Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

Abstract

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. טיפולים toxicant-induced פציעה קרניות הן בדרך כלל תומכת הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. ב המאמצים לפתח טיפולים ותרופות לטיפול בחשיפה, זה יכול להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים הסלולר המולקולריים של הפציעות. אנו מציעים כי ניצול תפוקה גבוהה קטן מעכבות ההקרנה RNA (siRNA) יכול להיות כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. siRNA הם כפול נטושים מולקולות RNA 19-25 נוקלאוטידים ארוך, לנצל את הגן post-transcriptional להשתיק מסלול ארוך mRNA אשר יש הומולוגיה ל siRNA. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. פיתוח, אימות של במבחנה חשיפה מודלים ושיטות תפוקה גבוהה הקרנת (HTS) של מימן פלואוריד-(HF) ו- chloropicrin-(CP) המושרה חבלה עינית מוצגים במאמר זה. למרות בחרנו אלה שני חשיפה לרעלים, השיטות שלנו חלים במחקר של חשיפה לרעלים אחרים עם שינויים מזעריים פרוטוקול החשיפה toxicant. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות וייצור IL-8 נבחרו נקודות קצה בפרוטוקול ההקרנה. מספר אתגרים הקשורים עם הפיתוח של חשיפה toxicant, שיטות התרבות תאים מתאימים ללימודי HTS מוצגים. הקמת HTS מודלים עבור חשיפה לרעלים אלו מאפשר מחקרים נוספים להבין טוב יותר את מנגנון הפגיעה, למסך הרפוי פוטנציאל כימי חבלה עינית.

Introduction

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. למרבה הצער, טיפולים toxicant-induced פציעה הקרנית רק תומכות באופן כללי כפי הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. אסטרטגיית הטיפול הנוכחי הוא לא ספציפית וכולל בעיקר אקטואלי טיפולים רפואיים כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, ואחריו cycloplegics דלקתיות (למשל, סטרואידים) פעם הקרנית יש מחדש epithelialized1 ,2. למרות האפשרויות הטובות ביותר הנוכחי טיפולית זמינה, הפרוגנוזה לטווח ארוך היא ירודה עקב ערפול הקרנית מתקדמת ו-2,כורוידאלית3.

מודלים בעלי חיים באופן מסורתי שימש לחקור רעילה ולהבין מנגנונים של פציעה. עם זאת, מחקרים שנעשו בבעלי חיים הם זמן רב ויקר. ישנם גם המאמצים לצמצום הניסויים בחיות. לדוגמה, להגיע חקיקה (EC 1907/2006) באיחוד האירופי כולל מגוון הוראות שנועדו להפחית את הניסויים בחיות. התנאים כוללים דרישה לחברות לשתף את הנתונים כדי למנוע חיות בדיקות וקבלת אישור מהסוכנות הכימיקלים האירופי לפני ביצוע בדיקות המוצע על בעלי חיים. לפי קביעותיה של יד, ניסויים בבעלי חיים צריך להיות המוצא האחרון. יש גם אירופה קוסמטיקה תקנה (EC 1223/2009) בהדרגה בדיקה של קוסמטיקה בבעלי חיים. כאשר נערכים מחקרים שנעשו בבעלי חיים, הם מונחים על ידי העקרונות של 3Rs (עידון, צמצום, והחלפת), המספקות מסגרת עבור ביצוע מחקר בבעלי חיים אנושית יותר, להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים ושימוש חלופות לניסויים בבעלי חיים במידת האפשר. מסיבות אלו, בתחום של הרעלים יש ביקשו לאמץ מבחני במבחנה יכולה לספק תובנות המנגנונים המולקולריים של רעילות, יכולה להיעשות תפוקה גבוהה4. זה גישה פונקציונלית הרעלים שבו חשיפה לרעלים מוגדרים על-ידי הפונקציה שלהם במקום אך ורק הכימיה שלהם. לקחו צעד נוסף, פונקציונלי toxicogenomics מבקשים להבין את תפקידים גנים ספציפיים לשחק את ההשפעות של חשיפה לרעלים5. עם היישום של טכנולוגיה siRNA, מסכי לחקור את פונקציית ג'ין מולקולרית, תאית התגובות חשיפה לרעלים יכול להיעשות על תפוקה גבוהה. siRNA הם כפול מולקולות RNA נטושים המהווים 19-25 נוקלאוטידים ארוך זה את היתרון של ג'ין תעתיק פוסט נוכח תאים בתרבית של כל6שתיקה מסלול. אלה הם לאכסון גרם, שנועדו למטרה גנים ספציפיים. כאשר הציג לתוך תא, siRNA מעובד, גדיל אחד, סטרנד מדריך, הוא נטען לתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC). SiRNA מנחה את RISC לאזור משלימים ב מולקולת mRNA, RISC מבזה את ה-mRNA. התוצאה היא הפחתת ביטוי גנים ספציפיים. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. גישה כזו שימש להבין עוד יותר את המנגנונים של רגישות ריצין ומעגל תלויי-אמפר לשעה של7,CYP1A18.

הרשימה הערכת הסיכון טרור כימי (CTRA), את הרישומים כימיקלים תעשייתיים רעילים (טיק) יש מפורטות כימיקלים בחירה המבוססת על שלהם רעילות ופוטנציאל להשתחרר במהלך טרור, לוחמה או אירוע תאונה תעשייתית9. אנחנו הם מיישמים תפוקה גבוהה של siRNA ההקרנה (HTS) toxicogenomic גישת המחקר של CTRA רשימה חשיפה לרעלים, אשר זוהו להיות בסיכון גבוה של שימוש באירוע טרור. טוקסיקולוגיה מסורתי החותר להבין את ההשפעות השליליות שיש כימיקלים על היצורים החיים; עם זאת, יש לנו שאיפה נוספת להבין את המנגנונים של פגיעה לצורך הסברה הפיתוח של הרפוי, גישות טיפוליות, וייתכן, כדי לגלות את מולקולות אשר ניתן לפלח לפיתוח טיפולית. את המאמץ הזה במובנים מסוימים עשויים להיחשב מקביל לשימוש של ההקרנה siRNA תפוקה גבוהה והתא המבוסס על מבחני תהליך הגילוי סמים10. ההבדל גדול יהיה שגילוי סמים בדרך כלל מחפש מטרה יחידה טיפולית גילוי ואילו בגישה שלנו זה במידת מה לא סביר שיהיה שם יעד יחיד עם ערך טיפולי רב לטיפול של חשיפה toxicant. אנו צופים כי כל פרדיגמה טיפול יעיל לחשיפה toxicant ידרוש גישה רב-תחומית כדי להשיג ערך טיפולי רב, toxicogenomic נתונים חיוני יכול לעדכן את הפרדיגמה של טיפול יעיל.

Benchtop אוטומציה מביא תפוקה גבוהה מתודולוגיה מעבדות בחוץ תעשיות פרמצבטיות או ביוטכנולוגיה. מחקרים במבחנה במכון שלנו היו מבחני מסורתי אשר תפוקה נמוכה11,12,13. בשנים האחרונות, המעבדה שלנו עברה לקביעת השימוש benchtop רובוטיקה לבצע סינון siRNA תפוקה גבוהה. במסמך זה, אנו מציגים את העידון של התא עינית מודלים ופיתוח של במבחנה שיטות חשיפה מימן פלואוריד (HF) ו chloropicrin (CP) מתאימה להקרנה siRNA תפוקה גבוהה. המטרה שלנו היא לזהות מולקולות המסדירים הסלולר פגיעה בתגובה חשיפה לרעלים אלו. המטרות של הספרייה siRNA בחרנו כוללים G-חלבון בשילוב קולטנים חלבונים kinases, פרוטאזות, phosphatases, תעלות יונים, מטרות נוספות שעשויות להיות druggable. HF ו- CP נבחרו למחקר נצליב CTRA רשימת סוכנים עם הדיווחים ToxNet של תאונות תעשייתיות כדי למצוא את אלה שמציגים הסיכון הגדול ביותר לפגיעה עינית באמצעות אדים חשיפה9,14. CP (כתיב כימי Cl3מפקדת2, מספר CAS 76-06-2) שימש במקור גז מדמיע ב מלחמת העולם הראשונה15. הוא משמש כיום וגם fumigant החקלאי של פונקציות כמו nematicide ', ' פטריות, חרקים16. מימן פלואוריד (HF) משמש בתהליכי כולל אלקילציה בתי זיקוק לנפט, fluorination אלקטרוכימי של תרכובות אורגניות17. HF (נוסחת הכימי HF, מספר CAS 62778-11-4) הוא גז אבל בצורתו מימית הוא חומצה הידרופלואורית (HFA, CAS מספר 7664-39-3). לכן, אנחנו נבחר להשתמש HFA בתא שלנו בתוך מודלים חשיפה. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות ו- the marker דלקתיות IL-8 נבחרו כמו נקודות הקצה כי מטרות המעורבים פציעה הסלולר אמורה להשתקף בשעת המוות התא ואת התגובה דלקתיות. באופן ספציפי, אם המטרה לשחק תפקיד מגן חשיפה toxicant, מוות של תאים ו/או ייצור ציטוקינים דלקתיים צריך להגדיל כאשר הביטוי היעד מעוכבת על ידי siRNA. ההפך יהיה נכון לגבי מטרות כי תפקיד שלילי. בנוסף, דלקת כרונית מופיע לשחק תפקיד בפתולוגיה הקרנית לאחר חשיפה, התערבות במשעולים מוות התא עשוי לשפר את התוצאה הקלינית2,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא תרבות תחזוקה

  1. לגדל את שורת התאים SV40-HCEC-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 90% לחות DMEM F-12 עם 15% סרום שור עוברית (FBS), 1%-גלוטמין, 10 µg/L גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו- 5 מ"ג/ליטר אינסולין.
  2. מעבר לקו תא כל 3-4 ימים (תלוי צפיפות זריעה) כדי להבטיח כי confluency אף פעם לא עולה 80% בזמן תחזוקה תרבות.
  3. ניתוק תאים מן המבחנות באמצעות ניתוק פתרון (14 מ ל פתרון עבור כל הבקבוק2 ס מ 150) הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ- 8 דקות.
  4. לנטרל את הפתרון ניתוק עם אמצעי אחסון שווה תא תרבות בינוני, גלולה התאים 50 מ ל צינורות חרוט על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 160 x g.
  5. מחדש להשעות בגדר תא בינוני (20 מ"ל עבור כל הבקבוק2 150 ס"מ).
  6. לספור את התאים עם מונה אוטומטי תא כף-יד, זרע במבחנות חדשות-צפיפות שיאפשר להם לגדול במשך 3 עד 4 ימים מבלי לחרוג confluency 80%.

2. צלחת תאים לניסויים

  1. בדוק צלוחיות של SV40-HCECs על ידי מיקרוסקופ אור ניגודיות שלב על מנת להבטיח את confluency נמצא במרחק של פחות מ- 80%, ולהעריך בריאות כללי.
  2. ניתוק, גלולה, resuspend, נחשב SV40-HCECs מן המבחנות כמתואר בצעדים 1.3 ל 1.6 של תחזוקה התרבות התא. השתמש בינוני SV40-HCEC המכילות הידרוקורטיזון 0.5 µg/mL (HCORT בינוני) כדי resuspend תאים.
  3. בבקבוק בינונית חד פעמית, להכין השעיה של SV40-HCECs-תאים למ"ל 17,857 בינוני HCORT מראש ומחוממת.
    1. להכין נפח מספיק של התא הבולם מספר הצלחות כדי להיות נזרע.
    2. זרע מינימום של 14 x 96-ובכן צלחות עם תאים עבור כל צלחת ספריית siRNA שילמדו.
  4. מערבולת מהבקבוק באופן שווה להשעות את התאים, שופכים את נפח מספיק של התליה תא לתוך מאגר על הקן תפקודי לב / נשימה של מטפל נוזלי אוטומטיות, ולאחסן את הבקבוק המכיל התליה תא על 37 ° C ההתחממות צלחת במהלך ציפוי תא תהליך.
  5. השתמש המטפל נוזלי אוטומטית כדי להוסיף תאים צלחות על צפיפות של תאים 1000 לכל טוב (5000 תאים/cm2) ב- µL 70 בינוני לכל טוב של צלחת 96-ובכן. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
    1. הפעל את תפקודי לב / נשימה-100 סל"ד ללא הרף במהלך תהליך זריעה.
    2. לערבב התליה תא שלוש פעמים (140 µL מיקס נפח) בעזרת המטפל נוזלי אוטומטית.
    3. האחות µL 140 של התליה תא, לוותר על 70 µL לתוך כל טוב של שתי צלחות התרבות תאים.
    4. חזור על שלבים הנגן 2.5.3 ו 2.5.4 עד כל הצלחות יש כבר נזרע עם תאים.
    5. מילוי מחדש המאגר התליה תא לפי הצורך במהלך תהליך זריעה.
  6. אחרי יש כבר נזרע את הצלחות, להסיר אותם מן המטפל נוזלי אוטומטיות, דגירה אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני העברת אותם במדגרה תרבות התא.
  7. הערכת הצפיפות התא של כל טוב על כל צלחת למחרת באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית אשר ממוקם בבניין של חממה תרבות תא ולהשמיט לצלחות מן המחקר אשר להם בארות פנים שאינם בין 15% ל- 22% confluent.

3. transfect את התאים עם siRNA

  1. לרכוש siRNA צלחות ספריית מהספק מוגדרת מראש להכיל מטרות siRNA 80 לכל צלחת (ראה איור 4), עם עמודות 1 ו-12 נשאר ריק.
  2. לשקם siRNA ספריית לצלחת עם מאגר siRNA כדי ריכוז סופי של pmol/µL 2 עבור כל טוב של siRNA לפי הוראות היצרן19.
  3. Transfect התאים 24 שעות לאחר זריעה ועם 4 pmol/טוב של siRNA µL 0.3/טוב של ריאגנט תרביות תאים. לבצע את כל השלבים לפי הפרוטוקול של היצרן ריאגנט תרביות תאים (ראה איור 4 לפריסה צלחת)20.
    1. לבצע את כל transfections באמצעות מטפל נוזלי אוטומטיות ולאחר שימוש של 25 µL/s מהירות pipetting עבור כל השלבים. השתמש בתיבות קצה מוגדרות מראש כדי לטפל רק הבארות להיות transfected.
    2. השתמש העליון חצי צלחת הספריה כדי transfect סט של שש צלחות שכפל המכונה "טופ צלחת ערכת" (שש משכפל לכל siRNA, n = 6).
    3. להשתמש בתחתית חצי צלחת הספריה כדי transfect קבוצה שונה של שש צלחות שכפל המכונה "בתחתית צלחת ערכת" (שש משכפל לכל siRNA, n = 6).
    4. משתמשים במונח "צלחת מלאה קבע" כדי לתאר את הצלחות תא 12 זה יש כבר transfected עם ספריית siRNA.
    5. Transfect וולס B2-B6 של כל לוחות קבע צלחת מלאה עם בריכה שלילי siRNA לאחר כל הערכות צלחת העליון והתחתון יש כבר transfected עם ספריית siRNA.
    6. גם transfect בארות B2-B6 של עוד שתי צלחות, אינם מקבלים siRNA ספריה, ישמש הפקדים סמויה (אחד עבור ערכת הפלטה) ואחד עבור ערכת צלחת התחתון, עם בריכה שלילי siRNA.
  4. תקופת דגירה כל תא הצלחות בחממה התרבות תאים של 4 שעות לאחר כל תרביות תאים mixes נוספו ושילוב מאת עדין הקשה בכל שעה.
  5. שימוש מטפל נוזלי אוטומטית כדי לשטוף את כל בארות של צלחות פעמיים עם מדיום HCORT מראש ומחוממת מדולל 1:5 ב- PBS. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
    1. האחות µL 100 מכל קידוח ולמחוק את זה לתוך מאגר פסולת.
    2. להוסיף מכל טוב 100 µL/קידוח בינוני HCORT מראש ומחוממת מדולל PBS ב 1:5 אשר מכילה מאגר שונים-נפח מספיק של מספר הצלחות.
    3. חזור על הצעדים 3.5.1 ו 3.5.2 כל צלחת.
      1. רוקן המאגר פסולת כנדרש.
      2. מילוי המאגר HCORT בינונית מדולל 1:5 ב- PBS כנדרש.
    4. האחות µL 100 מכל קידוח ולמחוק את זה לתוך המאגר פסולת.
  6. Refeed כל בארות של הצלחות עם 100 µL/טוב מראש ומחוממת HCORT בינוני, אשר מכילה מאגר שונים בווליום די בינוני למשך מספר הצלחות.
    1. מילוי מחדש המאגר בינונית כנדרש.
  7. השתמש בארות C2 C6 של כל לוחות כפקדי שאינם transfected.
  8. לשמור בארות B7-B11 C7-C11 של כל לוחות שאינם transfected כדי לשמש כפקדי הרכב והסמים לחשיפה toxicant.

4. refeed התאים הבאות יום

  1. השתמש מטפל נוזלי אוטומטית כדי refeed כל בארות של הלוחות. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
    1. האחות µL 100 מכל קידוח ולמחוק את זה לתוך מאגר פסולת.
    2. Refeed כל טוב עם 100 µL/טוב מראש ומחוממת HCORT בינונית מכילה מאגר שונים והוא בעל נפח מספיק של בינוני למשך מספר הצלחות כדי להיות refed.
    3. חזור על שלבים 4.1.1 ו 4.1.2 כנדרש, כדי refeed כל תא הצלחות.
      1. רוקן המאגר פסולת כנדרש.
      2. מילוי מחדש המאגר בינונית כנדרש.

5. לשלוט תוספת

  1. יומיים לאחר תרביות תאים, שעתיים לפני החשיפה, להכין פתרון מיקרומטר 62.5 של cardamonin לשלוט במדיום HCORT כדי לשמש עבור חשיפות HFA ולהוסיף שורה B של מאגר דילול 8-שורה.
    1. חשיפה CP, להכין ולהשתמש פתרון מיקרומטר 25 של SKF 86002.
    2. להכין אמצעי שליטה חיובית מספיק עבור מספר צלחות להיבדק.
  2. להכין פתרון 0.625% של דימתיל סולפוקסיד במדיום HCORT (בקרת הרכב) ולהוסיף השורה C של המאגר אותו.
    1. חשיפה CP, להכין ולהשתמש פתרון 0.5% של דימתיל סולפוקסיד.
    2. להכין אמצעי השליטה הרכב מספיק עבור מספר צלחות להיבדק.
  3. השתמש המטפל נוזלי אוטומטי כדי להוסיף פקדים חיובי והרכב בארות B7-B11 ו C7-C11 של כל צלחת תא ולהשתמש pipetting µL/s 50 מהירות עבור כל השלבים. השתמש בתיבות קצה מוגדרות מראש כדי לטפל רק הבארות אשר יקבל את הפקדים חיובי והרכב.
    1. להסיר µL 10 בינוני מבארות B7-B11 ו C7-C11 של כל צלחת תא וזורקים אותו לשורות G ו- H של המאגר 8-שורה דילול.
    2. להעביר 10 µL של הפקדים חיובי והרכב מאותן בארות ומערבבים 3 פעמים.
  4. לחזור הלוחיות תא החממה.
  5. חזור על השלבים 5.3 ל 5.4 עד כל הצלחות תא קיבלו חיובי ופקדים הרכב.

6. HF חשיפה של תאים בתרבית

התראה: HFA הוא מאכל רעילים בחריפות.

  1. לבצע את כל הפעולות לכימיקלים בשכונה fume כימי לובש זוגי nitrile כפפות, מעיל מעבדה, מגיני שרוול פוליאתילן חד פעמיות, בטיחות משקפיים.
    1. רוכשים HFA כפתרון 48%.
    2. לדלל HFA 1% במים הנדסה גנטית ולאחסן ב 5 מ ל aliquots ב- 10 מ"ל הקיר עבה פוליאתילן בקבוקונים לשיפור הבטיחות.
    3. Decontaminate פיפטה טיפים ומקווי יש במגע HFA, כל שאריות HFA נוזלי עם אדל 2.5% לפני סילוק בזרם פסולת מסוכנת.
  2. על כל צלחת ספריית siRNA תחת חקירה, להכין פתרון בינוני HFA 0.0036% על-ידי הוספת 288 µL של 1% HFA 80 מ של מדיום HCORT מראש ומחוממת בבקבוק 150 מ.
    1. מערבולת מהבקבוק, דגירה HFA שתדללו ב חממה 37 ° C בשכונה fume כימי 10 דקות.
  3. לערבב את הפתרון בינוני HFA שוב על ידי מתערבל הבקבוק ולהוסיף הפתרון בינוני HFA מאגר מגיב על צלחת חמה.
  4. לבצע את החשיפה עם שני טכנאים עבודה משותפת.
    1. יש את הטכנאי µL נכון לשאוב 100 מכל הבארות פנים של צלחת התא באמצעות pipettor ערוץ 12 ולאחר מכן להעביר את הצלחת לטכנאי בצד השמאל.
    2. יש את הטכנאי בצד השמאל להוסיף µL 100 לכל טוב של הפתרון HFA בינוני.
    3. חזור על שלבים 6.4.1 ו 6.4.2 עבור כל לוחות תא כי הם להיחשף toxicant.
    4. גם חזור על שלבים 6.4.1 ו 6.4.2 עבור לוחות הבקרה שלא נחשפו, ניצול בינוני HCORT טריים במקום הפתרון HFA בינוני.
  5. למקם את הצלחות בחממה הוד fume כימיים עבור 20 דקות, ואז לחזור עליהם בחממה התרבות תאים.
  6. חזור על השלב תוספת בקרה חיובית (שלבים 5.1 5.5) כאמור המוצגות לאחר כל הצלחות חשוף, חזר החממה התרבות תאים.

7. CP חשיפה של תאים בתרבית

התראה: CP הוא בחריפות רעילים, מכשלה.

  1. לבצע את כל הפעולות לכימיקלים בשכונה fume כימי לובש זוגי nitrile כפפות, מעיל מעבדה, מגיני שרוול פוליאתילן חד פעמיות, בטיחות משקפיים.
    1. רוכשים CP.
    2. לדלל CP 5% ב דימתיל סולפוקסיד ולאחסן ב 10 מ ל aliquots ב- 10 מ"ל בקבוקונים נצנוץ לשיפור הבטיחות.
    3. Decontaminate פיפטה טיפים ומקווי יש במגע עם CP ו- CP נוזלי שאריות של כל עם 2.5% ביסולפיט לפני סילוק בזרם פסולת מסוכנת.
  2. להכין את נפח מספיק של טרום ומחוממת בינוני HCORT המכיל 1 x עט/סטרפ, PBS ומחוממת מראש עבור מספר צלחות חשוף.
  3. עבור כל ערכה העליון הצלחת להגדיר או צלחת התחתון, להוסיף µL 8.04 של 5% CP in דימתיל סולפוקסיד aliquot 50 מ של טרום ומחוממת HCORT בינונית, מערבבים היטב עבור ריכוז CP הסופי של 0.0008%. קאפ הצינור בחוזקה, דגירה הפתרון 37 ° C חממה בשכונה fume כימיים עבור 1 h.
    1. זמן התוספת של CP aliquots 50 מ של מדיום כך כל חשופות העליון הצלחת להגדיר להגדיר צלחת התחתון מקבל toxicant בדיוק 1 h לאחר CP נוספה את aliquot 50 מ של מדיום.
  4. הסרת העליון הצלחת להגדיר ואת הבקרה שלא נחשפו 1 צלחת החממה תרבות תא ולמקם אותם בשכונה fume כימי סמוך לסוף תקופת הדגירה.
  5. לערבב את הפתרון CP על-ידי היפוך הצינור, ואז decant אותו אל מאגר ריאגנט בסוף תקופת הדגירה 1 h.
  6. לבצע את החשיפה עם שני טכנאים עבודה משותפת.
    1. יש את הטכנאי µL נכון לשאוב 100 מכל הבארות פנים של צלחת התא באמצעות pipettor ערוץ 12 ולאחר מכן להעביר את הצלחת לטכנאי בצד השמאל.
    2. יש את הטכנאי בצד השמאל להוסיף µL 100 לכל טוב של הפתרון בינוני CP.
    3. חזור על הצעדים 7.6.1 ו 7.6.2 כל לוחות התא העליון צלחת ערכת להיחשף toxicant.
    4. גם חזור על הצעדים 7.6.1 ו 7.6.2 לוחות הבקרה שלא נחשפו, ניצול בינוני HCORT טריים במקום הפתרון בינוני CP.
  7. מקם את הצלחות 37 ° C חממה בשכונה fume כימית למשך 10 דקות.
  8. להוסיף נפח מספיק של PBS ו HCORT בינוני המכיל 1 x אפשרות למצוא עט כדי ריאגנט מאגרים סמוך לסוף תקופת הדגירה 10 דקות.
  9. להסיר את הפתרון CP צלחות התא באמצעות pipettor ערוץ 12 ולהחליף אותו עם µL 100 לכל טוב של PBS בסוף תקופת הדגירה 10 דקות.
  10. מיד להסיר את PBS תא צלחות ולהחליף אותו עם µL 100 לכל טוב של HCORT בינוני המכיל 1 x עט/סטרפ.
  11. גם חזור על שלבים 7.9 ו 7.10 עבור לוחות הבקרה שלא נחשפו.
  12. להחזיר את הצלחות תא חממה התרבות תאים סטנדרטית.
  13. חזור על הצעדים 7.3 כדי 7.12 ערכת צלחת התחתון.
  14. חזור על השלב תוספת בקרה חיובית (שלבים 5.1 5.5) כאמור תיאר לאחר כל הצלחות חשוף, חזר החממה התרבות תאים.

8. לטעום אוסף ואת וזמינותו הכדאיות תא

  1. עשרים וארבע שעות לאחר החשיפה, להכין פתרון של המצע MTT 0.5 מ"ג/מ"ל ב- PBS המכיל 10 גרם/ליטר גלוקוז וחם עד 37 ° C21. הכינו 10 מ"ל של מצע על כל צלחת להיות לבדיקה.
  2. עבור מספר צלחות ניתן לבדיקה, להוסיף נפח מספיק של פתרון המצע MTT מאגר על מטפל נוזלי אוטומטית.
  3. השתמש המטפל נוזלי אוטומטית כדי לאסוף דגימת ולהוסיף MTT המצע באמצעות pipetting µL/s 50 מהירות עבור כל השלבים. להגדיר מראש עצה התיבות כדי לטפל רק מאותן בארות כדי להיות לבדיקה.
    1. וביופסיה 95 µL של המדיום מן הבארות 60 הפנימי של התא לצלחת, וכן פיקדון 42.5 µL לתוך כל אחד שתי צלחות אחסון 384-. טוב.
    2. מיד להוסיף הצלחות תא µL 100 לכל טוב של הפתרון המצע MTT, דגירה אותם ב- 37 מעלות צלזיוס חממה התרבות התא עבור 1.5 h.
    3. מילוי מחדש המאגר עם פתרון המצע MTT כנדרש.
  4. דגירה הלוחות תא ב- 37 מעלות צלזיוס חממה התרבות התא מאובטח.
  5. לאטום את הצלחות 384-ובכן אחסון ואחסן אותם ב- 80 ° C לצורך ניתוח מאוחר יותר.
  6. חזור על הצעדים 8.3 ל 8.5 כל הערכות צלחת העליון והתחתון ושל הפקדים סמויה המשויך.
    1. שימוש חוזר טיפים בין משכפל אם רצוי, אבל לשטוף אותם בעת הוספת MTT המצע פתרון ומגדיר בעת מעבר בין צלחת.
  7. לאחר הדגירה 1 h, להוסיף נפח מספיק של דימתיל סולפוקסיד מאגר על מטפל נוזלי אוטומטית.
  8. השתמש המטפל נוזלי אוטומטי כדי להוסיף דימתיל סולפוקסיד ולהשתמש pipetting µL/s 50 מהירות עבור כל השלבים.
    1. האחות µL 100 מכל הבארות הפנימי של הלוחות תא ולמחוק את הפתרון המצע MTT לשמורה פסולת.
      1. רוקן המאגר פסולת כנדרש.
    2. כיסוי כל טוב עם 100 דימתיל סולפוקסיד µL.
      1. מילוי מחדש המאגר דימתיל סולפוקסיד כנדרש.
  9. לנער את הצלחות על צלחת מטרף למשך 3 דקות.
  10. למדוד ספיגת ב nm 570, 690 באמצעות ספקטרופוטומטרים על צלחת.
  11. להחסיר את הרקע ולחשב את הכדאיות תא % על-ידי חלוקת הערכים ספיגת חשוף באמצעות הפקדים סמויה. להשתמש בפקד siRNA הממוצע בריכה שלילית סמויה לחישוב הכדאיות תא % עבור כל המטרות.

9. מדד IL-8 ריכוז תא תרבות Supernatants

  1. למדוד הריכוז של IL-8 ב supernatants תרבות התא באמצעות לא רחץ מבוסס-חרוז assay לפי הוראות היצרן22. ליצור פריסה של צלחת assay כדי להתאים עקומה סטנדרטי ודוגמאות.
  2. להסיר את הלוחות 384-ובכן אחסון מהמקפיא-80 ° C, להפשיר בטמפרטורת החדר, בקצרה centrifuge הלוחות כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הבארות.
  3. עבור מספר צלחות assay לפעול, לעשות נפח מספיק של אנטי-IL-8 מקבל ושרשרות נוגדן anti-IL-8 biotinylated במאגר assay כלול בערכה. להשתמש על היחס של 50 µL של חרוזים מקבל anti-IL8 ו- µL 50 של נוגדן anti-IL8 biotinylated 9.9 מ ל assay מאגר.
    1. שימוש של pipettor רב-ערוצי, להוסיף תערובת חרוז/נוגדן צלחת שחור האחסון 384-. טוב.
      1. להוסיף מקבל חרוז/נוגדן הבארות המיועד לשימוש עבור עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות.
      2. להוסיף נפח מספיק לכל טוב עבור מספר צלחות assay להתנהל.
  4. לשקם IL-8 סטנדרטי כדי 1000 pg/mL באמצעות בינוני התרבות התא המכיל מיקרומטר 354 NaCl. ליצור אמצעי אחסון מספיק עבור מספר צלחות assay להתנהל.
  5. להפוך שמונה דילולים טורי כפולה של העקומה סטנדרטי.
  6. להוסיף את עקומת סטנדרטי שהפקידים הבארות המתאים של צלחת שחור האחסון 384-ובכן לפי התוכנית צלחת וזמינותו. להוסיף נפח מספיק לכל טוב עבור מספר צלחות assay להתנהל.
    1. באופן דומה, להוסיף בינוני התרבות התא המכיל מיקרומטר 354 NaCl עם אין IL-8 על רקע מדידה.
  7. להשתמש מטפל נוזלי אוטומטית כדי לבצע את הבדיקה. השתמש בתיבות קצה מוגדרות מראש כדי לטפל רק הבארות שקבעו את הפריסה צלחת וזמינותו. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
    1. העברת µL 8 של תערובת חרוז-נוגדן מקבל הבארות של הלוחות רדוד 384-ובכן assay טוב לבן.
      1. להוסיף רק הבארות המיועדים עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות.
    2. העברת µL 2 של העקומה סטנדרטי הבארות המתאים של הלוחות רדוד assay טוב לפי התוכנית צלחת וזמינותו.
    3. להכין פתרון NaCl 3.54 מ' ולהוסיף אמצעי אחסון מספיק עבור מספר צלחות ניתן לבדיקה כדי מאגר רדוד על המטפל נוזלי אוטומטית.
    4. התאם את ריכוז המלח הדגימות כדי להתאים של העקומה סטנדרטי על ידי העברת 4.5 µL של הפתרון NaCl הדגימות לוחית שחור האחסון 384-. טוב.
    5. לערבב את הדגימות שלוש פעמים באמצעות אמצעי אחסון ערבוב של 30 µL, העברת 2 µL של הדגימות ללבן רדוד טוב assay צלחות לפי התוכנית צלחת וזמינותו.
      1. לשנות טיפים בין לוחות דגימה.
    6. תקופת דגירה של h 1 בחושך בטמפרטורת החדר.
    7. עבור מספר צלחות assay לפעול, לעשות נפח מספיק של חרוזים מקבל במאגר וזמינותו. השתמש את היחס שבין 200 µL של מקבל משני חרוזים 12.3 מ ל assay המאגר.
    8. שימוש של pipettor רב-ערוצי, להוסיף חרוזים משני צלחת שחור האחסון 384-. טוב.
      1. להוסיף חרוזים משני הבארות המיועד לשימוש עבור עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות.
      2. להוסיף נפח מספיק לכל טוב עבור מספר צלחות assay להתנהל.
    9. משתמש המטפל נוזלי אוטומטי, העברה 10 µL של חרוזים משני הבארות של הלוחות לבן assay טוב רדוד 384-. טוב.
      1. רק להוסיף הבארות שקיבלו עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות ולשטוף את הטיפים בין כל צלחת.
    10. תקופת דגירה של עוד שעה בחושך בטמפרטורת החדר.
  8. חותם וזמינותו צלחות עם לנקות צלחת חותמות וסרוק באמצעות קורא צלחת תואמת וזמינותו. השתמש 0.2 mm המרחק בין צלחת, גלאי, 180 ms עירור, וזמן 550 ms מדידה עבור הסריקה.
  9. לייבא את הנתונים הגולמיים מבחני IL-8 לתוך גיליון אלקטרוני.
  10. השתמש אוטומטית עקומה פולינומיאלית על העקומה סטנדרטי של מבחני IL-8 ולאחר מכן להמיר את הנתונים הגולמיים pg/mL עבור כל דגימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פיתוח שיטות חשיפה

אנו מעודן, הערכת ההתאמה של הקו תאי אפיתל הקרנית אדם SV40-HCEC לשימוש במחקרים השודדים. SV40-HCEC היו מונצחים באמצעות SV-40 גדול T אנטיגן, היו מתנה חבר Dhanajay23. היו יותר מדי משתנים בציורו חשיפה פיתוח מתודולוגיה להציג בתמציתיות בזאת, אז רק כמה דוגמאות של הממצאים שאנו מאמינים עשויים לחול להפכה חשיפה לרעלים ל מרובות מוצגים.

חשיפה toxicant על ידי ספייק או Exchange בינוני

אנחנו בתחילה ביקשה לחשוף תאים על-ידי עולה µL 5 של ריכוז העבודה של toxicant מדולל במים, תמיסת מלח, או בינוני µL 95 בינוני כבר נוכח כל טוב של תאים צלחת 96-ובכן כדי להשיג את הריכוז הסופי החשיפה הרצויה. SV40-HCEC נחשפו באמצעות העלייה לחשוף refeed מתודולוגיה 1 X LD50 של HFA במשך 24 שעות ביממה (1 X LD50 = 0.02% HFA בשיטה זו כאשר הדקר HFA היה מדולל בינוני), ווולס היו refed עם טרי בינונית 10 דקות מאוחר יותר. לאחר 24 שעות, פרסו את התאים עם סובסטרט MTT כפי שתואר לעיל עבור תא הכדאיות וזמינותו. תמונות נלכדו על ידי photomicroscopy לפני solubilization של הקריסטלים formazan עם דימתיל סולפוקסיד. מדוקדקת של בארות הראה כי כאב מקומי מידה גדולה של מוות של תאים, במקום אחד, וזאת למרות העובדה כי הצלחת היה מזועזע 15 s מיד לאחר המסמר נוספה על הלוח כולו (איור 1 א'). התופעה נצפתה בהם בדקר נוספה לתחתית טוב או כאשר נוספה ב מניסקוס. תמונת הגדלה גבוהה יותר של האזור באמצעות מראה ניגודיות שלב שבו תאים נמצאים עדיין האזור מוכתם על ידי MTT (איור 1b). בדקנו גם החלפת בינוני וחושפים/refeed מתודולוגיה איפה בינוני הוסר מן הבארות, מוחלף בינוני התרבות התא המכיל 1 X LD50 HFA (1 X LD50 = 0.035% HFA בשיטה זו), וולס היו refed עם טרי בינונית 10 דקות מאוחר יותר. לאחר 24 שעות, פרסו את התאים עם סובסטרט MTT כמתואר לעיל. שיטה זו מושגת יותר ככל הנראה אפילו תא מוות מענה של תאים בתוך כל טוב(איור 1 c ו- 1 d). פקדים שלא נחשפו ניתנים לעיון ולהראות אין אזורים המותאמות לשפות אחרות של מוות תאי (איור 1e ו- 1f). עבור חשיפות CP, השיטה ספייק לא לגרום מידה גדולה של מוות של תאים מקומית במקום אחד בתוך כל טוב; עם זאת, התגובה מוות תא הייתה עקבית יותר של איטרציה הבא באמצעות שיטת החשיפה החליפין בינונית (נתונים לא מוצג).

Figure 1
איור 1 : תא מוות הנגרם על ידי ספייק ושיטות החשיפה החליפין בינונית. כל התמונות היו h 1.5 שנתפסו לאחר תוספת של MTT המצע. לוח (א) הוא תמונת שדה בהיר של SV40-HCEC נחשפים ספייק HFA לחשוף refeed מתודולוגיה. לוח (b) הוא הגדלה גבוהה יותר של הבאר אותו בלוח (א) שימוש שלב חדות. לוח (ג) הוא תמונת שדה בהיר של SV40-HCEC שנחשפו על ידי exchange בינוני לחשוף refeed מתודולוגיה. לוח (d) הוא הגדלה גבוהה יותר של הבאר אותו בלוח (ג) באמצעות שלב חדות. לוחות (e), (נ) הם שדה בהיר, ובכן סמויה והגדלה שלב ניגודיות גבוהה יותר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

יציבות toxicant בינוני

זה היה ציין כי ברגע מדולל בינוני, cytotoxicity לכאורה של HF ו CP משתנה, ואז מייצבת. HFA מדולל בינוני ל- 0.0036%, רשאית דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-60 דקות לפני חשיפת SV40-HCECs כמתואר לעיל. עבור HFA, מגדילה cytotoxicity בתוך 5 דקות הראשונות HFA הוא מדולל בינוני ולאחר מכן יציבה במשך לפחות שעה (איור 2 א). דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן השוואה מרובים של Dunnett הראתה את הכדאיות תא % בכלל נקודות זמן היו שונים באופן משמעותי מנקודת הזמן 1 דקות. היו אין הבדלים משמעותיים בין מינימום 2.5 עד 60 נקודות זמן. CP אורגניים, הוא קודם מדולל 5% ב דימתיל סולפוקסיד. זה היה לאחר מכן מדולל בינוני ל- 0.0008%, רשאית דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-120 דקות לפני חשיפת SV40-HCECs כמתואר לעיל. ברגע מדולל בינוני, cytotoxicity של CP פוחת מעל 60 דקות ומייצב ואז לפחות ה הבאה (איור 2b). דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן השוואה מרובים של Dunnett הראתה את הכדאיות תא % בכלל נקודות זמן היו שונים באופן משמעותי מנקודת הזמן 5 דקות. היו אין הבדלים משמעותיים בין מינימום 60 עד 120 נקודות זמן.

Figure 2
איור 2 : Toxicant אובדן cytotoxicity ב דילולים בינונית. הנתונים מבוטאים כממוצע של ± הכדאיות אחוז SD (n = 6). החלונית ' (א) מציגה את היציבות של 0.0036% cytotoxicity HFA מדולל בינוני, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 1-60 דקות לפני חשיפת SV40-HCECs כמתואר לעיל. החלונית ' (b) מציגה את היציבות של 0.0008% cytotoxicity CP מדולל בינוני ולא הורשו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-120 דקות לפני חשיפת SV40-HCECs כמתואר לעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Refeed/לחשוף או לחשוף רק

גורם נוסף חקר ב חשיפה מתודולוגיה היה אם: א) להוסיף toxicant במשך 10 דקות, כביסה, refeed, להסיר את הלוחות מהשכונה fume כימי, דגירה 24 שעות ביממה בחממה תרבות תא סטנדרטי (שיטת refeed/חשיפה); או B) להוסיף toxicant, תשאיר את זה, להסיר את הלוחות מהשכונה fume כימי, דגירה 24 שעות ביממה בחממה תרבות תא סטנדרטי (השיטה היחידה לחשוף). בטיחות היא גורם חשוב ככל שיהיה לא מותר להסיר את הלוחות של תאים המכילים toxicant מדולל מהשכונה fume כימי כי toxicant חופש-גז ולחשוף אנשי צוות. שיקול הקשור מספר הצלחות להיחשף בזמן נתון מאז הלוחות יותר ישנם, יהיו גדול נפח את-ההמתה. בשיטות HTS שלנו, אנחנו נחשוף את הצלחות 48 x 96-ובכן ביום המחקר נתון. אנו מניחים צלחות התרבות תאים החשופים לשקית אטומה, ואז השתמש צינורות גלאי גז ערכי צבע מוחלטים כדי להעריך CP ו- HF חופש-ההמתה של לוחות החשופים. מצאנו כי חשיפת צלחות 48 1 x LD50 של HFA לא לגרום לכל לזיהוי HF חופש-גז רעיל (נתונים לא מוצג). עבור חשיפות CP, מצאנו כי היה מספיק CP חופש-ההמתה של 48 לוחות נחשפים 1 x LD50 להציג לפחות קצת דאגה לבטיחות (נתונים לא מוצג). הן refeed/לחשוף, וחושפים רק בשיטות הוערכו עבור HFA חשיפות. SV40-HCEC תאים נחשפו HFA, הכדאיות היה מוערך על ידי MTT assay 24 שעות לאחר החשיפה. מינון תגובה חזרות בוצעו בימים שונים. לעומת השיטה וחושפים/refeed (איור 3 א), מצאנו כי השיטה היחידה חשיפה לתוצאות עקבית יותר תא הכדאיות assay (איור 3b). לכן, בשיטה זו נבחר כחלק המתודולוגיה חשיפה הסופי. עבור CP, ההבדלים בעקביות תוצאות וזמינותו של התא הכדאיות בין שני למתודולוגיות חשיפה שונות לא היתה אפשרות להעריך מאז חששות בטיחות מנעה הסרת הלוחות CP חשוף מהשכונה fume כימיים עבור דגירה 24 שעות בבית תא סטנדרטי תרבות חממה.

Figure 3
איור 3 : חשיפה עקביות עם refeed/לחשוף ולחשוף רק בשיטות. הנתונים מבוטאים כממוצע של ± הכדאיות אחוז SD (n = 6). (א) HFA היה מדולל בינוני, מודגרות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ואז השתמש כדי לחשוף תאים בשיטת refeed/לחשוף. (ב) HFA היה מדולל בינוני, מודגרות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ואז נהג לחשוף SV40-HCEC על ידי השיטה היחידה לחשוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תא דגם עידון

המרכיבים בינוני

אנחנו דבקה התנאים תרבות שהוקם על ידי החוקרים שמקורם המעבר ותחזוקה של שורות תאים אלה; עם זאת, אנחנו ששינה אותם עבור תאים בניסויים. המדיום תרבות תא שנקבעו על ידי החוקרים שמקורם עבור התאים SV40-HCEC אינה כוללת הידרוקורטיזון, אבל אנחנו מנוצל רמה נמוכה של הידרוקורטיזון (0.5 µg/mL) במהלך לימודי חשיפה כדי לדכא את הדקר ומדי פעם בייצור ציטוקינים ראיתי תמים SV40-HCEC (נתונים לא מוצג) אשר המינימאליים ניתוח נתונים מ איטרציה הבא במהלך הלימודים עידון.

יציבות פנוטיפי

במהלך הלימודים עידון המודל שלנו תא, מצאנו כי SV40-HCEC להתחיל ירדו ייצור ציטוקינים בתגובה לחשיפה toxicant מתחיל סביב המעבר מספר 60 (נתונים לא מוצג). מסיבה זו, אנו מתוחזק cryostocks תאי המעבר נמוך כל מחקרים באמצעות תאים תחת מעבר מספר 60, והוצא להורג פיקוח ייצור ציטוקינים במהלך תהליך המיון.

צלחת פריסה

מקור חשוב של השתנות ניסיוני במחקרים תפוקה גבוהה הוא אפקטי קצוות של צלחות רב טוב. מצאנו כי התגובות ציטוקין של תאים ב- edge וולס היו בלתי עקביים עם, או מקביל, בארות פנים והן HFA ו- CP מחקרים (נתונים לא מוצג). פולנית החציוני של הנתונים, תרגיל סטטיסטי המשמש כדי למזער את ההשפעות קצה על ערכת נתונים, לא פתרה מספיק על הנושא (נתונים לא מוצג). לכן, אין בארות הקצה צלחת תא שימשו ניסויים או פקדים (איור 4).

Figure 4
איור 4 : פריסות ספריית וצלחת תא. אזורים מוצללים אפור בפריסה צלחת ספרייה מייצגים בארות המכילים siRNA. הבארות לבנים ריקים. המטרות 40 משורות A-D של צלחת ספריית משמשים את "העליון צלחת קבע", המטרות 40 משורות E-H של צלחת ספריית משמשים את "בתחתית צלחת קבע". וולס B2-B6 משמשים עבור פקדים siRNA בריכה שלילי. וולס C2-C6 הם שאינם transfected. וולס B7-B11 משמשים cardamonin או SKF בקרה חיובית 86002 סמים כמתואר, בארות C7-C11 משמשים עבור בקרת דימתיל סולפוקסיד הרכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באימות חוץ גופית מודל עבור HTS

השתמשנו Z' גורם ניתוח כדי לקבוע את התאמתו של SV40-HCEC לשימוש במחקרים HTS כמו בדיקה סטטיסטית זו משמשת כדי לקבוע את איכות assay HTS24. עבור HF זי ' גורם ניתוח, התאים היו נזרע ב 1.25 x transfected עם בריכה שלילי siRNA (כמתואר לעיל) תאים3 10/טוב, 24 שעות לאחר זריעה, חשוף 48 שעות לאחר תקנים ל- 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. עבור CP זי ' גורם ניתוח, התאים היו נזרע transfected כמתואר לעיל, ואני חשוף 48 שעות לאחר תקנים ל- 0.0008% CP (1 x LD50), n = 5. N גדול שימש המחקרים CP בשל מידת ההשתנות יותר במודל זה חשיפה. Z' פקטור מחושב עבור IL-8 ביטוי נתונים מן התאים שלא נחשפו לעומת חשוף siRNA בריכה שלילי transfected סמויה נגד חשוף תאים עבור חשיפות CP ו- HFA. גם ניתחנו את התאים שאינם transfected כדי לקבוע אם הייתה השפעה על איכות assay כתוצאה siRNA תקנים. איטרציות רבות של מחקרים אימות בוצעו תוך שיפור תנאי חשיפה ותרבות במטרה למקסם את Z' גורם לתוצאות. SV40-HCEC עבר אימות והיה איטראציות רוב Z' גורם ערכים הגדולים מ- 0.50 עבור חשיפות HF (טבלה 1) ו- CP חשיפות (טבלה 2). כל שכפול בטבלאות אלה היה מתאי מצופה בימים שונים.

חשיפה קבוצות Z'-פקטור ניתוח
נציג #1 נציג #2 נציג #3
חשופים-HF שליטה שלילי לעומת בקרה שלילית סמויה 0.68 0.5 0.56
HF-חשוף לעומת תמים 0.4 0.68 0.56

טבלה 1: SV40-HCEC HFA חשיפה Z' גורם ניתוח של IL-8

חשיפה קבוצות Z'-פקטור ניתוח
נציג #1 נציג #2 נציג #3
חשופים-CP שליטה שלילי לעומת בקרה שלילית סמויה 0.6 0.18 0.46
CP-חשוף לעומת תמים 0.42 0.29 0.42

טבלה 2: SV40-HCEC CP חשיפה Z' גורם ניתוח של IL-8

ראשי siRNA הקרנת תוצאות של HFA נפגע תאים

תרביות תאים אופטימיזציה מחקרים בוצעו לפני ההקרנה, ושימש siRNA מיקוד cyclophilin b על מחקרים אלו. שיטת זיהוי בחיי עיר RNA שימש כדי למדוד את רמות ה-mRNA b cyclophilin, מנתח תוכן גבוהה שימש כדי לכמת את התוצאות. השגנו בקרבת מקום ל- 90% תמונות ציפורים של cyclophilin b, בדרך כלל לא יותר מ 5-10% איבוד תאים עם 4 pmol של siRNA/טוב, תרביות תאים µL/טוב 0.3 ריאגנט (נתונים לא מוצג). כמויות גבוהות של siRNA הביאה למעשה cyclophilin עניים b נוקאאוט (נתונים לא מוצג). רמות דומות של נוקאאוט הושגו עם 1.2 pmol/טוב של siRNA ו- 0.09 ריאגנט µL/טוב תרביות תאים, אך אנחנו נבחר להשתמש 4 pmol לכל טוב על מנת לטפל בכל מטרות יכול לדרוש כמויות גדולות יותר של siRNA כדי להשיג אפקטיביות נוקאאוט. קינטיקה תמונות ציפורים היעד הוערכו גם, זה היה ציין שאת נוקאאוט היעד היה מקסימלי על ידי יומיים שלאחר תרביות תאים (נתונים לא מוצג). אחידות תמונות ציפורים המטרה על פני המשטח היה גם מאומתים (נתונים לא מוצג). תרופות אנטי דלקתיות cardamonin ו- SKF 86002 משמשים כפקדי חיובי עבור עיכוב של ציטוקין הייצור עבור HFA וחשיפת CP, בהתאמה. אלו נבחרו על-ידי בדיקת מגוון של תרכובות עם תכונות אנטי דלקתיות הידוע בתאים חשוף. המינון מנוצל הקרנת מחקרים נבחר ע י מינון תגובה אופטימיזציה מחקרים.

SiRNA תפוקה גבוהה הקרנת אסטרטגיה אנחנו מנוצל הוא בתקן התעשייה והיא כוללת שלושה שלבים עיקריים: הקרנת ראשי 1), 2) ספריית deconvolution ו 3) המטרה אימות. סינון ראשוני, מוערך של פנוטיפ של כל מטרה ניצול תערובת של רצפי siRNA שונים כמו ריאגנט יחיד כדי להתמקד בכל הגן. מטרות הן ואז שנבחר למטה אל ספריית deconvolution. בשלב זה, אחד של הרצף siRNA שונים כי הם איחדו למקד את כל הגן סינון ראשוני נבדקים בנפרד. מטרות עוברים למטה-בחירה נוספת לתוך היעד אימות שבו פנוטיפ היעד הוא אישר עם סמים, ותפקיד לשחזור, ו/או siRNA מיצרן אחר. על המסך הראשי שלנו, אנחנו נבחר לביצוע מסך sub-גנומית ממוקד ולא מסך רחב הגנום מטעמים של הכלכלה. נתונים Microarray HF CP נפצע עכבר לקרנית, ניתוח מסלול ההמצאה (IPA) שימשו כדי למקד את ספריית היעד שלנו על המסך הראשי (כתבי-יד בהכנה). בקצרה, העכבר לקרנית נחשפו אדי toxicant שימוש דומה לזה שתואר לעיל שיטות25ספל אדי. הקרנית החשוף לחצנים ופקדים נבצרו ב זמן שונים נקודות פוסט החשיפה. RNA היה מבודד, האיכות והכמות של RNA הנמצאים תחת פיקוח. כל הניסויים microarray בוצעו על פי היצרן פרוטוקול26. עוצמות האות raw מנורמל, נותחו על ידי ניתוח גורמים ראשיים (PCA) כדי לקבוע במקורות משמעותית של השתנות הנתונים. הגנים היו דרגה הורה מובהקות סטטיסטית. הנתונים היו ממוקש, לעומת גנים רשימות של ספריות siRNA מוגדרות מראש. רשימות אלה ג'ין, בחרנו מטרות 3120 להקרנה. הספרייה siRNA הוקרן בתאים SV40-HCEC (ראה איור 5 תרשים זרימה של פרוטוקול HTS עבור המסך הראשי). הקצה של הערכות נכללים IL-8 רמות במדיום התרבות התא על ידי לא-השטיפה מבוסס-חרוז assay תא הכדאיות לפי MTT וזמינותו. התאים נחשפו 0.0036%HFA, תיאר כאמור, אשר היא כ 1 x LD50. תא הכדאיות נאמד על ידי MTT assay 24 שעות לאחר החשיפה. ההשפעה של כל אחת מהבריכות siRNA על הכדאיות תא נותחו מובהקות סטטיסטית ביחס לממוצע חשוף בריכה שלילי עבור כל צלחת באמצעות סטנדרטית לחלוטין כלומר ההבדל (SSMD)27. מגרש כפול-פנס SSMD ותא הכדאיות הקיפול-השינוי מוצג באיור 6. הסף פגע הבחירה שבחרת עבור מטרות הכבידו מוות של תאים או שיפור תא הכדאיות היו SSMD ≤-1.28 ≥ SSMD 1.28, בהתאמה.

Figure 5
איור 5 : HTS המסך הראשי פרוטוקול תרשים זרימה- תרשים זרימה זה מציג את השלבים החיוניים המבוצעות בכל יום עבור פרוטוקול HTS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : מגרש כפול-פנס של siRNA ההשפעה על תאים SV40-HCEC Cell Viability of HFA-Exposed. התוצאות המוצגות עבור כל מטרה הן הממוצע של משכפל 6 (n = 6). תא הכדאיות נתונים מבוטא קיפול-שינוי ביחס siRNA פקד הבריכה שלילי חשוף, מובהקות סטטיסטית נותחה על ידי SSMD. מטרות אשר היו של SSMD ≤-1.28 או ≥ 1.28 נבחרו כמו להיטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ההשפעה של כל אחת מהבריכות siRNA על ייצור IL-8 HFA-induced נותחו מובהקות סטטיסטית ביחס לממוצע חשוף בריכה שלילי עבור כל צלחת. IL-8 בתרבות תא supernatant היה המוערך assay 24 שעות לאחר החשיפה. מגרש כפול-פנס של SSMD ו- IL-8 הקפל-השינוי מוצג איור7. הסף מבחר כניסות עבור מטרות ירד ייצור IL-8 היו 40% ירידה SSMD ≤-1.0. הסף פגע הבחירה שבחרת עבור מטרות אשר גדל הייצור IL-8 היו הגברה, SSMD > 1.28.

Figure 7
איור 7 : מגרש כפול-פנס של אפקט siRNA על ייצור IL-8 על ידי תאים SV40-HCEC HFA-Exposed. התוצאות המוצגות הן הממוצע של משכפל 6 (n = 6). נתונים ברמת הביטוי IL-8 מבוטא קיפול-שינוי ביחס siRNA הבריכה שלילי חשוף, מובהקות סטטיסטית נותחה על ידי SSMD. להיטים הוגדרו כמו מטרות אשר היו של 40% ירידה IL-8 רמות, SSMD ≤-1.0, או הגברה IL-8 רמות, SSMD > 1.28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במסמך זה אנו מתארים תוצאות ושיטות שלנו על הפיתוח של תפוקה גבוהה קרנית תא אפיתל הקרנת מודל המחקר של פציעות HF ו- CP. אנו מציגים גם את התוצאות מהמסך הראשי siRNA HF להיפצע. היו אתגרים רבים לפיתוח מודלים HTS לצורך המחקר של פציעות טיק. שיטות שיכולנו למצוא בספרות הקשורים בחקר HF, HFA או CP במודלים התרבות התא היו מועיל. רוב במבחנה מחקרים על יון הפלואוריד לערב תאים אוראלי, מנוצל נתרן פלואוריד ולא HF או HFA (עבור כמה דוגמאות, ראה28,29). כמה המתודולוגיה על במבחנה החשיפה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט CP שפורסם על-ידי. Pesonen et al. 30. בסופו של דבר, מצאנו שיטות ספציפיות אין בספרות הקשורים בחקר HTS HF, HFA או CP, הרוב המכריע של אתגרים ומשתנים הקשורים בחקר אלה חשיפה לרעלים בפיתוח HTS נדרש. תשומת לב מיוחדת הוקדשה להשגת רמה גבוהה של עקביות חשיפה לאורך זמן, לוחות הקרנה רבים הדרושים למחקר HTS מוצלחת.

סוג אחד של אתגר נתקלה היה קשור היישום של toxicant למערכות התרבות תאים. כמה חשיפה לרעלים הם תגובתי עם או לא יציב בפתרונות מימית. חשיפה לרעלים שבחרנו למחקר הם לא נחשבים אלה בעיות יציבות. המחקר החקלאי חוקרים photohydrolysis של CP הראו שיש פתרון 0.001 M של CP במים half-life של h 31.1 כאשר נחשף למקור אור קסנון (אור השמש בעוצמה של יום מעונן) של לאקס 1100 במשך 10 ימים, 12 שעות לכל יום31. אין מדיד הידרוליזה היה מעל 10 יום באותה תקופה כאשר הפתרון היה מאוחסן בחושך. יונים פרוטון, פלואוריד של HFA יציבים בבירור במים. עם זאת, ישנם שיקולים נוספים יציבות ביחס דילולים toxicant עשוי מדיום התרבות תאים. מצאנו שהיה שינוי הראשונית של cytotoxicity במידה מסוימת בעת חשיפה לרעלים היו קודם מדולל במדיום התרבות התא זה מייצבת ואז אחרי תקופה קצרה של זמן. אנו מאמינים כי זה עקב כריכת toxicant או למעקב complexing עם המרכיבים במדיום. תא בינוני מכיל סידן, מגנזיום, חלבון, וכו ידועים לקיים אינטראקציה עם ה32,יון הפלואוריד33. CP נודעת תגובות חמצון עם תיולים ביולוגי, אך זה עלול גם לאגד את ה-DNA, חלבונים ו34,אחרים נוקלאופילים עם35. לאחר תגובות ואינטראקציות אלו יש להשלים או להגיע שיווי משקל, מייצבת כמות toxicant זמין ומייצב ובכך cytotoxicity לכאורה. בתחילה חרשנו את השימוש דילולים תמיסת מלח ומים של חשיפה לרעלים עבור מניות עבודה המשמש עבור חשיפות כדי למנוע את toxicant אינטראקציות עם המרכיבים בינוני ב דילולים עבודה. השימוש של תמיסת מלח ישמר גם הרכיב חומצה הפגיעה HFA עבור חשיפות שבוצעה על-ידי המרת בינוני. מצאנו כי התגובות מוות תא חשיפה לרעלים, ומים מלוחים דילולים היו משתנה יותר מאשר שיטת תא בינוני תרבות דילולים עם exchange בינונית (נתונים לא מוצג). לגבי שיטת החשיפה ספייק עם HFA, ההשתנות יכול להיות בגלל חוסר עקביות הדקר פיזור טוב מובילים אל המטרות סלולר מתחרה עם המרכיבים בינונית עבור יון הפלואוריד זמינים. הסיבות השונות ב- HFA חשיפות על ידי חילופי בינוני עם דילולים מלוחים HFA אינם ברורים לחלוטין. בכל מקרה, שיטות חשיפה באמצעות דילולים מלוחים עבור HFA היו נטושים, לא בחנו את CP. הרעילות של שלנו דילולים HFA בינוני כנראה מקרוב מחקה מחקרים באמצעות סודיום פלואוריד כי המדיום תא אנשים רגילים פרוטונים חינם בדילולים HFA שלנו.

אתגרים נוספים נתקלנו שהיו קשורים עידון של הדגמים התרבות תאים לשימוש ב- HTS. זה הכרחי לשנות את המרכיבים בינוני התרבות התא עבור תאים ניסויים, במיוחד הידרוקורטיזון ואנטיביוטיקה. אנחנו מנוצל רמה נמוכה של הידרוקורטיזון (0.5 µg/mL) במהלך לימודי חשיפה כדי לדכא את הדקר ומדי פעם בייצור ציטוקינים אצל תמימה SV40-HCEC. זו כמות נמוכה של הידרוקורטיזון לא השפיעה לרעה את תגובות התאים toxicant והיה מתחת רמות לרוב נעשה שימוש כדי לדכא את ייצור ציטוקינים על ידי תאים בתרבית בתגובה ממריץ36,37. הסיבות בדיוק למה תאים נאיביים SV40-HCEC מדי פעם לייצר עודפי ציטוקינים לא ידועים, אך זה אפשרי כי התאים רגישים variably גורמי קלים להתרחש במהלך תא passaging, ציפוי. מעבדות רבות כוללות באופן שגרתי אנטיביוטיקה תא תרבות תחזוקה בינוני, אבל קצת אנטיביוטיקה, tetracyclines בפרט, הוכחו שהפגינו השפעות אנטי דלקתיות על תאים בתרבית תאים אפיתל הקרנית38כולל. באופן כללי, המעבדה שלנו מונע את השימוש באנטיביוטיקה במידת האפשר מאז אלה יכול באופן פוטנציאלי וחיסול מחקרים. אנחנו גם חקר את הסחף פנוטיפי על מעברים מרובים של התאים שלנו בתרבות. זה נפוץ מונצחים תאים לעבור סחיפה גנטית ו/או פנוטיפי על מעברים מרובים, אם לא מתוחזק בשלב מעריכית, אם מותר להגיע confluency, או אם נחשפים מסוימים לחצים סביבתיים39,40 ,41. לכן, זה קריטי במהלך מסך תפוקה גבוהה כי שורות תאים מתוחזקים כראוי וכי המסך הושלמה באמצעות מספרים המעבר תא לשמור על התגובה פנוטיפי ידוע. אפקטי קצוות צלחת רב טוב הוא התופעה כי התאים גדלו ב הבארות המתחם החיצוני של צלחות רב טוב לעיתים קרובות אינם מגיבים אותו הדבר או עם עקביות אותו כתאי גדלו ב פנים בארות42. ישנם תרגילים סטטיסטי, כגון פולנית החציוני, זה יכול להיות מנוצל כדי למזער את אפקטי קצוות על ערכת הנתונים43. עם זאת, אין שום תרגיל סטטיסטי כי יכול לחסל את אפקטי קצוות יעד מסוים או פקד אם זה נבדק תמיד בבאר קצה, ומשתנה הפריסה צלחת בין משכפל לעבור מטרות או פקדים ליד קצה בארות אינה לוגיסטית מעשי או העלות האפקטיבית. זה לדעתנו זה ההחלטה לכלול את השימוש קצה בארות מבוססת תא מבחני HTS צריך להיעשות בזהירות. מצאנו את זה צורך לבטל את השימוש בתאי צמח בבארות קצה עבור פקדים, מטרות.

HTS תא דגם וחשיפה המתודולוגיה שלנו עבור במבחנה HF פציעה שימש כדי להשלים בהצלחה את המסך siRNA העיקרי של מטרות 3120. SSMD שימש לבחירה פגע כי הוצע במיוחד כדי למדוד את סדר הגודל של ההבדל בין פקד של siRNA27. התוצאות שלנו עבור תא הכדאיות להראות שהיה הקשר הליניארי העלילה הכפולה-פנס בין SSMD לבין קיפול-שינוי עבור כמעט כל המטרות. מסיבה זו, השתמשנו את קריטריון יחיד של SSMD עבור מבחר כניסות עבור נקודת קצה זו. הנתונים IL-8 שונה בכך כמה מטרות היו תופעות חלש אך עקבי בעוד אחרים הראו אפקטים חזקים אבל לא עקבי. לכן, השתמשנו קיפול-שינוי והן SSMD עבור קריטריוני הבחירה פגע עבור נקודת קצה זו. הערכים SSMD פגע הבחירה עבור שניהם הכדאיות התא והוא IL-8 נתונים נבחרו בגלל המכנסונים בין 1 ו- 1.645 (או-1-1.65) להשיג גילוי שווא נמוכה של אי-גילוי המחירים44. היו כמה מטרות שהיו להיטים ב תא הכדאיות והן נתונים IL-8. במקרים אלה, ניתנה העדפה עבור הכללה בספריה deconvolution מטרות אלה זה המופעל ההשפעות שלהם באותו כיוון של שיפור הבריאות הכללית (הכדאיות משופר ו- IL-8 ירידה) או בהחרפת פציעה (גדל מוות של תאים, מוגבר IL-8). בסך הכל, בחרנו סך של 250 מטרות בין הכדאיות תא IL-8 נקודות קצה כדי להפוך את הספרייה deconvolution HF פציעה. המסך הראשי על הפגיעה במבחנה CP מתבצעת.

לסיכום, פיתחנו חשיפה ותרבות תנאים מתאימים לצורך המחקר HTS לפגיעה עינית HF ו CP. מספר משתנים תנאי חשיפה והתרבות היו מעודן, אופטימיזציה, ואומת הדגמים היו להיות מתאים ללימודי HTS מאת Z' גורם ניתוח. יש לנו עוד הוכחה השירות של מודלים אלה על-ידי השלמת המסך הראשי של ספריית siRNA במודל HF. ישנם הרבה פציעות, מחלות של לא או עניין מיוחד התרופות או תעשיית הביוטכנולוגיה, פציעה toxicant מאת CP ו- HF כללו ולאחר הופעתו של רובוטיקה benchtop מקלה על המחקר HTS של פציעות ומחלות במעבדה כמעט כל . נתוני גנומית תפוקה גבוהה ערכות יכול מאוד לתרום להבנת התפקידים גנים ספציפיים לשחק מפציעה או מחלה שיכולה לסייע להתמקד ביעילות רבה יותר בצע על מחקרים במבחנה או ויוו .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

כתב ויתור: הדיעות במאמר זה הם אלה של והמלצה ולא לשקף את המדיניות הרשמית של המחלקה של הצבא, ההגנה או ממשלת ארה ב. מחקר זה נתמך על ידי הסכם הסוכנויות בין NIH/NIAID את USAMRICD, באופן חלקי על ידי פעילות התוכנית השתתפות מחקר לתארים מתקדמים-ארה ב צבא רפואי מחקר מכון כימי ההגנה מנוהל על ידי האלון רכס מכון המדע והחינוך באמצעות הסכם הסוכנויות בין משרד האנרגיה האמריקני USAMRMC.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מוסדות של בריאות לנטרל תוכנית הסוכנויות הסכם # AOD13015-001. ברצוננו להודות סטפני פרוברג והרסט פיטר על המאמצים שלהם והמומחיות הפקות וידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

ביולוגיה גיליון 136 Chloropicrin מימן פלואוריד תאי אפיתל הקרנית פציעה הקרנית siRNA תפוקה גבוהה ההקרנה
תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter