Summary
우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
감염의 항 체 의존 향상 뎅기열 바이러스 성 병 인에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 허용 되지 않는 세포에 감염을 강화 하기 위하여 항 체 또는 혈 청의 용량을 측정 하는 전통적인 분석 패 분석 실험에 의해 다음 미디어에 바이러스 출력을 사용 하 여 감염을 계량에 의존 했습니다. 더 최근에, 이러한 분석 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 셀 라인에서 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염을 검사 있다. 이러한 두 방법 모두 이러한 기술의 광범위 한 사용을 제한 하는 제한 사항이 있습니다. 여기, 우리가 설명 하는 간단한 체 외에서 분석 결과 사용 하 여 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자 (RVPs) 녹색 형광 성 단백질 및 항 체 의존 향상 (ADE) 붉은 털에서 얻은 혈 청을 사용 하 여 DENV 감염의 검사 K562 셀을 나타내는 원숭이 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 후 16 주. 이 기술은 신뢰할 수 있는, 포함 하는 셀의 최소한의 조작, 라이브 복제 유능한 바이러스의 사용을 포함 하지 않습니다 이며 cytometry 사용 하 여 양적 판독을 얻으려면 높은 처리량 형태로 수행할 수 있습니다. 또한이 분석 결과 항 체 의존 향상 (ADE) 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs를 사용할 수 있는 등 다른 flavivirus 감염의 검사에 쉽게 적응 될 수 있다. 분석 결과 설정의 용이성, 데이터를 분석 하 고 결과 해석 하면 높은 대부분의 실험실 설정 의무가 있습니다.
Introduction
감염의 항 체 의존 향상 (ADE) 그것에 의하여 부분적으로 cross-reactive 항 체 응답 바이러스의 serotype에 의해 유도 된 향상 증가 바이러스 성 복제 및 니 바이러스의 다른 serotype의 과정 이다. 에이드는 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 4 주요 serotypes는 유행에서 광범위 하 게 문서화 되었습니다. 환자의 하위 집합에서 ADE 뎅 그 열 출혈 성 열 (DHF)와 연결 됩니다. 우리는 최근에 Zika 바이러스 (ZIKV) 감염 에이드의 DENV 체 외 발생 가능성이 DENV 니 vivo에서1 의 향상에 기여 하는 DENV cross-reactive 항 체 응답의 상당히 높은 수준의 유도 나타났습니다. , 2. 항 체 의존 향상 분석 실험은 관련 바이러스 2 차 감염을 강화 flavivirus 감염의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하 고 알려주는 항 체의 능력을 평가 하는 유용한 도구는 백신의 개발입니다.
분석 결과 설명 여기 감염을 일반적으로 허용 하지 않은 K562 셀 함께 DENV RVPs를 사용 합니다. RVPs는 구조적으로 그대로 복제 무능 한 DENV 바이러스 성 입자를 복제3의 단일 라운드 후 표현 되는 하위 게놈 녹색 형광 단백질 (GFP) replicon 인코딩. 이와 같이, RVPs에 감염 되는 세포 형광 녹색 및 cytometry 또는 현미경을 사용 하 여 쉽게 감지가 가능. 이 분석 결과에서 사용 하는 RVPs 상용 소스 로부터 얻은 했다. 그러나 그들은,, 수 다른 바이러스에 대 한 생성 하 고이 원고에서 설명 하는 분석에 사용. 한편, K562 세포는 FcγIII 수용 체 표현 하는 백혈병 세포 선 항 체의 Fc 지역에 바인딩할 하 고 하위 중화 항 체4,5의 농도 존재 감염 될 있습니다.
에이드 분석 심한 뎅기열 및 생체 외에서 ADE의 메커니즘을 나타내는 위험 요인 조사 연구에서 광범위 하 게 사용 된6,,78. 여기에 설명 된 에이드 분석 결과 신속 하 고 쉽게 사용할 수 RVPs를 사용 하 여 체 외에서 감염을 강화 하 고 flow cytometry, 현재 사용 중 하나 필요로 하는 다른 분석에 비해 플 라크 형성의 결정에 대 한 혈 청의 용량을 확인 Vero 세포 또는 항 체의 얼룩에 (pfu) 단위 세포6,7,,89,10,11, 둘 다 시간이 소요 되며 노동 감염 집중.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명 된 프로토콜을 설명 하는 데 사용 하는 혈 청 샘플 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회에서 지 내게 및 지역, 주에 대 한 신경 및 연방 정책 이었던 붉은 털 원숭이에서 가져온 국제 (AAALAC)-시설 인가. 모든 동물 실험 했다 검토 하 고 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 샘플 공유 프로토콜 조직을 통해 인수 했다.
1. 주 1
참고: BSL-2 실험실에서 조직 문화에 사용 되는 살 균 층 류 biosafety 캐비닛에 아래 설명 된 모든 단계를 수행 합니다.
- 혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 무 균 튜브에 각 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송. 열 물 목욕 또는 온도 조정 가능한 thermomixer 56 ° C에서 30 분 동안 비활성화. 1:1,000 찬 RPMI-10 (10% 태아 둔감 한 혈 청와 RPMI)를 사용 하 여 1: 1에서 배열 하는 혈 청 샘플의 10 연속 희석을 확인 합니다.
- 살 균 96 잘 V-하단 플레이트의 각 음을 순차적으로 희석된 혈 청 샘플의 10 µ L를 전송 합니다. 고 하지 않고 혈 청 견본과 RPMI-10만 RVPs와 혈 청 샘플 없이 제어 웰 스, RVPs와 RPMI-10의 두 세트를 포함 합니다. 각 혈 청 샘플 및 triplicates RPMI-10 컨트롤을 설정 합니다.
- -80 ° C 냉동 및 해 동에서 뎅기열 1, 2, 3, 4 RVPs를 제거 37 ° C 물 목욕에서 그들. 해 동된 RVPs 얼음을 즉시 전송 합니다. 각 혈 청 샘플 약 170 µ L RVPs를 얻기 (각 혈 청 희석에 대 한 RVPs x 3 우물의 10 µ L (1:1, 1시 10분, 1: 100, 1:1, 000) 및 10 µ L 각 RVP와 RPMI-10 RVPs x 3 우물의 우물을 제어).
- 각 잘 96 잘 V-바닥판 혈 청 샘플을 포함 하 고 RVPs (혈 청) 제어 웰 스와 RPMI-10 RVPs의 10 µ L 플라스틱 RVPs RPMI-10만 (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 우물을 추가 하지 마십시오. 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 10 µ L 찬 추가 RPMI-10 대신 각 냉 RPMI-10 RVPs (아무 혈 청 샘플 및 아무 RVP) 제어 우물만.
- 인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 1 시간 동안 접시를 품 어. 96-잘 V-바닥판 잠복기 동안 biosafety 70% 에탄올과 캐비닛의 표면을 청소 하 고 15 분 동안 자외선을 실행 합니다.
- 인큐베이터에서 K562 셀의 완전 confluent T75 플라스 크를 제거 하 고 잘 사용 하 여 살 균 5 mL 피펫으로 세포를 섞어 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 5 mL을 전송.
참고: K562 셀 RPMI-10에서 유지 되며 1 x 106/mL에서 subcultured. - 살 균 15 mL 원뿔 튜브에서 10 µ L 세포를 제거 하 여 세포의 수를 계산 하 고 10 µ L tryphan 블루 믹스. 15 mL 원뿔 튜브에 세포의 총 수를 결정 하는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 15 mL 원뿔 세포 ~ 1200 x g에서 10 분간 원심, 상쾌한, 가만히 따르다와 미디어 (106 세포 /mL x 2.66)의 80, 000 셀/30 µ L의 농도에서 따뜻한 RPMI-10 셀 resuspend.
- 인큐베이터 (단계 1.6)에서 96 잘 V-바닥판을 제거, 96-잘 V-하단 플레이트의 각 잘 K562 셀 30 µ L 전송 및 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 5-10 시간. 인큐베이터에 96-잘 V-바닥판을 전송 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 1 시간에 대 한 접시를 품 어.
- 1 시간 배양 후 5 분 동안 인큐베이터와 ~ 1200 x g에서 원심 분리기에서 96 잘 V-바닥판을 제거 합니다. 원심, 후 거꾸로 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 접시를 켜서 우물에서 미디어를 가만히 따르다.
- 따뜻한 RPMI-10의 125 µ L에서 resuspending에 의해 각 잘에서 셀을 세척 하 고 피 펫, 철저 하 게 믹스 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에 거꾸로 접시 여 ~ 1200 x g 5 분 Decant 미디어에서 격판덮개 원심. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.
- 세척, 후 RPMI-10 각, 믹스를 위아래로 피펫으로, 따뜻한 100 µ L을 추가 하 고 5% CO2의 37 ° C에서 48 h에 대 한 접시를 품 어.
2. 주 3
- 96-잘 V-바닥판 포함 하는 셀의와 미디어/잘 인큐베이터에서 100 µ L을 제거 하 고 biosafety 캐비닛으로 이동. 멀티 채널 피 펫, 믹스를 사용 하 여 각각의 내용을 잘 셀을 전송 하 고 96 잘 U 아래 미디어 접시 또는에 미리 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 표시.
- 1%의 100 µ L 96 잘 V-하단 플레이트에 각 잘 린스 Paraformaldehyde (PFA) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 및 단계 2.1에서에서 96 잘 U-바닥판 또는 레이블된 5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 각각 웰 스 전송 최종 수익률 x 1 0.5%의 농도 PFA/잘 또는 튜브. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 믹스, 알루미늄 호 일, 플레이트 커버와 셀을 해결 하기 위해 30 분 동안 인큐베이터에 앉아 보자.
- 교류 cytometer 준비 (예를 들어 테이블의 자료 를 참조) 흠 없는 K562 셀 측면과 앞으로 분산형 형광 설정 함께 보정을 실행 하 여. 필요한 유일한 형광 채널은 FL1, GFP는 유일한 형광 세포에서 방출. 취득 ~ 30, 000-50000 각 샘플에서 세포.
참고: 단일 형광을 읽을 수 있는 모든 교류 cytometer로 셀 RVPs 감염 것입니다만, GFP의 존재 때문에 녹색 형광을 방출 하 고 다른 형광 채널 필요 데이터를 위해 사용할 수 있습니다.
3. 데이터 분석
-
어떤 흐름 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 교류 cytometer에서 수집한 데이터를 분석 (재료의 표 참조).
- 첫 번째 문 집합 기반으로 FSC-A (앞으로 분산형-지역) vs FSC-H (앞으로 분산형-높이) 단일 세포를 포함 분석12자동 형광 남자를 제외 하. 다음, SSC에 기반 내의 문이 셀 게이트 (사이드 분산형-지역) vs FSC-A 모든 autofluorescent 파편을 제외 하.
- GFP의 표현 SSC A 대 대 한 SSC A vs FSC-A 문이 세포 분석 GFP-. GFP + 셀 주위는 게이트를 설정 하 여 GFP + 혈 청 및 제어 샘플의 각 희석에 대 한 셀의 비율을 결정 합니다.
- 3 triplicate 우물에 GFP + 셀의 총 비율을 분할 하 여 각 혈 청 샘플 희석 및 제어 우물 GFP + 셀의 평균 비율을 결정 합니다.
- 감염의 배 향상 GFP + 셀 GFP + RVPs (혈 청 샘플) 제어 웰 스와 RPMI-10에서 셀의 평균 비율을 나눈 각 희석에 대 한 혈 청 샘플의 평균 비율을 나누어 계산 합니다.
- 희석 (x 축), 대 배 향상 (y 축) 그래프와 Tukey의 다중 비교에 대 한 게시물-특별 테스트 뒤 ANOVA를 사용 하 여 통계 분석을 수행.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4 붉은 털 원숭이 ZIKV 감염 후 수집 된 16 주 및 DENV-1을 향상 시키기 위해 그들의 잠재력에 대 한 테스트에서 세라, K562 셀에 2, 3, 4 감염. 동물 감염 후 7 일에 의해 탐지의 제한 된 수준에 거부 하는 감염 후 3 일 ~ 105 부 ZIKV 플라즈마의 RNA/mL의 x 1의 피크 니를 했다. 아니 니 16 주 후 감염에서 플라즈마에서 발견 되었다. 그리고, RVP 분석 결과 수행 위의 프로토콜에 설명 된 대로, 수집 된 데이터 분석 했다.
GFP + 셀을 식별 하는 데 사용 하는 제어 전략은 그림 1에 표시 됩니다. 초기 게이트 autofluorescent 남자를 제외 하 고 금감위 A vs FSC-헤에 따라 단일 셀 포함 설정 다음 플롯 표시; 단일 셀에서에서 셀만 거기, 게이트 했다 그려진된에 따라 SSC A vs FSC-A 모든 autofluorescent 파편을 제외 하. 이러한 문이 셀 다음 SSC A 대에 따라 세 번째 음모에 표시 했다 GFP + 셀을 식별 하기 위해 FL1-A. RVPs에 감염 된 세포 급행 GFP, 그리고 GFP + 셀의 비율 이러한 셀 주위는 게이트를 설정 하 여 결정 했다. GFP + 셀의 약 12.2 %ZIKV 감염된 혈 청 샘플 GFP + 셀 컨트롤 샘플에 비해 감지 않습니다. 이 제어 전략 분석 결과에 포함 된 각 혈 청 희석 및 제어 샘플 뒤에 있습니다.
각 샘플 희석 및 컨트롤 샘플 (그림 1) 위에서 설명한 대로 GFP + 셀의 비율 결정 했다. DENV-1 RVPs를 사용 하 여 대표적인 동물에서 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 아무 혈 청 제어 샘플을 0.253 %GFP + 셀에 비해 GFP + 셀의 비율 되었고 undiluted 샘플에 2.58%, 12.8 %1: 10에서, 0.735 %1: 100, 1:1,000 희석 0.022%. 혈 청 항 체 샘플에서의 감소 농도로 인해 희석 GFP + 셀의 비율이 변경 됩니다.
1:10 희석 하거나 비교 샘플 또는 기타 희석, undiluted GFP + 세포의 비율에 극적인 증가 관찰 감염의 향상은 바이러스의 증가 하는 항 체 농도와 관련, 제안 1: 100와 1:1,000 희석 에이드의 감염을 유발 하기에 충분 했다 항 체의 낮은 수준을 했다 반면 undiluted 샘플 항 체의 높은 농도 했다. 항 체 농도가 상당히 높은 경우에, 혈 청의 추가 희석은 에이드 드러납니다 희석 결정 포함 되어야 합니다. 우리가 검사 혈 청 샘플, 우리는 1:10 희석에 에이드 관찰. 다른 한편으로, 혈 청에서 항 체 농도 아주 높은 경우 ADE 낮은 희석에 관찰 될 수 있습니다.
다음, 우리는 아무 혈 청 제어용 triplicate 우물에 GFP + 셀의 평균 비율으로 각 희석에 대 한 triplicate 우물에 GFP + 셀의 평균 비율을 나누어 감염의 배 향상을 계산 합니다. 활동의 에이드에 대 한 DENV-1, 2, 3 및 4 serotypes 그래프 x 축 (그림 3)에 y 축과 혈 청 희석에 배 향상에 의해 결정 되었다. 데이터 표시는 혈 청에서 수집 된 16 주 게시물 감염 크게 향상 K562 셀 DENV-1, 2, 3, 4 serotypes 1:10 희석에의 감염.
그림 1: 취득 및 분석을 위한 전략 cytometry에 의해 게이팅. K562 셀 DENV RVPs 감염 익스프레스 GFP 교류 cytometer를 사용 하 여 분석 했다. (A) 혈 청 제어 및 (B) 16 주 게시물-ZIKV 혈 청 감염. 셀 측면 살포 (SSC-A) 대 여 앞으로 피해 지역 (FSC-A) vs 앞으로 분산형 높이 남자 뒤를 제외 (FSH H)에 따라 문이 먼저 했다 FSC-A 파편을 제외 하. SSC A vs FSC-A 문이 셀 다음 SSC A vs GFP-A (녹색 형광 단백질-지역)에 따라 문이 되었다. 검은 사각형 및 타원형 게이트, 나타내고 성문 위의 숫자는 그 게이트 내 셀의 비율. FACS 플롯 사이의 검은 화살표 게이츠 사용의 순서를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 주파수 DENV RVP +의 세포를 보여주는 대표적인 점 플롯. DENV-1 RVPs에 감염 된 K562 셀의 비율 cytometry에 의해 결정 되었다. 16 주 게시물 감염에서 대표적인 붉은 털 원숭이에서 수집 하는 혈 청 DENV-1 RVPs undiluted 또는 1시 10분, 1: 100, 1:1,000 희석에서 함께 알을 품 고 아무 혈 청 컨트롤 샘플에 비해. GFP + 혈 청의 각 농도에서 세포의 비율이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 3, 4 감염 1:10 관찰 뎅기열-1, 2의 중요 한 향상 혈 청의 희석. 뎅 그 열 감염의 항 체 의존 향상 4 DENV serotypes에 대 한 x 축과 y 축에 (아무 혈 청 샘플 컨트롤)을 기준으로 배 향상에 플로팅 혈 청 희석에 의해 시험 되었다. 세라 감염이 분석이 결과에 사용 된 후 16 주 4 ZIKV 면역 붉은 털 원숭이에서 수집. 오차 막대를 나타내는 표준 오차와 * p를 나타내는 < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DENV 및 ZIKV 같은 Flaviviruses 상 동13,14서로와 cross-react 항 체를 생성 하는 그들의 둘 다 구조와 비 구조 단백질의 중요 한 증거를 공유 합니다. 이러한 cross-reactive 항 체 응답을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다 감염의 vivo에서 그리고 생체 외에서 분리 serotype 또는 다른 관련 flaviviruses1,2. 교차 감염을 강화 하기 위하여 잠재적인 질병의 관리에 대 한 고도 백신 개발에 대 한 중요 한 의미를 갖는다.
전통 문화를 기반으로 분석 혈 청의 존재 감염 라이브 DENV로 감염 되는 비 허용 셀을 사용 합니다. 감염의 표준 패 분석 실험11를 사용 하 여 상쾌한에 바이러스의 양을 측정 하 여 측정 됩니다. 이 분석 결과 두 셀 라인에서 바이러스의 문화를 요구 하 고 수행 하기 위해 상당히 오랜 기간을 필요로 합니다. 또한, 모든 DENV serotypes 패 같은 방식으로, 이러한 분석에 복잡성의 또 다른 레벨을 추가.
다른 분석 실험 붙일 레이블된 항 체를 사용 하 여 DENV에 대 한 세포내 얼룩을 결합 하 여 세포의 감염을 측정 하 여 flow cytometry9,,1014패 기반 분석 결과 프로토콜을 수정 했습니다. 이 기반으로 하는 패에 비해 감염의 수준을 결정 하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있지만 거기 분석 최적화 단계 일관 되 게 작동 하도록 이러한 분석에 필요한 수 있습니다. 세포내 얼룩 프로토콜은 시간이 걸리고, 그들은 고정 하 고 셀의 permeabilizing 세포내 얼룩 뒤 필요 하 고 잘 적정 한 DENV 특정 항 체를 명확 하 게 각 serotype 차별 수 있습니다 필요 합니다. 또한, 이러한 분석 높은 처리량 형식으로 쉽게 순종 하 내부 분석 결과 다양성의 높은 수준에서 고통.
위의 설명된 분석 실험, 달리 DENV RVPs 기반 분석 결과 설정 하기 쉬운, 전염 성 바이러스를 사용 하지 않는 이며 매우 쉽게 감염을 강화 하기 위하여 혈 청의 잠재력을 측정 하기 위해 사용 될 수 있는 높은 처리량 의무가 있습니다. 또한이 분석 결과 다른 분석 실험으로 집중적인 노동 이며 완료 될 수 있다 2-3 일 이내 현재 에이드 분석 결과 프로토콜 주요 이점을 제공 합니다. 원고에 설명 된 시험 검사 DENV-1, 2의 감염을 강화 하기 위하여 ZIKV 감염 혈 청의 용량 3, 4 serotypes 분석 결과 두 실험에서 혈 청 검사를 쉽게 적응 시킬 수 있다 고 다른 얻은 임상 샘플 황열병 바이러스 (YFV), 일본 말 뇌염 바이러스 (JEEV), 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) RVPs 사용할 수 있는 경우 등 그리고 다른 셀 라인 flavivirus 감염. 그러나 그것은,, RVP, 셀/음, 그리고 부 화 기간 배경 얼룩 없이 셀의 최적의 얼룩 수 있도록 볼륨을 titrating 하 여 분석 결과 최적화 하기 위해 중요 한.
Titrations는 RVPs (예를 들어 2.5 µ L, 5 µ L, 7.5 µ L, 10 µ L, 20 µ L, 등)의 가변 볼륨으로 대상 셀 (예: 80000 K562 셀 또는 테스트 중인 셀 라인)의 정의 수를 배양 하 여 수행 해야 합니다. 셀의 정의 된 번호와 함께 얻은 titer를 사용 하 고 변수 기간 (예를 들어 24 시간, 48 h 프로토콜에 설명 된 대로 그들을 잠복기 인큐베이션 기간 각 RVPs에 대 한 올바른 titer 얻은 결정 될 수 있다 72 h, 등).
에이드 감염의 혈 청에서 항 체 수준 향상 감염의 감지를 10 배 희석 하는 데 필요한 제안 1:10 희석에 DENV의 모든 4 serotypes에 의해 관찰 합니다. 다른 한편으로, 다른 연구는 혈 청 샘플에서 항 체의 농도 이었다고 가능성이 너무 높은 에이드에서 생체 외에서검색 하기 위해 낮은 희석을 필요로 하는 것을 나타내는 것이 낮은 희석에 향상을 보고 하 고 있다. 에이드 항 체 혈 청 샘플에서의 오른쪽 농도에 따라 달라 집니다, 대부분 샘플 undiluted 혈 청 보다 낮은 희석에 에이드를 보여줄 가능성이 있다.
결론적으로,이 원고에 설명 된 프로토콜은 간단 하 고 쉽게 채택, 쉽게 분석 될 수 있는 높은 품질의 데이터를 짧은 기간 기간에서 샘플의 많은 수의 높은 처리량 검열 수 있도록 확장을 허용 하 고 해석.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
설명된 프로젝트 JJM에 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학에서 기금에 의해 지원 되었다. 의견이 나 주장을 여기에 포함 된 저자의 개인 그들 고 수 해석으로 공식 또는 반영의 플레이 국방부, 건강 과학의 Uniformed 서비스 대학 또는 미국의 다른 기관 정부입니다.
WGV 모든 실험을 수행 하 고 분석 데이터; JJM 설계 하 고 감독 연구; WGW와 JJM 종이 썼다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
