Summary
يمكننا وصف بروتوكول سهلة وبسيطة لقياس تعزيز جسم تعتمد الإصابة بواسطة Zika المصل النقاهة فيروس حمى الضنك فيروس "مراسل الجسيمات الفيروسية" باستخدام.
Abstract
لقد ثبت تعزيز الإصابة يتوقف جسم تلعب دوراً كبيرا في نشوء المرض حمى الضنك الفيروسية. الاختبارات التقليدية التي تقيس قدرة الأجسام المضادة أو مصل لتعزيز الإصابة في خطوط الخلايا غير مسموح به يعتمد على استخدام إخراج الفيروسية في وسائط الإعلام تليها اللوحة فحوصات لتحديد حجم الإصابة. في الآونة الأخيرة، قد درست هذه فحوصات الإصابة بالفيروسات (DENV) حمى الضنك في خطوط الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي. وقد كلا النهجين هذه القيود التي تحد من استخدام هذه التقنيات على نطاق واسع. وهنا، يمكننا وصف مقايسة بسيطة في المختبر استخدام حمى الضنك فيروس مراسل الفيروسية جسيمات (رفبس) التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء والخلايا K562 لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) الإصابة DENV استخدام مصل الدم التي تم الحصول عليها من ريسوس ماكاكويس 16 أسبوعا بعد الإصابة بفيروس زيكا (زيكف). هذا الأسلوب هو موثوق بها وينطوي على الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا ولا تنطوي على استخدام النسخ المتماثل يعيش فيروس المختصة ويمكن أن يؤديها في شكل إنتاجية عالية للحصول على قراءات كمية استخدام التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لفحص الأجسام المضادة تعتمد تعزيز (ADE) العدوى مصفر الأخرى مثل فيروس الحمى الصفراء (يفف)، فيروس "التهاب الدماغ الخيلي الياباني" (جيف)، فيروس غرب النيل (WNV) التي تتوفر فيها رفبس إلخ. سهولة إعداد التحليل، تحليل البيانات، وتفسير النتائج يجعل قابلية عالية لمعظم المختبرات إعدادات.
Introduction
جسم تعتمد تعزيز (ADE) العدوى هي عملية موجبة جسم جزئيا تحسن الاستجابات الناجمة عن النمط المصلي المسيطر فيروس يعزز الإقبال على النمط المصلي المسيطر آخر للفيروس، مما يؤدي إلى زيادة النسخ المتماثل الفيروسية وفريميا. تم توثيق ADE على نطاق واسع في حالات العدوى بالفيروس (DENV) حمى الضنك التي يكثر فيها اللقاح الرئيسية الأربعة. في مجموعة فرعية مرضى، يرتبط ADE بحمى الضنك النزفية (الدنك). ونحن قد أظهرت مؤخرا أن عدوى فيروس (زيكف) زيكا الناجمين عن مستويات مرتفعة إلى حد كبير من DENV جسم تحسن الاستجابات التي تسبب ADE DENV في المختبر والمرجح أن ساهمت في تعزيز DENV فيريميا في فيفو1 , 2-جسم تعزيز تعتمد فحوصات أداة قيمة لتقييم قدرة الأجسام المضادة تعزيز الثانوي عدوى الفيروسات ذات الصلة وتقدم أفكاراً قيمة في الآلية المرضية للالتهابات مصفر وتبلغ تطوير اللقاحات.
هنا يستخدم تحليل ووصف رفبس DENV جنبا إلى جنب مع خلايا K562 التي عادة غير مسموح به للإصابة. رفبس يتم النسخ المتماثل هيكلياً سليمة غير كفء DENV الفيروسية جزيئات ترميز ريبليكون بروتين sub-الجينوم فلورية خضراء (التجارة والنقل) التي يتم التعبير عنها بعد جولة واحدة من النسخ المتماثل3. على هذا النحو، الخلايا التي تصاب رفبس فلوريسسي الأخضر ويمكن الكشف سهولة استخدام التدفق الخلوي أو الفحص المجهري. رفبس المستخدمة في هذا التحليل تم الحصول عليها من مصادر تجارية. ومع ذلك، يمكن إنشاء مكافحة الفيروسات الأخرى والمستخدمة في التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة. ومن ناحية أخرى، هي خلايا K562 إلى التعبير عن مستقبلات FcγIII لوكيميا خلية خط ربط منطقة Fc من الأجسام المضادة، ويصاب حضور دون تحييد تركيزات من جسم4،5.
فحوصات ADE قد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات التحقيق في عوامل الخطر للضنك الشديد وتحديد آليات في المختبر ADE6،،من78. والرزن ADE الموصوفة هنا بسرعة وسهولة استخدامها لتحديد قدرة المصل زيادة الإصابة في المختبر باستخدام رفبس والتدفق الخلوي، بالمقارنة مع فحوصات أخرى تستخدم حاليا، التي تتطلب أما البت في تشكيل اللوحة الوحدات (بفو) في الخلايا فيرو أو تلطيخ جسم من إصابة الخلايا6،،من78،9،10،11، كلاهما مضيعة للوقت والعمل مكثفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات مصل الدم تستخدم للتدليل على البروتوكول الموصوفة هنا من macaques الريسوسي التي كانت السياسات الاتحادية ورعايتهم وفقا للدولة المحلية، ومساكن في اقتران للتقييم والاعتماد لرعاية الحيوانات المختبرية الدولية (آآلاك)-المعتمدة مرفق. جميع التجارب على الحيوانات تم استعراضها والموافقة عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية وعينات تم الحصول عليها من خلال أنسجة بروتوكول مشاركة.
1-يوم 1
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات الموضحة أدناه في السلامة الاندفاق الصفحي عقيمة خزانة تستخدم لزراعة الأنسجة في مختبر BSL-2.
- ذوبان الجليد عينات المصل في درجة حرارة الغرفة ونقل 100 ميليلتر من كل عينة مصل الدم إلى أنبوب عقيمة. إلغاء تنشيط الحرارة لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية في حمام مائي أو ثيرموميكسير قابل لضبط درجة حرارة. جعل تخفيف المسلسل إذ تتراوح بين 1:1 1:1,000 الباردة ربمي-10 (ربمي مع 10% مصل بقرى الجنين) باستخدام عينة المصل.
- نقل 10 ميكروليتر من عينة المصل المخفف متسلسل لكل بئر من صفيحة الخامس-أسفل 96-جيدا العقيمة. وتشمل مجموعتين من مراقبة الآبار، ربمي-10 مع رفبس فقط ودون عينة المصل، وربمي-10 فقط بدون رفبس ودون عينة المصل. قم بإعداد كل عينة المصل وضوابط ربمي-10 في تريبليكاتيس.
- إزالة الضنك-1، رفبس 2 و 3 و 4 من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية. نقل رفبس المذابة فورا الجليد. الحصول على رفبس ميليلتر 170 تقريبا لكل عينة المصل (10 ميليلتر من الآبار رفبس x 3 لكل تخفيف المصل (1:1، 01:10، 1: 100، 1:1، 000) و 10 ميليلتر من الآبار رفبس x 3 لكل ربمي-10 مع RVP فقط التحكم في الآبار).
- "الماصة؛" 10 ميليلتر من رفبس إلى كل من 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة تتضمن عينة المصل وإلى ربمي-10 مع رفبس (لا مصل) مراقبة الآبار. لا تقم بإضافة رفبس إلى ربمي-10 فقط (لا عينة المصل ولا RVP) الآبار. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 – 10 مرات. إضافة 10 ميليلتر الباردة ربمي-10 بدلاً من رفبس لكل 10-ربمي الباردة فقط (لا عينة المصل ولا RVP) التحكم في الآبار.
- نقل 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة إلى حاضنة واحتضان اللوحة ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2. بينما هو حضانة الخامس-أسفل لوحة 96-كذلك، تنظيف السطح للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% وتشغيل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 دقيقة.
- إزالة قارورة T75 المتلاقية تماما من الخلايا K562 من الحاضنة وخلط الخلايا أيضا استخدام بيبيت عقيمة 5 مل ونقل 5 مل خلايا إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل.
ملاحظة: الاحتفاظ في ربمي-10 خلايا K562 وسوبكولتوريد في/mL61 x 10. - حساب عدد الخلايا عن طريق إزالة 10 ميليلتر الخلايا من أنبوب مخروطي العقيمة 15 مل وتخلط مع 10 ميليلتر تريفان الأزرق. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في الأنبوب المخروطية 15 مل.
- الطرد المركزي 15 مل المخروطية مع الخلايا في ز x ~ 1,200 لمدة 10 دقائق، وصب المادة طافية، وريسوسبيند الخلايا في 10 ربمي الحارة بتركيز 80,000 الخلايا/30 ميليلتر من وسائل الإعلام (2.66 × 106 خلايا/mL).
- إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة من الحاضنة (الخطوة 1، 6) ونقل 30 ميليلتر من الخلايا K562 لكل بئر من 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 – 10 مرات. نقل 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة إلى حاضنة واحتضان اللوحة عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2.
- بعد حضانة ح 1، إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة من حاضنات وأجهزة الطرد المركزي في ز x ~ 1,200 لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي، صب وسائط الإعلام من الآبار عن طريق تحويل اللوحة رأسا إلى حاوية تحتوي على التبييض 10%.
- غسل الخلايا في كل بئر من خلال ريسوسبيندينج لهم في 125 ميليلتر من 10 ربمي الحارة ومزيج دقيق مع ماصة الطرد المركزي اللوحة في x ~ 1,200 ز 5 دقيقة صب وسائط الإعلام عن طريق تحويل اللوحة رأسا إلى حاوية تحتوي على التبييض 10%. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين.
- بعد الغسيل، إضافة 100 ميليلتر الحار ربمي-10 لكل مزيج جيدا، صعودا وهبوطاً مع بيبيت، واحتضان لوحة ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO2.
2-يوم 3
- إزالة 96-جيدا الخامس-أسفل لوحة تحتوي على 100 ميليلتر من الخلايا ووسائل الإعلام/جيدا من الحاضنة ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. استخدام الأقنية ماصة، مزيج محتويات كل جيدا ونقل الخلايا ووسائل الإعلام إلى 96 جيدا U-أسفل لوحة أو إلى المسمى قبل 5 مل أنابيب البولي بروبلين.
- أشطف كل بئر في الخامس-أسفل لوحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر من 1% بارافورمالدهيد (PFA) في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ونقل إلى الآبار كل منهما في 96 جيدا U-أسفل لوحة أو أنابيب البولي بروبلين المسمى 5 مل من الخطوة 2.1 الاستسلام نهائي تركيز من 0.5% PFA/بئر أو أنبوب. مزيج دقيق باستخدام ماصة الأقنية تغطية اللوحة مع رقائق الألومنيوم والسماح لها الجلوس في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إصلاح الخلايا.
- إعداد cytometer تدفق (انظر الجدول للمواد على سبيل المثال) عن طريق تشغيل أونستاينيد K562 الخلايا في معايرة الجانب ومبعثر إلى الأمام جنبا إلى جنب مع الإعدادات الأسفار. قناة fluorescence الوحيد المطلوب هو FL1، كالتجارة والنقل من الأسفار فقط المنبعثة من الخلايا. اكتساب ~ 30، 000 – 50,000 الخلايا من كل عينة.
ملاحظة: يمكن استخدام أي تدفق سيتوميتير قادر على قراءة صف واحد للحصول على البيانات، والخلايا المصابة مع رفبس فقط سوف تنبعث منها الفلورية الخضراء بسبب وجود بروتينات فلورية خضراء، وهناك حاجة إلى لا قناة أخرى من الأسفار.
3-بيانات التحليل
-
تحليل البيانات التي يحصل عليها من شأن cytometer التدفق باستخدام أي برنامج تحليل التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد).
- مجموعة البوابة الأولى استناداً إلى منتدى التعاون الأمني-أ (الأمام مبعثر – منطقة) مقابل منتدى التعاون الأمني-ح (المبعثر إلى الأمام – الارتفاع) تضمين الخلايا المفردة واستبعاد السيارات-فلوري doublets من تحليل12. ثم، بوابة الخلايا عن طريق بوابة القميص استناداً إلى التعاون بين بلدان الجنوب-أ (الجانب مبعثر – منطقة) مقابل منتدى التعاون الأمني-أ لاستبعاد أي حطام أوتوفلوريسسينت.
- تحليل SSC-أ مقابل منتدى التعاون الأمني ببوابات الخلايا للتعبير عن التجارة والنقل استناداً إلى مقابل SSC-أ بروتينات فلورية خضراء-ألف. تحديد النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا لتمييع كل من عينات المصل والتحكم بوضع بوابة حول التجارة والنقل + الخلايا.
- تحديد متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + خلايا لكل تمييع عينة المصل ومراقبة الآبار بقسمة إجمالي النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ثلاث آبار 3.
- حساب إضعاف-تعزيز الإصابة بقسمة متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في عينات مصلية لتمييع كل مقسوماً على متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ربمي-10 مع رفبس (لا عينة المصل) مراقبة الآبار.
- الرسم البياني إضعاف-تعزيز المحور (ص) مقابل إضعاف المحور (س)، وإجراء تحليل إحصائي استخدام ANOVA تليها اختبار توكي وظيفة مخصصة لمقارنات متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأمصال من 4 الريسوسي macaques تم جمعها 16 أسبوعا بعد الإصابة مع زيكف، واختبار لقدرتها على تعزيز DENV-1، 2 و 3 و 4 من العدوى في الخلايا K562. وكان الحيوانات ذروة فيريميا ~ 1 × 105 نسخ الحمض النووي الريبي زيكف/مل من البلازما يوم 3 بعد الإصابة التي انخفضت إلى المستويات التي كانت فيها الحد الأدنى للكشف قبل 7 أيام بعد الإصابة. تم الكشف عن لا فريميا في البلازما في 16 أسبوعا بعد الإصابة. ثم أجرى الفحص RVP وتم تحليل البيانات التي تم جمعها، كما هو موضح في البروتوكول أعلاه.
الاستراتيجية النابضة التي تستخدم للتعرف على بروتينات فلورية خضراء + الخلايا تظهر في الشكل 1. تم تعيين البوابة الأولى استبعاد دوبليتس أوتوفلوريسسينت وتشمل فقط الخلايا المفردة التي تستند إلى مقابل منتدى التعاون الأمني-ألف حاء--منتدى التعاون الأمني يظهر المؤامرة القادمة فقط الخلايا من بوابة وحيدة الخلية؛ هناك بوابة مقابل SSC-أ على أساس تعادل ألف منتدى التعاون الأمني لاستبعاد أي حطام أوتوفلوريسسينت. وهذه عن طريق بوابة ثم تم عرض الخلايا في مؤامرة ثالثة استناداً إلى مقابل SSC-أ FL1-أ التعرف على بروتينات فلورية خضراء + الخلايا. الخلايا المصابة مع رفبس التعبير عن التجارة والنقل، والنسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا يتحدد وضع بوابة حول هذه الخلايا. حوالي 12.2% من بروتينات فلورية خضراء + خلايا قابلة للاكتشاف في عينة مصل المصابين زيكف، بالمقارنة مع لا بروتينات فلورية خضراء + الخلايا في العينة التحكم. يتبع هذه الاستراتيجية النابضة لكل المصل تمييع والتحكم عينة شملت في المقايسة.
تم تحديد النسبة المئوية للتجارة والنقل + خلايا لكل تمييع عينة ونموذج عنصر التحكم كما هو موضح أعلاه (الشكل 1). وترد البيانات من حيوان ممثل استخدام "رفبس" DENV-1 في الشكل 2. بالمقارنة مع لا مصل مراقبة العينة التي قد 0.253% بروتينات فلورية خضراء + الخلايا، كانت النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا 12.8 في المائة في 01:10، 0.735% 1: 100، 2.58 في المائة في عينة غير مخفف و 0.022% في تخفيف 1:1,000. سيتم تغيير النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا كما هو المخفف المصل بسبب تناقص تركيزات الأجسام المضادة في العينة.
كما يرتبط تعزيز الإصابة مع تركيز الأجسام المضادة التي المثل الأعلى زيادة الإقبال على الفيروس، لاحظنا زيادة ملحوظة في النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في 01:10 إضعاف بالمقارنة مع أما مخفف تخفيف العينة أو غيرها، مما يوحي بأن العينة غير مخفف تركيزات أعلى من الأجسام المضادة حين تخفيف 1: 100 و 1:1,000 وكان انخفاض مستويات الأجسام المضادة التي لم تكن كافية لحمل ADE عدوى. إذا كان جسم تركيزات مرتفعة إلى حد كبير، ثم تخفيف إضافي للمصل ينبغي إدراج تحديد تمييع ADE الذي يصبح واضحا. في عينات المصل درسنا، لاحظنا ADE في إضعاف 01:10. من ناحية أخرى، يمكن ملاحظة ADE في تخفيف أقل إذا كان تركيز الأجسام المضادة في المصل مرتفع جداً.
بعد ذلك، حسبنا إضعاف-تعزيز الإصابة بقسمة متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ثلاث آبار لتمييع كل مع متوسط النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في ثلاث آبار للا مراقبة المصل. الحركية من ADE ضد DENV-1، 2، حددت اللقاح 3 و 4 بالرسوم البيانية تعزيز حظيرة في إضعاف المحور الصادي والمصل على المحور السيني (الشكل 3). تظهر البيانات أن المصل التي جمعت في 16 أسبوعا بعد الإصابة إلى حد كبير زيادة العدوى من الخلايا K562 من DENV-1، 2، 3 و 4 من اللقاح في إضعاف 01:10.
رقم 1: النابضة استراتيجية لاكتساب وتحليل بالتدفق الخلوي- K562 الخلايا المصابة مع رفبس DENV التعبير عن التجارة والنقل التي تم تحليلها باستخدام سيتوميتير تدفق. (أ) لا مراقبة المصل والأسبوع 16 (ب) وظيفة-زيكف المصابة المصل. كانت بوابات الخلايا أولاً استناداً إلى منطقة المبعثر إلى الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) مقابل المبعثر إلى الأمام ارتفاع (FSH-ح) باستبعاد doublets اتباعها جانب مبعثر (SSC-أ) مقابل منتدى التعاون الأمني-أ لاستبعاد الحطام. كانت بوابات مقابل SSC-أ منتدى التعاون الأمني ببوابات الخلايا ثم استناداً إلى SSC-أ مقابل التجارة والنقل-أ (الفلورية الخضراء البروتين-المنطقة). تمثل المستطيلات السوداء والأشكال البيضاوية البوابات، والأرقام أعلاه البوابات هي النسبة المئوية للخلايا التي تقع داخل هذه البوابة. السهم الأسود بين قطع نظام مراقبة الأصول الميدانية يبين تسلسل البوابات المستخدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: قطع دوت الممثل عرض التردد من DENV RVP + الخلايا. النسبة المئوية للخلايا K562 التي كانوا مصابين "رفبس" DENV-1 تحددها التدفق الخلوي. مصل الدم التي تم جمعها من المكاك الريسوسي ممثل في 16 أسبوعا بعد الإصابة المحتضنة مع "رفبس" DENV-1 أما غير مخفف أو من 01:10، 1: 100، وتخفيف 1:1,000 ومقارنة بأي عينات مراقبة المصل. ويبين النسبة المئوية للتجارة والنقل + الخلايا في تركيز كل من المصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: زيادة كبيرة في حمى الضنك-1، 2، يلاحظ الإصابة 3 و 4 في 01:10 إضعاف مصل. بحثت تعزيز جسم تعتمد الإصابة بحمى الضنك للقاح DENV 4 تخفيف المصل التآمر على المحور السيني وتعزيز حظيرة (بالنسبة للا ضوابط عينة المصل) على المحور الصادي. الأمصال التي جمعت من 4 macaques الريسوسي محصنة ضد زيكف في 16 أسبوعا بعد الإصابة واستخدمت في هذا التحليل. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري و * يمثل ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فلافيفيروسيس مثل DENV وزيكف حصة أدلة هامة على التماثل في كلا البروتينات الهيكلية وغير الهيكلية على توليد الأجسام المضادة التي كروسريكت13،14مع بعضها البعض. أظهرت هذه الردود جسم تحسن لتعزيز الإصابة في المختبر مع النمط المصلي المسيطر مغايرة أو أخرى سواء في فيفو المتصلة فلافيفيروسيس1،2. إمكانية عبر زيادة الإصابة بآثار هامة لإدارة المرض، وأيضا لتطوير اللقاحات.
فحوصات الثقافة التقليدية القائمة على استخدام الخلايا غير المتساهلة التي يصاب مع DENV الحية المعدية حضور المصل. ويقاس بقياس كمية الفيروس في المادة طافية باستخدام اللوحة القياسية فحوصات11تعزيز الإصابة. هذا التحليل يتطلب ثقافة فيروس في اثنين من خطوط الخلايا ويتطلب فترات طويلة إلى حد كبير من الوقت لأداء. بالإضافة إلى ذلك، ليست كل DENV اللقاح البلاك بنفس الطريقة، إضافة مستوى آخر من التعقيد لهذه الاختبارات.
فحوصات أخرى تعديل بروتوكول فحص اللوحة على أساس قياس عدوى خطوط الخلايا عن طريق الجمع بين تلطيخ داخل الخلايا ل DENV استخدام الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي والتدفق الخلوي9،،من1014. على الرغم من أن هذا يقلل من الوقت اللازم لتحديد مستوى الإصابة مقارنة باللوحة على أساس فحوصات هناك عدد من الخطوات الأمثل اللازم لهذه الاختبارات العمل باستمرار. بروتوكولات المصبوغة داخل الخلايا مضيعة للوقت، كما أنها تحتاج إلى إصلاح وبيرميبيليزينج من الخلايا متبوعة تلطيخ داخل الخلايا وتتطلب معاير جيدا DENV أجسام مضادة محددة يمكن أن تميز واضح كل النمط المصلي المسيطر. بالإضافة إلى ذلك، هذه فحوصات غير قابلة بسهولة إلى تنسيق عالية إنتاجية ويعانون من مستويات عالية من تقلب داخل المقايسة.
خلافا لفحوصات الموصوفة أعلاه، من السهل إعداد الإنزيم رفبس DENV على أساس ولا تستخدم الفيروسات المعدية وعالية قابلة للإنتاجية العالية التي يمكن استخدامها لقياس إمكانات المصل لتعزيز الإصابة بسهولة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الفحص ليس كعمالة مكثفة فحوصات أخرى، ويمكن أن تكتمل في غضون 2-3 أيام، مما يوفر ميزة كبيرة على بروتوكولات المقايسة ADE الحالية. على الرغم من أن التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة فحص قدرة المصل زيكف المصابة لتعزيز الإصابة DENV-1، 2، اللقاح 3 و 4، يمكن أن تكون المقايسة سهولة تكييفها لفحص المصل من كلا تجريبية والعينات السريرية التي تم الحصول عليها من الآخر التهابات مصفر مثل فيروس الحمى الصفراء (يفف)، وفيروس "التهاب الدماغ الخيلي الياباني" (جيف)، وفيروس غرب النيل (WNV) إذا كانت متوفرة رفبس، ومع خطوط الخلايا الأخرى. ومع ذلك، من الضروري بالشكل الأمثل في التحليل بالمعايرة حجم RVP وعدد الخلايا/جيدا، ومدة الحضانة للسماح لتلطيخ الأمثل للخلايا دون تلوين الخلفية.
المعايرة بحاجة إلى أن يؤديها في حضانة عدد محدد من الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال، 80,000 K562 الخلايا أو خط خلية التي يجري اختبارها) مع وحدات تخزين متغير من رفبس (على سبيل المثال، 2.5 ميليلتر 5 ميليلتر ميليلتر 7.5، 10 ميليلتر، 20 ميليلتر،، إلخ). حالما يتم الحصول على عيار الصحيح لكل رفبس، يمكن تحديد مدة الحضانة باستخدام عيار الحصول على جنبا إلى جنب مع عدد محدد من الخلايا وتفرخ لهم كما هو موضح في البروتوكول لفترات متغيرة من الوقت (على سبيل المثال، ح 24، ح 48 ، ح 72، إلخ).
لاحظنا ADE الإصابة باللقاح 4 جميع من DENV في إضعاف 01:10، مما يوحي بأن مستويات الأجسام المضادة في المصل بحاجة إلى أن تضعف 10 إضعاف للكشف عن تعزيز الإصابة. من ناحية أخرى، أفادت الدراسات الأخرى تعزيز في تخفيف السفلي، مما يدل على أن تركيزات الأجسام المضادة في العينة المصل من المحتمل مرتفعة للغاية، التي تحتاج إلى تخفيف السفلي لكشف ADE في المختبر. ADE يعتمد على تركيز الأجسام المضادة في العينة المصل الصحيح، من المحتمل أن تظهر ADE في تخفيف أقل من مصل غير مخفف معظم العينات.
وفي الختام، البروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة بسيطة وسهلة لاعتماد، ويسمح بالارتقاء إلى تمكين الفرز عالية الإنتاجية لعدد كبير من العينات في فترة زمنية قصيرة أن تسفر عن بيانات عالية الجودة التي يمكن تحليلها بسهولة و تفسير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد المشروع وصف الأموال من جامعة "العلوم الصحية" خدمات أونيفورميد لجيم. آراء أو التأكيدات الواردة في هذا التقرير هي تلك الخاصة المؤلفين ولا أن يكون تفسيرها كما الرسمية أو التي تعكس آراء وزارة الدفاع، وجامعة "العلوم الصحية" خدمات أونيفورميد أو أي وكالة أخرى تابعة للولايات المتحدة الحكومة.
وجف إجراء جميع التجارب، وتحليل البيانات؛ ججم صممت وأشرفت الدراسة؛ وكتب وجو وجيم الورق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
