Summary
Biz enfeksiyon antikor bağımlı geliştirme tarafından Zika virüs nekahat serum dang virüs muhabir Viral parçacıkların kullanarak ölçmek için basit ve kolay bir iletişim kuralı tanımlamak.
Abstract
Antikor bağımlı geliştirme enfeksiyon Dang viral patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır göstermiştir. Antikorlar veya serum enfeksiyon söyleyebileceğin hücre hatlarında geliştirmek kapasitesini ölçmek geleneksel deneyleri üzerinde kullanarak viral çıkış plak deneyleri tarafından takip medya enfeksiyon ölçmek için güveniyorlar. Son zamanlarda, bu deneyleri dang virüs (DENV) enfeksiyonu fluorescently etiketli antikorları kullanarak hücre hatlarında inceledik. Her iki bu yaklaşım bu teknikler yaygın kullanımı kısıtlamak kısıtlamalar bulunmaktadır. Burada, biz yeşil flüoresan protein ve K562 hücreleri antikor bağımlı geliştirme (ADE) DENV enfeksiyon rhesus elde edilen serum kullanarak incelemek için hızlı dang virüs muhabir viral parçacıkların (RVPs) kullanarak bir basit vitro tahlil tarif maymunların Zika virüs (ZIKV) ile enfeksiyon sonra 16 hafta. Bu teknik güvenilirdir, hücreleri en az manipülasyonu içerir, canlı çoğaltma yetkili virüs kullanımı gerektirmez ve Akış Sitometresi kullanarak bir nicel okuma almak için yüksek işlem hacmi biçimde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu tahlil kolayca antikor bağımlı geliştirme (ADE) sarı humma virüsü (YFV), Japon Equine Ensefalit virüsü (JEEV), Batı Nil virüsü (WNV) burada RVPs kullanılabilir vb gibi diğer flavivirus enfeksiyonların incelemek için adapte edilebilir. Tahlil ayarlama kolaylığı, veri analizi ve sonuçları yorumlama çoğu laboratuvar ayarları için son derece uysal yapar.
Introduction
Antikor bağımlı geliştirme (ADE) enfeksiyon sayede virüs serotip tarafından indüklenen kısmen cross-reactive antikor yanıt artırır artan viral çoğaltma ve viremi yol virüs, başka bir serotip alımını bir süreçtir. ADE kapsamlı dang virüs (DENV) enfeksiyonları dört büyük serotipleri yaygın nerede belgelemiştir. Hastaların alt kümede, ADE Dang kanamalı ateşi (DHF) ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon DENV ADE içinde vitro neden oldu ve büyük olasılıkla DENV viremi vivo içinde1 iyileştirmesini katkıda DENV cross-reactive antikor yanıt düzeyi önemli ölçüde yüksek indüklenen göstermiştir , 2. antikor bağımlı geliştirme deneyleri vardır ilgili virüs ile ikincil enfeksiyon geliştirmek ve flavivirus enfeksiyonlarının patogenezinde içine değerli bilgiler sağlamak ve bilgilendirmek için antikorlar kapasitesini değerlendirmek için değerli bir araç aşıların geliştirilmesi.
Açıklanan tahlil DENV RVPs enfeksiyon için normalde söyleyebileceğin K562 hücreleri ile birlikte burada kullanır. RVPs tek bir çoğaltma3turdan sonra ifade edilir bir alt genomik yeşil flüoresan protein (GFP) replicon kodlamak yapısal olarak sağlam çoğaltma beceriksiz DENV viral parçacıkların vardır. Bu nedenle, RVPs ile enfekte olma hücreleri yeşil bulabilsem ve Akış Sitometresi veya mikroskobu kullanılarak kolayca algılanabilir. Bu tahlil kullanılan RVPs ticari kaynaklardan elde edilmiştir. Onlar ancak, olabilir diğer virüslere karşı oluşturulan ve bu el yazması açıklanan tahlil kullanılır. Bu arada, K562 hücreler antikorlar Fc bölgesine bağlamak ve alt antikor4,5konsantrasyonları nötralize huzurunda bulaşabilir bir FcγIII reseptör ifade lösemi hücre satırı vardır.
ADE deneyleri kapsamlı bir şekilde kullanıldığını şiddetli Dang ve vitro ADE mekanizmaları betimlemek için risk faktörleri araştıran çalışmalarda6,7,8. Burada açıklanan ADE tahlil vitro enfeksiyon RVPs kullanarak geliştirmek ve Akış Sitometresi ile karşılaştırıldığında ya gerektiren kullanılmakta, diğer deneyleri plak şekillendirme belirlenmesi için serum kapasitesini belirlemek için hızlı ve kolay kullanılabilir ikisi de zaman alıcı ve emek hücreleri6,7,8,9,10,11, birimleri (pfu) Vero hücreleri veya bir antikor boyama enfekte yoğun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan protokol göstermek için kullanılan serum numuneleri ilişki değerlendirme ve Akreditasyon laboratuvar hayvan bakımı için ev ve bakım için uygun olarak yerel, eyalet ve federal ilkelerinde edildi rhesus makak elde International (AAALAC)-akredite tesis. Tüm hayvan deneyleri gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve örnekleri paylaşım protokolü bir doku ile elde.
1. gün 1
Not: bir BSL-2 laboratuvar doku kültürü için kullanılan steril laminar akış Biyogüvenlik kabini içinde aşağıda açıklanan tüm adımları gerçekleştirin.
- Serum numuneleri, oda sıcaklığında erimek ve 100 µL serum örnekleri için steril bir tüp aktarın. Isı 30 dk 56° c su banyosu veya sıcaklığı ayarlanabilir bir thermomixer için devre dışı. 1:1-soğuk RPMI-%10 (10 fetal sığır serum ile RPMI) kullanarak 1:1,000 için arasında serum örneği 10 kat seri dilutions olun.
- Seri olarak seyreltilmiş serum örneği 10 µL steril bir 96-şey V-alt plaka her şey için transfer. Sadece ve serum örneği ve RPMI-10 sadece RVPs ve serum örneği olmadan olmadan denetim Wells, RPMI-10 RVPs ile iki kümeleri içerir. Her serum örneği ve triplicates RPMI-10 denetimleri ayarlayın.
- Dang-1, 2, 3 ve 4 RVPs-80 ° C dondurucu ve tezcan çıkarın 37 ° C su banyosu giriyordu. Hemen buz çözdürülen RVPs aktarın. Yaklaşık 170 µL RVPs her serum örneği için elde etmek (RVPs x 3 Wells her serum seyreltme için 10 µL (1:1, 1:10, 1: 100, 1:1, 000) ve RVPs x 3 Wells beher-in RPMI-10 RVP ile 10 µL sadece kuyu kontrolü).
- RVPs 10 µL her de serum örneği içeren 96-şey V-alt plaka ve RPMI-10 RVPs (serum) denetim wells ile içine pipet. RVPs RPMI-10 yalnızca için (hiçbir serum örneği ve hiçbir RVP) kuyuları eklemeyin. İyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından Mix 5-10 kat. 10 µL soğuk eklemek RPMI-10 RVPs soğuk her RPMI 10 yerine (hiçbir serum örneği ve hiçbir RVP) kuyu kontrol sadece.
- 96-şey V-alt plaka için bir kuluçka aktarmak ve plaka varlığında % 5 CO237 ° C'de 1 saat kuluçkaya. 96-şey V-alt plaka kuluçka iken, % 70 etanol ile kabine Biyogüvenlik yüzeyini temizlemek ve UV ışığı 15dk için çalıştırın.
- İyi bir steril 5 mL damlalıklı kullanarak hücreleri karıştırın ve hücre 5 mL steril 15 mL konik tüp transfer K562 hücrelerinin tamamen Konfluent bir T75 şişesi kuluçka makinesi çıkarın.
Not: K562 hücre RPMI-10 içinde muhafaza ve 1 x 106/mL subcultured. - Hücreleri steril 15 mL konik tüp sizden 10 µL hücreleri kaldırarak saymak ve 10 µL tryphan mavi ile karıştırın. 15 mL konik tüp hücrelerde toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- 15 mL konik ~ 1200 x g hücreleri ile 10 dakika santrifüj kapasitesi, süpernatant dikkatle boşaltmak ve sıcak RPMI-10 saat 80.000 hücreler/30 µL medya (2,66 106 hücre /mL x) bir konsantrasyon hücreleri resuspend.
- 96-şey V-alt plaka İnkübatör (Adım 1.6) kaldırmak, 96-şey V-alt plaka her şey için K562 hücre 30 µL aktarmak ve karıştırın iyice yukarı ve aşağı pipetting 5-10 kat. 96-şey V-alt plaka için bir kuluçka aktarmak ve plaka varlığında % 5 CO237 ° C'de 1 saat için kuluçkaya.
- 1s için kuluçka sonra 96-şey V-alt plaka kuluçka ve santrifüj ~ 1200 x g, 5 dakikalığına kaldırın. Santrifüjü sonra plaka % 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine baş aşağı çevirerek kuyuları medyadan dikkatle boşaltmak.
- Her şey hücrelerde 125 sıcak RPMI-10 µL içinde resuspending tarafından yıkama bir pipet ile iyice karıştırın ve ~ 1200 x g 5 dk. Decant medya için plaka plaka % 10 çamaşır suyu içeren bir kap içine baş aşağı çevirerek santrifüj kapasitesi. Bu yıkama iki kez tekrarlayın.
- Çamaşır sonra RPMI-10 her şey, damlalıklı ile yukarı ve aşağı karışımı sıcak 100 µL ekleyin ve %5 CO2huzurunda 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya.
2. gün 3
- 100 µL hücre ve medya/iyi kuluçka makinesi üzerinden içeren 96-şey V-alt plaka çıkarın ve bir biyogüvenlik kabini taşımak. Bir çok kanallı pipet, karışımı kullanarak içeriği her şey ve hücreleri transfer ve medyaya 96 iyi U-alt plaka veya 5 mL polipropilen borular için önceden etiketli.
- 96-şey V-alt plaka %1 100 µL ile her kuyuya durulama Paraformaldehyde (PFA) 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 96 de U-alt plaka veya etiketli 5 mL polipropilen borular içinde anılan sıraya göre wells transfer adım 2.1 bir son vermeye konsantrasyonu % 0,5 PFA/iyi veya tüp. İyice bir çok kanallı pipet kullanarak karıştırmak, alüminyum folyo ile plaka kapak ve kuluçka hücreleri düzeltmek 30 dakika boyunca oturmak izin.
- Akış Sitometresi ( Tablo reçetesi Örneğin bakınız) hazırlamak için yan ve floresan ayarların yanı sıra ileri dağılım kalibre günahı K562 hücreleri çalıştırarak. GFP hücrelerden yayılan tek Floresans sadece floresan kanal gerekli FL1, olduğu. Kazanmak ~ 30, 000 – 50.000 hücreleri her örnek.
Not: Herhangi bir Akış Sitometresi tek bir floresan okuma yeteneğine sahip olarak RVPs ile enfekte hücreleri sadece GFP varlığı nedeniyle yeşil Floresans yayarlar ve diğer bir floresan kanal ihtiyaç vardır veri alma için kullanılabilir.
3. veri analizi
-
Herhangi bir Akış Sitometresi Analizi yazılım kullanarak Akış Sitometresi alınan verileri analiz (tablo malzemeleri görmek).
- Küme ilk kapısı, vs FSC-tek hücre eklemek veya auto-floresan birini analiz12den çıkartmak için H (ileri dağılım-yükseklik) FSC-A (ileri dağılım üzerinde – alan) temel. O zaman, singlet Geçitli hücreler SSC-A göre kapı (yan dağılım-alan) vs FSC-A herhangi bir autofluorescent enkaz dışlamak için.
- SSC-A vs GFP ifade tabanlı için SSC-A vs FSC-A Geçitli hücreler analiz GFP-A. GFP + hücrelerin etrafında bir kapı ayarlayarak GFP + hücreler her seyreltme serum ve denetim örnekleri için yüzdesini belirlemek.
- 3 tarafından hücrelerinin toplam yüzdesi, GFP + onaylatılacak Wells bölerek GFP + hücreler her serum Numune dilüsyonu ve denetim wells için ortalama yüzdesini belirleyin.
- Kat-geliştirme enfeksiyon hücrelerinin GFP + serum numuneleri hücrelerinin GFP + RPMI-10 RVPs (serum örneği) denetim wells ile ortalama yüzde bölünen her seyreltme için ortalama yüzde bölerek hesaplayın.
- Kat-geliştirme (y ekseni) seyreltme karşı (x ekseni) grafik ve istatistiksel analiz Tukey'nın post-hoc testi birden çok karşılaştırmalar için ardından ANOVA kullanarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sera 4 rhesus makak ZIKV ile enfeksiyon sonra toplanan 16 hafta vardı ve potansiyellerini DENV-1 geliştirmek test üzerinden, 2, 3 ve 4 enfeksiyon K562 hücrelerdeki. Hayvanlar tepe viremi ~ 1 105 kopya ZIKV RNA/mL plazma x 7 gün sonra enfeksiyon tarafından algılamayı sınırın altındaki edildi düzeyleri reddetti enfeksiyon sonra 3 gün vardı. Hiçbir viremi 16 hafta sonrası enfeksiyon, plazma algılandı. O zaman, RVP tahlil gerçekleştirilmiş ve toplanan verilerin, yukarıdaki protokolünde açıklandığı gibi analiz edildi.
GFP + hücreleri tanımlamak için kullanılan gating strateji şekil 1' de gösterilmiştir. İlk kapısı autofluorescent birini dışlamak ve yalnızca tek hücreleri üzerinde FSC-A vs FSC-H. alarak dahil ayarlandı Sonraki çizim sadece hücreleri tek hücre kapısı gösterir; bir kapı çizilmiş temel alınarak SSC-A vs vardı FSC-A herhangi bir autofluorescent enkaz dışlamak için. Bunlar Geçitli hücreler sonra üçüncü bir komplo SSC-A vs dayalı olarak görüntülenen FL1-A GFP + hücreleri tanımlamak için. RVPs ile enfekte hücreleri GFP ifade ve bu hücrelerin etrafında bir kapı ayarlayarak GFP + hücre yüzdesi belirlenmiştir. GFP + hücre yaklaşık % 12.2 ZIKV enfekte serum örneğinde, hiçbir GFP + hücrelerde denetimi örneğini kıyasla saptanabilir. Bu perdeleme strateji tahlil dahil her serum seyreltme ve kontrol örneği için takip eder.
GFP + hücre yüzdesi her Numune dilüsyonu ve (şekil 1) açıklandığı gibi denetimi örneğini tespit edilmiştir. Veri DENV-1 RVPs kullanarak bir temsilci hayvandan Şekil 2' de gösterilmiştir. %0.253 GFP + hücre vardı hiçbir serum denetim örneği ile karşılaştırıldığında, GFP + hücre yüzdesi %2,58 su katılmamış örnek, 1:10 % 12.8, %0.735 1: 100 ve 1:1,000 seyreltme %0.022 vardı. Serum antikor örnek azalan konsantrasyonları nedeniyle seyreltilmiş olarak GFP + hücre yüzdesi değişecektir.
Geliştirme enfeksiyon virüs alımını artırmak idealdir antikor konsantrasyon ile ilişkili olduğu için biz 1:10 seyreltme ile karşılaştırıldığında ya örnek veya diğer dilutions su katılmamış GFP + hücre yüzdesi dramatik bir artış gözlenen, 1: 100 ve 1:1,000 dilutions ADE enfeksiyon ikna etmek için yeterli değildi antikor düzeyi düşük su katılmamış örnek antikor daha yüksek konsantrasyonlarda bulunuyordu olduğunu düşündüren. Antikor konsantrasyonları önemli ölçüde yüksekse, serum ek dilutions, ADE ortaya çıkıyor seyreltme belirlemek için dahil edilmelidir. Biz muayene serum örnekleri, 1:10 seyreltme ADE görülmektedir. Öte yandan, serum antikor konsantrasyonu çok yüksek ise ADE alt dilutions gözlenen.
Sonra biz kat-geliştirme enfeksiyon GFP + hücrelerde onaylatılacak kuyular her seyreltme için ortalama yüzde ortalama yüzde hücrelerinin GFP + serum kontrol için onaylatılacak Wells ile bölünerek hesaplanır. Kinetik, ADE karşı DENV-1, 2, 3 ve 4 serotipleri kat-geliştirme y ekseni ve serum seyreltme (şekil 3) x ekseni üzerinde grafik tarafından belirlenmiştir. Serum önemli ölçüde 16 hafta sonrası enfeksiyon toplanan verileri gösterir K562 hücreleri tarafından DENV-1, bir seyreltme 1:10, 2, 3 ve 4 serotipleri enfeksiyon gelişmiş.
Şekil 1: Akış Sitometresi tarafından alınıyor ve analiz için strateji geçişi. K562 hücre DENV RVPs ile enfekte bir Akış Sitometresi kullanılarak analiz GFP hızlı. (A) hiçbir serum denetim ve (B) 16 hafta post-ZIKV serum bulaşmış. Hücreleri ilk kapı ileri dağılım alana (FSC-A) vs ileri dağılım Yükseklik (FSH-H) takip birini dışlamak için bir yan dağılım (SSC-A) vs tarafından dayalı FSC-bir enkaz dışlamak için. SSC-A vs FSC-A Geçitli hücreler sonra SSC-A vs GFP-A (yeşil Floresans Protein-alan) göre kapı. Siyah dikdörtgenler ve ovaller kapıları, hem kapıları yukarıdaki sayılar içinde kapıyı düşen hücre yüzdesi olan. Siyah oku FACS araziler arasında kullanılan gates dizisini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: frekans in DENV RVP + hücre gösterilen temsilcisi nokta araziler. DENV-1 RVPs ile enfekte K562 hücre yüzdesi Akış Sitometresi tarafından tespit edilmiştir. Bir temsilci Rhesus makak 16 hafta sonrası enfeksiyon, toplanan serum DENV-1 RVPs su katılmamış veya 1:10, 1: 100 ve 1:1,000 dilutions ile inkübe ve serum denetim almıyoruz karşılaştırıldığında. GFP + hücreleri her konsantrasyonu serum yüzdesi gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: önemli enhancement Dang-1, 2, 3 ve 4 enfeksiyon gözlenen 1:10, serum seyreltme. Antikor bağımlı geliştirme Dang enfeksiyon için 4 DENV serotipi çizdirme serum dilutions x ekseni ve kat-geliştirme y ekseni (görece serum örnek denetim) tarafından incelenmiştir. Sera 16 hafta sonra enfeksiyon bu tahlil kullanıldı, 4 ZIKV bağışıklık rhesus makak toplanan. Hata çubukları temsil eden standart hata ve * p temsil eden < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flaviviruses DENV ve ZIKV gibi önemli kanıt homoloji birbirleri ile13,14cross-react antikor üreten her iki onların yapısal ve yapısal olmayan proteinlerde paylaşmak. Bu cross-reactive antikor yanıt-e doğru geliştirmek gösterilmiştir enfeksiyonu ile ilgili vivo içinde ve vitro Contegra serotip veya diğer flaviviruses1,2. Çapraz enfeksiyon geliştirmek için potansiyel hastalık yönetimi hem de aşı geliştirme için önemli etkileri vardır.
Geleneksel kültür dayalı deneyleri varlığında serum bulaşıcı canlı DENV ile bulaşmış keyfi olmayan hücreler kullanın. Enfeksiyon geliştirme standart plak deneyleri11kullanarak süpernatant virüs miktarı miktarının tarafından ölçülür. Bu tahlil kültür virüs iki hücre satırı gerektirir ve gerçekleştirmek için önemli ölçüde uzun süreler gerektirir. Ayrıca, tüm DENV plak aynı şekilde başka bir karmaşıklık düzeyini bu deneyleri için ekleme serotipleri.
Diğer deneyleri hücre içi fluorescently etiketli antikorları kullanarak DENV için boyama birleştirerek enfeksiyon hücre hatları ölçmek ve Akış Sitometresi9,10,14plak dayalı tahlil Protokolü değiştirdiniz. Bu enfeksiyon plak dayalı karşılaştırıldığında düzeyini belirlemek için gereken süreyi azaltır ama deneyleri orada bu deneyleri için tutarlı bir şekilde çalışması gerekli optimizasyonu adımları vardır. Onlar tamir ve permeabilizing hücrelerinin hücre içi boyama tarafından takip gerektirir ve her serotip açıkça ayırt edebilirsiniz iyi titrated DENV belirli antikor istemek gibi hücre içi boyama zaman alıcı, iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu deneyleri yüksek aktarım biçimine kolayca mükellef değildir ve içi-tahlil değişkenlik yüksek düzeylerinden acı.
Yukarıda açıklanan deneyleri, aksine DENV dayalı RVPs tahlil kurmak kolaydır, bulaşıcı virüs kullanmaz ve kolayca enfeksiyon geliştirmek için serum potansiyelini ölçmek için kullanılan yüksek işlem hacmi son derece müsait. Ayrıca, bu tahlil emek yoğun diğer deneyleri gibi konuşma ve 2-3 gün içinde geçerli ADE tahlil protokolleri üzerinde büyük bir avantaj sunan tamamlanabilir. El yazması açıklanan tahlil enfekte ZIKV serum kapasitesi / DENV-1, 2, enfeksiyon geliştirmek için muayene rağmen 3 ve 4 serotipleri, tahlil deneysel her iki serum incelemek için kolayca adapte edilebilir ve diğer klinik örnekleri elde Flavivirus enfeksiyonlar sarı humma virüsü (YFV), Japon Equine Ensefalit virüsü (JEEV) ve Batı Nil virüsü (RVPs yoksa WNV) gibi ve diğer hücre hatları ile. Bu, ancak, tahlil hacmi RVP, hücreler/iyi sayısı ve kuluçka süresi en iyi hücrelerinin arka plan boyama olmadan boyama izin vermek için titrating tarafından optimize etmek için önemlidir.
Titrations RVPs (örneğin, 2.5 µL, 5 µL, 7.5 µL, 10 µL, 20 µL, vb) değişken birimleri ile hedef hücreleri (örneğin, 80, 000 ' K562 hücreleri veya test edilen bir hücre kültürünü) sayıda kuluçka tarafından gerçekleştirilmesi gerekir. Her RVPs için doğru titresi alındıktan sonra kuluçka süresi elde edilen titresi tanımlanan hücreleri ile birlikte kullandığı ve onları protokolünde değişken bir süre (örneğin, 24 h, 48 h için açıklandığı gibi kuluçka belirlenebilir 72 h, vb).
Biz ADE enfeksiyon serum antikor düzeyleri 10 kat geliştirme enfeksiyon tespit etmek için seyreltilmiş gerektiğini düşündüren DENV 1:10, seyreltme, tüm 4 serotipleri tarafından gözlenen. Öte yandan, diğer çalışmalar geliştirme, antikor serum örneğinde konsantrasyonları çok yüksek, ADE vitroalgılamak için daha düşük dilutions ihtiyaç olasılığı olduğunu göstermek istiyorsunuz daha düşük dilutions bildirdi. Antikor serum örneğinde doğru konsantrasyon ADE bağlıdır gibi çoğu örnekleri ADE dilutions su katılmamış serum daha düşük göstermek muhtemeldir.
Sonuç olarak, bu el yazması açıklanan basit ve kolay benimsemeye, iletişim kuralıdır ve örnekleri bir kısa dönem süre içinde çok sayıda yüksek aktarım tarama etkinleştirmek için yükseltme kolayca çözümlenebilir yüksek kalitede veri vermeye olanak sağlar ve yorumlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Açıklanan proje JJM için Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü'nden fon tarafından desteklenmiştir. Görüş ya da burada yer alan iddialar yazarların özel olanları ve resmi veya yansıtıcı olarak görüşlerini Savunma Bakanlığı, Uniformed Hizmetleri Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü veya başka bir Ajansı ABD olmak yorumlanacaktır değildir Hükümet.
WGV tüm deneylerin gerçekleştirilen ve veri analiz; JJM tasarlamış ve çalışma denetlenir; WGW ve JJM kağıt yazdı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
