Summary
Descriviamo un protocollo semplice e facile per misurare il miglioramento dipendente dell'anticorpo dell'infezione di siero convalescente di Zika virus utilizzando le particelle virali di Reporter di virus della Dengue.
Abstract
Il potenziamento dipendente dell'anticorpo dell'infezione ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella patogenesi virale Dengue. Tradizionale analisi che misurano la capacità di anticorpi o siero per migliorare infezione nelle linee cellulari impermissible hanno fatto affidamento sull'utilizzo uscita virale nei media seguiti da saggi di placca per quantificare l'infezione. Più recentemente, queste analisi hanno esaminato l'infezione di febbre rompiossa virus (DENV) nelle linee cellulari usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati. Entrambi questi approcci presentano limitazioni che limitano l'uso molto diffuso di queste tecniche. Qui, descriviamo un'analisi semplice in vitro usando Dengue virus reporter particelle virali (RVP) che esprimono la proteina fluorescente verde e le cellule K562 per esaminare potenziamento dipendente dell'anticorpo (ADE) dell'infezione di DENV usando il siero che è stato ottenuto da rhesus macachi 16 settimane dopo l'infezione con il virus di Zika (ZIKV). Questa tecnica è affidabile, comporta la minima manipolazione delle cellule, non implicano l'uso di virus competente replica dal vivo e può essere eseguita in un formato di throughput elevato per ottenere una lettura quantitativa mediante citometria a flusso. Inoltre, questo test può essere facilmente adattato per esaminare aumento dipendente dell'anticorpo (ADE) di altre infezioni da flavivirus come il virus della febbre gialla (YFV), virus dell'encefalite equina giapponese (JEEV), virus del Nilo occidentale (WNV) ecc dove RVP sono disponibili. La facilità di configurazione di test, analisi dei dati e interpretazione dei risultati rende altamente favorevole alla maggior parte delle impostazioni di laboratorio.
Introduction
Anticorpo dipendente miglioramento (ADE) dell'infezione è un processo per cui le risposte parzialmente traversa-reattivo anticorpo indotte da un sierotipo del virus migliora l'assorbimento di un altro sierotipo del virus, che conduce la viremia e replicazione virale aumentata. ADE è stato ampiamente documentato nelle infezioni di Dengue virus (DENV) dove quattro principali sierotipi sono prevalenti. In un sottogruppo di pazienti, ADE è associata con febbre emorragica Dengue (DHF). Abbiamo recentemente dimostrato che l'infezione del virus (ZIKV) di Zika indotto significativamente elevati livelli di risposte di anticorpi cross-reattivi DENV causato ADE di DENV in vitro , che probabilmente ha contribuito alla valorizzazione di DENV viremia in vivo1 , 2. analisi dell'anticorpo dipendente di potenziamento sono uno strumento prezioso per valutare la capacità degli anticorpi per migliorare secondario infezione con virus collegati e offrire preziose comprensioni nella patogenesi delle infezioni da flavivirus e informare il sviluppo di vaccini.
Il test descritto qui usa DENV RVP insieme con le cellule K562 che sono normalmente inammissibile all'infezione. RVP sono strutturalmente intatto replica incompetente DENV particelle virali che codificano un replicone sub-genomica della proteina fluorescente verde (GFP) che è espresso dopo un singolo ciclo di replica3. Come tale, le cellule che infettano con RVP reagiscono in verde e possono essere facilmente individuate mediante citometria a flusso o microscopia. La RVP usato per questo test sono stati ottenuti da fonti commerciali. Tuttavia, possono essere generati contro altri virus e usato per il test descritto in questo manoscritto. Nel frattempo, le cellule K562 sono un'espressione FcγIII-linea cellulare di leucemia che si legano alla regione Fc degli anticorpi e infettarsi in presenza di Sub-neutralizzare le concentrazioni di anticorpi4,5.
Saggi di ADE sono stati ampiamente utilizzati negli studi che studiano i fattori di rischio per grave dengue e di delineare i meccanismi di in vitro ADE6,7,8. Il dosaggio di ADE descritto qui può essere rapidamente e facilmente utilizzato per determinare la capacità del siero per migliorare l'infezione in vitro utilizzando RVP e flusso cytometry, rispetto ad altri dosaggi utilizzati attualmente, che richiedono sia la determinazione della placca formando unità (pfu) in cellule Vero o macchiatura dell'anticorpo di infetti cellule6,7,8,9,10,11, entrambi i quali sono in termini di tempo e manodopera intensivo.
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Protocol
I campioni di siero utilizzati per illustrare il protocollo descritto qui sono stati ottenuti da macaques del reso che erano alloggiate e curate secondo locale, statale e federale politiche in un'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale (AAALAC)-accreditato facility. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali e i campioni sono stati acquisiti attraverso un protocollo di condivisione di tessuto.
1. giorno 1
Nota: Eseguire tutti i passaggi descritti di seguito in una flusso laminare sterile biosicurezza usata per coltura tissutale in un laboratorio BSL-2.
- Scongelare i campioni di siero a temperatura ambiente e trasferire 100 µ l di ciascun campione di siero in una provetta sterile. Inattivare con il calore a 56° C in un bagno d'acqua o un thermomixer regolabile in temperatura per 30 minuti. Effettuare diluizioni seriali 10 volte campione di siero che vanno da 1:1 a 1:1,000 utilizzando freddo RPMI-10 (RPMI con 10% siero bovino fetale).
- Trasferire 10 µ l di campione di siero diluito serialmente in ciascun pozzetto di una piastra di fondo V 96 pozzetti sterile. Sono due serie di pozzetti di controllo, RPMI-10 con RVP solo e senza campione di siero e RPMI-10 solo senza RVP e senza campione di siero. Impostare ogni campione di siero e RPMI-10 controlli in triplici copie.
- Rimuovere il Dengue-1, 2, 3 e 4 RVP da-80 ° C e scongelare loro in bagnomaria a 37 ° C. Trasferire il RVP scongelati immediatamente in ghiaccio. Ottenere RVP circa 170 µ l per ogni campione di siero (10 µ l di RVP x 3 pozzi per ogni diluizione del siero (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) e 10 µ l di RVP x 3 pozzi per ognuna delle RPMI-10 con RVP solo controllo pozzi).
- Pipettare 10 µ l di RVP in ciascun bene la piastra di fondo V 96 pozzetti contenenti il campione di siero e RPMI-10 con pozzetti di controllo RVP (nessun siero). Non aggiungere RVP RPMI-10 solo (nessun campione di siero e nessun RVP) pozzi. Mix accuratamente pipettando su e giù 5 – 10 volte. Aggiungere 10 µ l freddo RPMI-10 al posto di RVP per ogni freddo RPMI-10 soltanto pozzetti di controllo (nessun campione di siero e nessun RVP).
- Trasferire la piastra di fondo V 96 pozzetti per un'incubatrice e incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C in presenza di 5% CO2. Mentre la piastra a 96 pozzetti fondo V è in incubazione, pulire la superficie della cappa di biosicurezza con etanolo al 70% ed eseguire la luce UV per 15 min.
- Rimuovere un pallone T75 completamente confluente di cellule K562 dall'incubatrice, mescolare le celle anche utilizzando una pipetta sterile 5 mL e trasferire 5 mL di cellule in una provetta conica sterile 15 mL.
Nota: Le cellule K562 sono mantenute in RPMI-10 e una subcoltura a 1 x 106/ml. - Contare il numero di cellule rimuovendo 10 celle µ l dalla provetta conica sterile 15 mL e mescolare con il blu di tryphan 10 µ l. Contare le celle utilizzando un emocitometro per determinare il numero totale di cellule nella provetta conica da 15 mL.
- Centrifugare il 15 mL conica con cellule a ~ 1.200 x g per 10 minuti, decantare il supernatante e risospendere le cellule in caldo RPMI-10 ad una concentrazione di 80.000 cellule/30 µ l di media (2,66 x 106 cellule/ml).
- Rimuovere la piastra a 96 pozzetti fondo V dall'incubatrice (passo 1.6), trasferire 30 µ l di cellule K562 in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti fondo V e mescolare accuratamente pipettando su e giù 5 – 10 volte. Trasferire la piastra di fondo V 96 pozzetti per un'incubatrice e incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C in presenza di 5% CO2.
- Dopo incubazione per 1 h, è necessario rimuovere la piastra a 96 pozzetti fondo V dall'incubatore e centrifugare a ~ 1.200 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, decantare i media dai pozzetti ruotando la piastra capovolta in un contenitore contenente candeggina al 10%.
- Lavare le cellule in ogni pozzetto da loro risospendere in 125 µ l di RPMI-10 caldo, mescolare accuratamente con una pipetta e centrifugare la piastra a ~ 1.200 x g per 5 min, decantare i media girando la piastra capovolta in un contenitore contenente candeggina al 10%. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
- Dopo il lavaggio, aggiungere 100 µ l di caldo RPMI-10 a ciascuno mescolare bene, su e giù con la pipetta e incubare la piastra per 48 h a 37 ° C in presenza di 5% CO2.
2. giorno 3
- Rimuovere la piastra di fondo V 96 pozzetti contenenti 100 µ l di cellule e media/pozzetto dall'incubatrice e spostarlo in una cappa di biosicurezza. Usando una pipetta multicanale, miscela il contenuto di ogni bene e trasferire le cellule e media per un fondo U ben 96 piastra o per pre-etichettata provette in polipropilene da 5 mL.
- Sciacquare ciascun pozzetto della piastra di fondo V 96 pozzetti con 100 µ l di 1% paraformaldeide (PFA) 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS) e trasferimento ai rispettivi pozzetti in 96 ben U-fondo piatto o tubi in polipropilene da 5 mL con etichetta dal passaggio 2.1 per produrre una finale concentrazione dello 0,5% PFA/pozzetto o tubo. Mescolare accuratamente usando una pipetta multicanale, coprire la piastra con un foglio di alluminio e lasciarlo riposare nell'incubatrice per 30 minuti per fissare le cellule.
- Preparare il citometro a flusso (Vedi ad esempio la Tabella materiali ) eseguendo le cellule K562 non macchiate per calibrare il lato e forward scatter insieme alle impostazioni di fluorescenza. Il canale di fluorescenza solo richiesto è FL1, come GFP è l'unica fluorescenza emessa dalle cellule. Acquisire ~ 30, 000 – 50.000 cellule da ciascun campione.
Nota: Qualsiasi cytometer di flusso in grado di leggere una singola fluorescenza può essere utilizzato per l'acquisizione dei dati, come le cellule infettate con RVP solo emette fluorescenza verde per la presenza di GFP, e nessun altro canale di fluorescenza sono necessari.
3. analisi dei dati
-
Analizzare i dati acquisiti sul citofluorimetro utilizzando qualsiasi software di analisi di citometria a flusso (Vedi tabella materiali).
- Insieme al primo cancello basato su FSC-A (forward scatter – zona) vs FSC-H (forward scatter – altezza) per includere singole cellule ed escludere auto-fluorescente doppietti da analisi12. Quindi, cancello singoletto-gated celle basate su SSC-A (dispersione laterale – zona) vs FSC-A per escludere eventuali detriti autofluorescenti.
- Analizzare vs SSC-A cellule gated FSC-A per l'espressione della GFP basato su vs SSC-A GFP-A. Determinare la percentuale di cellule GFP + per ogni diluizione dei campioni del siero e controllo impostando un cancello intorno cellule GFP +.
- Determinare la percentuale media di cellule GFP + per ogni diluizione del campione di siero e pozzetti di controllo dividendo la percentuale totale di cellule GFP + nei pozzetti triplicate per 3.
- Piega-potenziamento dell'infezione viene calcolato dividendo la percentuale media di cellule GFP + nei campioni del siero per ogni diluizione diviso per la percentuale media di cellule GFP + in RPMI-10 con pozzetti di controllo RVP (nessun campione di siero).
- Piega-valorizzazione (asse y) del grafico contro diluizione (asse x) ed effettuare analisi statistiche, facendo uso di ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey per i confronti multipli.
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Representative Results
I sieri da 4 rhesus macaques erano raccolti a 16 settimane dopo l'infezione con ZIKV e testato per il loro potenziale migliorare DENV-1, 2, 3 e 4 infezione in cellule K562. Gli animali hanno avuti viremia di picco di ~ 1 x 105 copie di ZIKV RNA/mL di plasma dal giorno 3 dopo infezione che è sceso a livelli che erano sotto il limite di rilevazione di 7 giorni dopo l'infezione. No la viremia è stata rilevata nel plasma post-all'infezione 16 settimane. L'analisi RVP è stata eseguita, quindi i dati raccolti sono stati analizzati, come descritto nel protocollo di cui sopra.
La strategia di gating utilizzata per identificare le cellule GFP + sono mostrati nella Figura 1. La porta iniziale è stata impostata su autofluorescent doppietti di escludere e includere solo singole celle basate su FSC-A vs FSC-H. Il grafico successivo Mostra solo le celle dalla porta singola cella; lì, un cancello è stato disegnato sulla base SSC-A vs FSC-A per escludere eventuali detriti autofluorescenti. Questi gated cellule allora sono state visualizzate in una terza trama basata su SSC-A vs FL1-A identificare cellule GFP +. Le cellule infettate con RVP esprimono GFP e la percentuale di cellule GFP + è stata determinata impostando un cancello intorno a queste cellule. Circa il 12,2% di cellule GFP + sono rilevabili nel campione del siero infetto ZIKV, rispetto a nessun cellule GFP + del campione di controllo. Questa strategia di gating è seguita per ogni campione di siero diluizione e controllo incluso nell'analisi.
La percentuale di cellule GFP + è stata determinata per ogni diluizione del campione e il campione di controllo come descritto in precedenza (Figura 1). Dati da un animale rappresentativo utilizzando RVP DENV-1 sono mostrati in Figura 2. Rispetto a nessun campione del siero controllo che aveva cellule GFP + 0.253%, la percentuale di cellule GFP + erano 2,58% nel campione non diluito, 12,8% alle 01:10, 0,735% a 1: 100 e 0,022% 1:1,000 il fattore di diluizione. La percentuale di cellule GFP + cambierà come il siero viene diluito a causa delle concentrazioni decrescenti dell'anticorpo nel campione.
Come potenziamento dell'infezione è associato con la concentrazione di anticorpi è ideale per aumentare l'assorbimento del virus, abbiamo osservato un drammatico aumento della percentuale di cellule GFP + alle 01:10 diluizione rispetto ad uno non diluito diluizioni del campione o altri, suggerendo che il campione non diluito ha avuto le più alte concentrazioni di anticorpi mentre le diluizioni 1: 100 e 1:1,000 hanno avuti livelli più bassi dell'anticorpo che non era sufficiente per indurre ADE di infezione. Se le concentrazioni nell'anticorpo sono significativamente elevati, ulteriori diluizioni del siero dovrebbero essere incluse per determinare la diluizione in cui ADE diventa apparente. In campioni di siero che abbiamo esaminato, abbiamo osservato ADE ad una diluizione di 01:10. D'altra parte, ADE può essere osservati a diluizioni inferiori se la concentrazione di anticorpi nel siero è abbastanza alta.
Successivamente, abbiamo calcolato la piega-valorizzazione dell'infezione dividendo la percentuale media di cellule GFP + nei pozzetti triplice copia per ogni diluizione con la percentuale media di cellule GFP + nei pozzetti triplicate per nessun controllo del siero. La cinetica di ADE contro DENV-1, 2, 3 e 4 sierotipi sono stati determinati da rappresentare graficamente piega-potenziamento sulla diluizione del siero e dell'asse y sull'asse x (Figura 3). I dati mostrano che il siero raccolti a 16 settimane post infezione significativamente migliorato l'infezione delle cellule K562 da DENV-1, 2, 3 e 4 sierotipi ad una diluizione di 01:10.
Figura 1: Gating strategia per l'acquisizione e l'analisi di citometria a flusso. Cellule K562 infettate DENV RVP esprimono GFP che è stato analizzato utilizzando un citometro a flusso. (A) nessun controllo del siero e (B) 16 settimana post-ZIKV infettati del siero. Le cellule sono state prima gated basato su zona di forward scatter (FSC-A) vs forward scatter altezza (FSH-H) per escludere i doppietti seguite da un lato a dispersione (SSC-A) vs FSC-A escludere detriti. Il vs SSC-A FSC-A gated cellule era quindi gated basato su vs SSC-A GFP-A (fluorescenza verde proteina-zona). I rettangoli neri e ovali rappresentano i cancelli, e i numeri sopra le porte sono la percentuale di cellule che rientrano all'interno di quel cancello. La freccia nera tra le trame di FACS Mostra la sequenza delle porte utilizzate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentante dot appezzamenti risultati frequenza di DENV RVP + cellule. La percentuale delle cellule K562 che sono stati infettati con RVP DENV-1 è stata determinata tramite flusso cytometry. Siero raccolto da un macaco Rhesus rappresentanza alle 16 settimane post infezione è stato incubato con RVP DENV-1 o non diluito su un 01:10, 1: 100 e 1:1,000 diluizioni e confrontato ai campioni di controllo senza siero. Viene visualizzata la percentuale di cellule GFP + ad ogni concentrazione di siero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: potenziamento significativo della Dengue-1, 2, 3 e 4 infezione è osservato alle 01:10 diluizione del siero. Il potenziamento dipendente dell'anticorpo di infezione di febbre rompiossa è stato esaminato per i 4 sierotipi DENV da diluizioni del siero tracciato sull'asse x e piega-valorizzazione (rispetto a controlli a campione senza siero) sull'asse y. Sieri raccolti da 4 macachi rhesus immuni di ZIKV a 16 settimane dopo l'infezione è stato usato per questo test. Barre di errore rappresentano errore standard e * rappresenta p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Flavivirus come DENV e ZIKV condividere testimonianze significative di omologia in entrambe le loro proteine strutturali e non strutturali che generano gli anticorpi che cross-reagiscono con a vicenda13,14. Queste risposte di anticorpi cross-reattivi sono state indicate per migliorare di infezione sia in vivo che in vitro con un sierotipo eterologo o altro relativi flavivirus1,2. Il potenziale di croce migliorare infezione ha implicazioni significative per la gestione della malattia e anche per lo sviluppo di vaccini.
Saggi di cultura tradizionale basato utilizzano celle non permissivi che sono infettate con infettive DENV live in presenza del siero. Potenziamento dell'infezione è misurata quantificando la quantità di virus nel surnatante mediante placca standard saggi11. Questo test richiede cultura del virus in due linee cellulari e significativamente lunghi periodi di tempo per eseguire. Inoltre, non tutti la DENV sierotipi placca allo stesso modo, aggiungendo un ulteriore livello di complessità di queste analisi.
Altri saggi hanno modificato il protocollo di dosaggio di placca basata per misurare l'infezione delle linee cellulari combinando colorazione intracellulare per DENV usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati e flusso cytometry9,10,14. Anche se questo riduce il tempo necessario per determinare il livello di infezione rispetto alla placca di base di analisi ci sono un numero di passaggi di ottimizzazione necessari per queste analisi di lavorare costantemente. Protocolli di colorazione intracellulari sono richiede tempo, in quanto richiedono di fissaggio e permeabilizing delle cellule seguita da colorazione intracellulare e richiedono ben titolato DENV gli anticorpi specifici che possono chiaramente distinguere ciascun sierotipo. Inoltre, queste analisi non sono facilmente trattabili in un formato di throughput elevato e soffrono di alti livelli di variabilità intra-saggio.
In contrasto con i dosaggi descritti sopra, il dosaggio di DENV RVP base è facile da configurare, non utilizza virus contagioso ed è altamente suscettibile di throughput elevato che può essere facilmente utilizzato per misurare il potenziale del siero per migliorare l'infezione. Inoltre, questo test non è come lavoro intensivo come altri dosaggi e può essere completato entro 2-3 giorni, che offre un vantaggio importante sopra attuali protocolli di analisi di ADE. Anche se il test descritto nel manoscritto ha esaminato la capacità del siero ZIKV infettata per migliorare infezione DENV-1, 2, 3 e 4 sierotipi, il dosaggio può essere facilmente adattato per esaminare il siero da entrambi sperimentale e campioni clinici ottenuti dagli altri infezioni da flavivirus come virus della febbre gialla (YFV), virus dell'encefalite equina giapponese (JEEV) e virus del Nilo occidentale (WNV) se RVP sono disponibili e con altre linee cellulari. È, tuttavia, fondamentale per ottimizzare il dosaggio di titolazione il volume di RVP, numero di cellule per pozzetto e la durata dell'incubazione per consentire la marcatura ottimale delle cellule senza colorazione di fondo.
Titolazioni devono essere eseguite incubando un numero definito di cellule bersaglio (ad esempio cellule K562 80.000 o una linea cellulare in fase di test) con volumi variabili di RVP (ad esempio, 2,5 µ l, 5 µ l, 7,5 µ l, 10 µ l, 20 µ l, ecc.). Una volta ottenuto il titolo corretto per ogni RVP, la durata di incubazione può essere determinata utilizzando il titolo ottenuto insieme al numero definito di cellule e incubarle come descritto nel protocollo per periodi variabili di tempo (ad esempio, 24h, 48h h 72, ecc.).
Abbiamo osservato ADE di infezione di 4 tutti i sierotipi di DENV a una diluizione di 01:10, suggerendo che un livelli di anticorpi nel siero dovevano essere diluito 10 volte per rilevare la valorizzazione dell'infezione. D'altra parte, altri studi hanno riferito miglioramento alle diluizioni inferiori, che indicano che le concentrazioni di anticorpi nel campione del siero erano probabilmente troppo alta, che necessitano di diluizioni inferiori per rilevare ADE in vitro. Come ADE dipende la giusta concentrazione di anticorpi nel campione del siero, maggior parte dei campioni sono probabile mostrare ADE a diluizioni inferiori il siero non diluito.
In conclusione, il protocollo descritto in questo manoscritto è semplice e facile da adottare e permette per la scalabilità per attivare screening ad alta resa di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo periodo di produrre dati di alta qualità che possono essere facilmente analizzati e interpretato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il progetto descritto è stato sostenuto dalla Uniformed Services University Health Sciences a JJM. Le opinioni o le affermazioni contenute nel presente documento sono quelle private degli autori e non sono per essere interpretato come ufficiale o riflettenti le viste del dipartimento della difesa, la Uniformed Services University Health Sciences o qualsiasi altra agenzia degli Stati Uniti Governo.
WGV eseguito tutti gli esperimenti e analizzato i dati; JJM progettato e supervisionato lo studio; WGW e JJM ha scritto il libro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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