de sérum, que nous avons étudié, nous avons observé ADE à une dilution de 01:10. En revanche, ADE peut-être être observé à des dilutions inférieures si la concentration d’anticorps dans le sérum est assez élevée.
Ensuite, nous avons calculé le pli-renforcement de l’infection en divisant le pourcentage moyen de GFP + cellules dans les puits en triple pour chaque dilution avec le pourcentage moyen de GFP + cellules dans les puits en triple pour aucun Sérum témoin. La cinétique de ADE contre DENV-1, 2, 3 et 4 sérotypes ont été déterminées en traçant la courbe pli-mise en valeur sur l’axe des ordonnées et sérum dilution sur l’axe des abscisses (Figure 3). Les données montre que le sérum prélevés à 16 semaines après l’infection sensiblement amélioré l’infection de cellules K562 DENV-1, 2, 3 et 4 sérotypes à une dilution de 01:10.
Figure 1 : Gating stratégie d’acquisition et d’analyse par cytométrie. Les cellules K562 infectés par DENV VPR expriment GFP qui a été analysé à l’aide d’un cytomètre en flux. (A) aucun Sérum témoin et (B) 16 semaines post-ZIKV n’infectés sérum. Les cellules ont été bloquées tout d’abord basé sur la zone de dispersion avant hauteur de forward scatter (FSC-A) vs (FSH-H) pour exclure les doublets suivis par un côté scatter (SSC-A) vs FSC-a pour exclure les débris. Le SSC-A vs FSC-A cellules fermées étaient alors dépendants basés sur SSC-A vs GFP-A (Fluorescence vert protéine-zone). Les ovales et les rectangles noirs représentent les portes, et les chiffres au-dessus des portes sont le pourcentage de cellules relevant de cette porte. La flèche noire entre les parcelles de FACS montre la séquence des portes utilisées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : parcelles représentant dot affichage de fréquence de DENV RVP + cellules. Le pourcentage de cellules K562 qui abritaient des VPR DENV-1 a été déterminé par cytométrie en flux. Sérum prélevé un macaque rhésus représentatif à 16 semaines après l’infection a été incubé avec VPR DENV-1 soit pur, soit à un 01:10, 1/100 et des dilutions de 1 : 1 000 et par rapport à aucun sérum de contrôle. Le pourcentage de cellules GFP + à chaque concentration de sérum est indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : amélioration significative de la Dengue-1, 2, 3 et 4 de l’infection est observée à 01:10 dilution de sérum. Amélioration dépendante anticorps d’infection par la Dengue a été étudiée pour les 4 sérotypes DENV par traçage dilutions de sérum sur l’axe des abscisses et pli-mise en valeur (par rapport à aucun contrôle d’échantillon de sérum) sur l’axe y. Sérums prélevés 4 macaques rhésus abri de ZIKV à 16 semaines après que l’infection a été utilisée dans cet essai. Barres d’erreur représentent erreur standard et * représente p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Flavivirus comme DENV et ZIKV partagent des preuves significatives d’homologie dans les deux leurs protéines structurales et non structurales qui produisent des anticorps qui réagissent avec l’autre13,14. Ces réponses anticorps une réaction croisée ont été démontrés pour améliorer d’infection aussi bien in vivo et in vitro avec un sérotype hétérologue ou autres associés flavivirus1,2. Le potentiel de croix renforcer l’infection a des implications importantes pour la gestion de la maladie et pour le développement de vaccins.
Tests fondés sur la culture traditionnelle utilisent des cellules non permissif qui sont infectés avec infectieuse DENV direct en présence de sérum. Amélioration de l’infection est mesurée en quantifiant la quantité de virus dans le surnageant à l’aide d' essais de plaque standard11. Ce test nécessite la culture du virus chez les deux lignées cellulaires et nécessite beaucoup de longues périodes de temps pour effectuer. En outre, pas toutes la DENV sérotypes plaque pareillement, ajout d’un autre niveau de complexité à ces tests.
Autres épreuves ont modifié le protocole d’essai de plaque de base pour mesurer les infection de lignées cellulaires en combinant une coloration intracellulaire pour DENV utilisant des anticorps fluorescent étiquetés et flow cytometry9,10,14. Même si cela réduit le temps nécessaire pour déterminer le niveau d’infection par rapport à la plaque de base dosages là sont un certain nombre d’étapes d’optimisation requis pour ces tests de travailler régulièrement. Protocoles de coloration intracellulaires prennent beaucoup de temps, car ils nécessitent de fixation et perméabiliser des cellules suivis par coloration intracellulaire et nécessitent bien titré DENV des anticorps spécifiques qui peuvent distinguer clairement chaque sérotype. En outre, ces tests ne prêtent pas facilement à un format haut débit et souffrent des niveaux élevés de la variabilité intra-essai.
Par contraste avec les dosages décrits ci-dessus, l’essai de VPR DENV basé est facile à mettre en place, n’utilise pas de virus infectieux et est très favorable à un débit élevé qui peut être facilement utilisé pour mesurer le potentiel de sérum d’augmenter l’infection. En outre, ce test n’est pas comme main-d'oeuvre comme les autres épreuves et peut être complété en 2 ou 3 jours, qui offre un avantage majeur sur les protocoles actuels de dosage ADE. Bien que l’essai décrit dans le manuscrit examiné la capacité du sérum ZIKV infecté d’augmenter l’infection du DENV-1, 2, 3 et 4 sérotypes, le dosage peut être facilement adapté pour examiner le sérum à la fois expérimentale et des échantillons cliniques obtient des autres infections par un flavivirus comme virus amaril (SVA), virus de l’encéphalite équine japonais (nadege) et virus du Nil occidental (VNO) si les VPR est disponibles et avec d’autres lignées cellulaires. Cependant, il est essentiel d’optimiser le dosage par titrage du volume de RVP, nombre de cellules/puits et la durée d’incubation pour permettre une coloration optimale des cellules sans coloration de fond.
Titrages doivent être effectuées en incubant un nombre défini de cellules cibles (par exemple, 80 000 cellules K562 ou une lignée cellulaire testée) avec des volumes variables de VPR (par exemple, 2,5 µL 5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 20 µL, etc.). Après avoir obtenu le titre correct pour chaque VPR, la durée d’incubation peut être déterminée en utilisant le titre obtenu ainsi que le nombre de cellules et incuber tel que décrit dans le protocole pendant une période variable (par exemple, 24h, 48 h 72 h, etc.).
Nous avons observé des ADE de l’infection par les 4 sérotypes du ministère de l’environnement à une dilution de 01:10, ce qui suggère qu’un taux d’anticorps dans le sérum devait être dilué 10 fois pour détecter la mise en valeur de l’infection. En revanche, d’autres études ont signalé mise en valeur à des dilutions inférieures, ce qui indiquerait que les concentrations d’anticorps dans l’échantillon de sérum risquaient trop élevé, qui ont besoin de dilutions inférieures à détecter ADE in vitro. ADE dépend de la bonne concentration d’anticorps dans l’échantillon de sérum, la plupart des échantillons sont susceptibles de présenter des ADE à des dilutions plus bas que le sérum non dilué.
En conclusion, le protocole décrit dans ce manuscrit est simple et facile à adopter et permet d’obtenir des données de haute qualité qui peuvent facilement être analysées pour intensifier pour permettre le criblage à haut débit d’un grand nombre d’échantillons dans une courte période de temps et interprétée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le projet décrit a été soutenu par des fonds de l’Uniformed Services University of the Health Sciences à JJM. Les opinions ou les affirmations contenues dans ce document sont celles des auteurs privés et ne sont pas pour être considéré comme officiels ou reflétant les vues du ministère de la défense, l’Uniformed Services University of the Health Sciences ou tout autre organisme des États-Unis Gouvernement.
WGV effectué toutes les expériences et analysé les données ; JJM conçu et supervisé l’étude ; WGW et JJM a écrit le livre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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