Summary
我们描述了一个简单和简单的协议, 以测量抗体依赖性增强感染的 Zika 病毒恢复血清使用登革热病毒报告病毒粒子。
Abstract
抗体依赖性增强感染已被证明在登革热病毒发病机制中发挥重要作用。传统的测定抗体或血清能力以增强不允许细胞系感染的方法, 依赖于在培养基中使用病毒输出, 然后用斑块化验来量化感染。最近, 这些化验已经检查了登革热病毒 (DENV) 感染的细胞系使用荧光标记抗体。这两种方法都限制了这些技术的广泛使用。在这里, 我们描述一个简单的体外试验, 使用登革病毒报告病毒微粒 (RVPs), 表达绿色荧光蛋白和 K562 细胞, 以检查抗体依赖性增强 (艾德) DENV 感染的血清, 从恒河猴获得猕猴感染 Zika 病毒后16周 (ZIKV)。这种技术是可靠的, 涉及对细胞的最小操纵, 不涉及使用活复制主管病毒, 并可以执行高吞吐量格式, 以获得定量读数使用流式细胞术。此外, 这种检测可以很容易地适应检查其他黄感染的抗体依赖增强 (艾德), 如黄热病病毒 (YFV), 日本马脑炎病毒 (JEEV), 西尼罗河病毒 (WNV) 等 RVPs 可用。建立测试、分析数据和解释结果的简便性使其对大多数实验室设置非常适合。
Introduction
抗体依赖性增强 (艾德) 感染是一个过程, 其中部分交叉反应抗体的反应, 由一个血清型的病毒增强吸收另一种血清型病毒, 导致增加病毒复制和病毒血症。艾德已广泛记录在登革热病毒 (DENV) 感染, 其中四主要血清型流行。在患者的一小部分, 艾德与登革热出血热 (DHF) 有关。我们最近表明, Zika 病毒 (ZIKV) 感染引起明显的 DENV 交叉反应抗体应答, 导致 DENV体外, 并可能有助于增强 DENV 病毒血症在体内 1,2. 抗体依赖性增强检测是评估抗体增强继发感染相关病毒能力的宝贵工具, 并为黄感染的发病机制提供有价值的见解, 并告知疫苗的研制。
这里描述的化验使用 DENV RVPs 和 K562 细胞通常不允许感染。RVPs 是结构上完整的复制不称职的 DENV 病毒粒子, 编码一个亚基因组绿色荧光蛋白 (GFP) 传代, 在一轮复制3后表示。因此, 感染 RVPs 的细胞荧光绿色, 可以通过流式细胞术或显微镜随时检测到。本试验中使用的 RVPs 是从商业来源获得的。但是, 它们可以生成针对其他病毒, 并用于本手稿中描述的化验。同时, K562 细胞是一种 FcγIII 受体表达的白血病细胞系, 与抗体 Fc 区结合, 并在抗体4,5的亚中和浓度存在时感染。
在调查严重登革热危险因素的研究中广泛使用了艾德测定法, 并描述了体外的机制6,7,8。在这里描述的艾德化验可以快速和容易地用来确定血清的能力, 以提高体外感染使用 RVPs 和流式细胞术, 与目前使用的其他化验相比, 这需要确定的斑块形成单位 (pfu) 在维罗细胞或抗体染色的感染细胞6,7,8,9,10,11, 这两个都是时间消耗和劳动力密集。
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Protocol
用于证明此处描述的议定书的血清样本取自恒河猴, 这些猕猴是根据当地、州和联邦政策在实验室动物护理评估和鉴定协会中所安置和照顾的。国际 (AAALAC) 认证的设施。所有动物实验都经过机构动物护理和使用委员会的审查和批准, 并通过组织分享协议获得样本。
1. 1 天
注: 执行下面描述的所有步骤, 在一个不育层流生物安全柜用于组织培养在 BSL-2 实验室。
- 在室温下解冻血清样品, 将每个血清样本的100µL 转移到无菌管。在56°C 中, 无论是在水浴中还是在温度可调的 thermomixer 中, 热灭活30分钟。使10倍的血清标本序列稀释从1:1 到 1:1, 000 使用冷 RPMI-10 (RPMI 与10% 胎牛血清)。
- 将10µL 的连续稀释血清样品转移到无菌96井 V 型底板的每一个井中。包括两套控制井, RPMI-10 只 RVPs, 无血清样本, RPMI-10 无 RVPs, 无血清标本。在 triplicates 中设置每个血清样本和 RPMI-10 控制。
- 从-80 °c 冰箱中取出 Dengue-1、2、3和 4 RVPs, 并在37摄氏度水浴中解冻。将解冻的 RVPs 立即转移到冰上。获得大约170µL RVPs 为每个血清样品 (10 µL RVPs x 3 井为每个血清稀释 (1:1, 1:10, 1:100, 1:1, 000) 和10µL RVPs x 3 井为每个 RPMI-10 与仅 RVP 控制井)。
- 吸管10µL RVPs 入96井 V 底板的每个井中, 含有血清样本, 并与 RVPs (无血清) 控制井 RPMI-10。请勿将 RVPs 添加到 RPMI-10 (无血清样本和 RVP) 井。通过吹打上下5–10时间彻底混合。添加10µL 冷 RPMI-10 代替 RVPs 每冷 RPMI-10 (无血清样本和无 RVP) 控制井。
- 将96井 V 型底板转移到孵化器中, 在 5% CO2的存在下, 在37摄氏度处孵化出1小时的板材。当96井 V 型底板正在孵化时, 用70% 乙醇清洁生物安全柜的表面, 并运行紫外光15分钟。
- 从孵化器中移除一个完全汇合的 T75 瓶 K562 细胞, 用不育的5毫升吸管混合细胞, 并将5毫升细胞转移到无菌15毫升锥形管。
注意: K562 细胞保持在 RPMI-10 和传代 1 x 106/毫升。 - 通过从无菌15毫升圆锥管中取出10µL 细胞, 并与10µL tryphan 蓝混合, 计算细胞数。使用 hemocytometer 计算单元格, 以确定15毫升圆锥管中的细胞总数。
- 离心机15毫升圆锥细胞在 ~ 1200 x g 10 分钟, 醒酒上清, 并并用重悬在温暖 RPMI-10 的细胞集中 8万 cells/30 µL 的媒体 (2.66 x10 6 细胞/毫升)。
- 从孵化器 (步骤 1.6) 卸下96井 V 型底板, 将30µL 的 K562 细胞转移到96井 V 底板的每一个井中, 并通过吹打上下5–10时间彻底混合。将96井 V 底板转移到孵化器, 并在 5% CO2的存在下, 在37摄氏度的情况下孵化出1小时的板材。
- 孵化1小时后, 从孵化器和离心机中取出96井 V 型底板, 在 1200 x g 处进行5分钟。离心后, 醒酒介质从井中翻转到一个装有10% 漂白剂的容器中。
- 通过在125µL 的温暖 RPMI-10 中 resuspending 它们, 将它们洗净, 并将其与吸管完全混合, 并将盘子在 1200 x 克上离心5分钟. 醒酒介质时, 将盘子翻转成含有10% 漂白剂的容器。重复这个洗涤步骤两次。
- 洗涤后, 添加100µL 的温暖 RPMI-10 的每一个井, 混合上下与吸管, 并孵化在37摄氏度48小时的板存在 5% CO2。
2. 3 天
- 从孵化器中取出含有100µL 细胞和介质的96井 V 型底板, 并将其移到生物安全柜中。使用多通道吸管, 混合每个井的内容, 并将细胞和介质转移到96井 U 型底板上, 或预先标记5毫升聚丙烯管。
- 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 用100µL 1% 多聚甲醛 (煤灰) 的96井 V 底板冲洗每一口井, 并将其转移到96井 U 型底板上的相应井中, 或从步骤5中标记为2.1 毫升聚丙烯管, 从而产生最终浓度为0.5% 粉煤灰/井或管。彻底混合使用多通道吸管, 用铝箔盖住盘子, 让它在孵化器里坐30分钟来修复细胞。
- 准备流式细胞仪 (例如, 请参见材料表), 方法是运行无瑕 K562 单元格来校准侧面和正向散射以及荧光设置。唯一需要的荧光通道是 FL1, 因为 GFP 是唯一从细胞中发出的荧光。从每个样品中获取 ~ 30,000–50,000 细胞。
注: 任何能够读取单个荧光的流式细胞仪都可用于获取数据, 因为感染 RVPs 的单元格只会由于 GFP 的存在而发出绿色荧光, 并且不需要其他荧光通道。
3. 数据分析
-
使用任何流式细胞仪分析软件 (见材料表) 分析在流动检测器上获取的数据。
- 设置第一个门基于 FSC-A (正散射–区域) vs FSC H (正向散射–高度), 以包括单个单元格, 并排除从分析12自动荧光双峰。然后, 基于 SSC (侧向散射-区域) 与 FSC a 的门单线态门控单元, 以排除任何 autofluorescent 碎片。
- 分析 ssc-a vs FSC-一个门控细胞的表达的 gfp 基于 SSC-a 与 gfp a。通过在 gfp + 单元格周围设置一个门, 确定 gfp + 细胞对每个稀释血清和控制样本的百分比。
- 通过将三人三井中 gfp + 细胞的总百分比除以 3, 确定每种血清样品稀释和控制井的 gfp + 细胞的平均百分比。
- 通过除以血清中 gfp + 细胞的平均百分比来计算感染的褶皱增强, 每个稀释除以 RPMI-10 中 gfp + 细胞的平均百分比与 RVPs (无血清样本) 控制井。
- 图形折叠增强 (y 轴) 与稀释 (x 轴), 并进行统计分析使用方差后, Tukey 的特殊测试的多比较。
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Representative Results
4只恒河猴的血清在感染 ZIKV 16 周后被采集, 并经过测试, 以增强 DENV-1、2、3和 4 K562 细胞感染的潜能。这些动物的峰值病毒血症为 1 x10 5 的 ZIKV RNA/毫升血浆在3天后, 感染后, 下降到低于检测限度的水平, 在感染后7天。16周后感染后, 血浆中未发现病毒血症。然后, 对 RVP 进行了分析, 并对所收集的数据进行了研究, 如上述协议所述。
用于标识 GFP + 单元格的浇口策略显示在图 1中。初始门被设置为排除 autofluorescent 双峰, 仅包括基于 fsc 的单个单元格-A 与 fsc H。下图只显示单个单元格门的单元格;在那里, 一扇门是基于 SSC-a vs FSC, 以排除任何 autofluorescent 碎片。这些门控细胞然后显示在第三个情节基础上的 SSC-vs FL1-A, 以确定 GFP + 细胞。细胞感染 RVPs 表达 gfp, 并通过设置一个门围绕这些细胞来确定 gfp + 细胞的百分比。在 ZIKV 感染的血清样本中, 大约12.2% 的 gfp + 细胞可以检测到, 与对照样品中没有 gfp + 细胞相比。这种门控策略是遵循每一个血清稀释和控制样本包括在化验。
为每个样本稀释和控制样本确定了 GFP + 单元格的百分比, 如上文所述 (图 1)。使用 DENV-1 RVPs 的具有代表性的动物的数据显示在图 2中。与无血清控制样本的 0.253% gfp + 细胞相比, gfp + 细胞的百分比是2.58% 在未稀释的样品, 12.8% 在 1:10, 0.735% 在 1:100, 0.022% 在 1:1, 000 稀释。随着血清中抗体浓度的降低, GFP + 细胞的比例将发生变化。
由于感染的增强与抗体浓度有关, 这是理想的提高病毒摄取量, 我们观察到, 与未稀释的样品或其他稀释相比, GFP + 细胞的百分比显著增加1:10 稀释,表明, 未稀释的样品有较高的抗体浓度, 而1:100 和 1:1, 000 稀释有较低的抗体水平, 这是不够的, 以诱导感染。如果抗体浓度明显高, 则应包括额外的血清稀释, 以确定艾德明显的稀释程度。在我们检查的血清样本中, 我们观察到了1:10 的稀释剂。另一方面, 如果血清中的抗体浓度相当高, 则可在下稀释观察到艾德。
接下来, 我们通过将三井中 gfp + 细胞的平均百分比除以三个三口井中的 gfp + 细胞的平均百分比, 以不进行血清控制, 来计算感染的褶皱增强。对 DENV-1、2、3和4型血清学的动力学进行了图解, 通过对 y 轴的褶皱增强和 x 轴上的血清稀释 (图 3) 来确定。数据显示, 16 周后感染的血清 DENV-1、2、3和4血清型在稀释1:10 时显著增强 K562 细胞感染。
图 1: 流式细胞仪获取和分析的浇口策略.K562 细胞感染的 DENV RVPs 快速 GFP, 分析使用流式细胞仪。(A)无血清控制和(B) 16 周后 ZIKV 感染血清。细胞是第一个门控基于前向散射区 (FSC a) vs 前向散射高度 (FSH H), 以排除双峰后面的一个侧面散射 (SSC a) vs FSC a 排除碎片。ssc-a vs FSC-一个门控细胞, 然后门控的基础上的 SSC-a vs GFP a (绿色荧光蛋白区)。黑色矩形和椭圆形代表了门, 而门上方的数字则是位于该门内的细胞百分比。操作图图之间的黑色箭头显示使用的门的顺序。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 显示 DENV RVP + 单元格频率的代表性点地块.用流式细胞仪测定了 DENV-1 RVPs 感染 K562 细胞的百分比。16周后, 从一只恒河猴中采集的血清感染后的 DENV-1 RVPs 未稀释或1:10、1:100、1:1、000稀释, 与无血清对照样品相比。荧光蛋白 + 细胞在每浓度血清中的百分比显示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在1:10 稀释血清中观察到 Dengue-1、2、3和4感染的显著增强.通过在 x 轴上绘制血清稀释, 并在 y 轴上进行褶皱增强 (相对于无血清样控制), 研究了 4 DENV 血清型对登革热感染的抗体依赖性增强。本试验采用感染后16周从 4 ZIKV 免疫恒河猴中采集的血清。误差线表示标准错误, * 表示 p < 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
Flaviviruses, 如 DENV 和 ZIKV, 在其结构和非结构蛋白中都有明显的同源性, 它们产生的抗体相互相互反应13,14。这些交叉反应抗体反应已被证明, 以增强感染的体内和体外与异种血清或其他相关 flaviviruses1,2。交叉增强感染的潜力对疾病的管理和疫苗的开发有着重要的影响。
传统的基于文化的化验方法是在血清存在的情况下使用不允许感染活 DENV 的细胞。通过使用标准斑块化验法对上清液中的病毒数量进行量化, 以提高感染的程度11。这种检测要求病毒在两个细胞线的培养, 需要很长的时间来执行。此外, 并非所有的 DENV 血清型斑块相同的方式, 增加了另一个层次的复杂性, 这些化验。
其他化验已经修改了基于斑块的检测协议, 以测量细胞株感染的 DENV 使用荧光标记抗体和流式细胞术9,10,14。尽管这减少了确定感染水平所需的时间, 但与基于斑块的化验结果相比, 这些化验所需的一些优化步骤始终如一地工作。细胞内染色协议耗时, 因为它们需要细胞的固定和 permeabilizing, 其次是胞内染色, 需要良好的滴定 DENV 特异抗体, 可以清楚地区分每个血清型。此外, 这些化验不能轻易地服从高通量格式, 并遭受高水平的检测内变异。
与上述的分析方法相比, DENV RVPs 的检测方法易于建立, 不使用传染性病毒, 而且高度适应高通量, 可以很容易地用于测量血清的电位来增强感染。此外, 这项化验不像其他化验一样劳动密集型, 并可以在 2-3 天内完成, 这提供了一个主要优势超过目前的艾德检测协议。虽然在手稿中描述的检测 ZIKV 感染血清的能力, 以提高 DENV-1, 2, 3 和4血清的感染, 该检测可以很容易地适应检查血清从实验和临床样品从其他黄感染, 如黄热病病毒 (YFV), 日本马脑炎病毒 (JEEV), 和西尼罗河病毒 (WNV), 如果 RVPs 可用, 并与其他细胞线。然而, 通过滴定 RVP 的体积、细胞数和孵化期, 使细胞在无背景染色的情况下进行最佳染色, 对实验进行优化是至关重要的。
滴定需要通过孵化已定义数量的目标单元 (例如, 8万个 K562 单元格或正在测试的单元格线) 来执行, 并具有可变卷的 RVPs (例如, 2.5 µL、5µL、7.5 µL、10µL、20µL、等等)。一旦获得了每个 RVPs 的正确的效价, 孵化的持续时间可以用获得的效度和所定义的细胞数来确定, 并按照协议中所描述的可变时间周期进行孵化 (例如, 24 小时, 48 小时、72 h、等)。
我们观察到4种血清 DENV 的感染, 稀释 1:10, 表明血清中的抗体水平需要稀释10倍, 以检测增强感染。另一方面, 其他研究报告说, 在下稀释加强, 这将表明血清中抗体的浓度可能过高, 需要较低的稀释, 以检测艾德在体外。由于艾德依赖于血清样本中抗体的正确浓度, 大多数样品可能显示艾德在稀释低于未稀释的血清。
总之, 本手稿中描述的协议简单易行, 允许在短时间内对大量样本进行高通量筛选, 从而产生高质量的数据, 可以很容易地分析和解释。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
所述项目得到了来自卫生科学制服服务大学的资金的支持, JJM。本文所载的意见或断言是作者的私人观点, 不应被解释为官方的, 也不反映国防部、卫生科学系制服服务大学或美国任何其他机构的意见。政府。
WGV 进行了所有实验, 并对数据进行了分析;JJM 设计和监督研究;WGW 和 JJM 写了这篇论文。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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