Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hög genomströmning SiRNA Screening för klorpikrin och vätefluorid-inducerad hornhinnan epitelial Cell skada

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Hög genomströmning små hämmande RNA screening är ett viktigt verktyg som kan bidra till snabbare klarlägga molekylära mekanismer för kemiska hornhinnan epitelial skador. Vi presenterar häri, utveckling och validering av exponering modeller och metoder för high throughput screening av vätefluorid - och klorpikrin-inducerad hornhinnan epitelial skador.

Abstract

För människor-inducerad okulär skada är en sann okulär nödsituation eftersom kemikalier har potential att snabbt orsaka betydande vävnadsskada. Behandlingar för människor-inducerad korneal skada är allmänt stödjande som inga specifika therapeutics finns för att behandla dessa skador. I arbetet med att utveckla behandlingar och läkemedel för att ta hand om exponering, kan det vara viktigt att förstå de molekylära och cellulära mekanismerna av dessa skador. Vi föreslår att utnyttjande av hög genomströmning små hämmande RNA (siRNA) screening kan vara ett viktigt verktyg som kan bidra till snabbare klarlägga molekylära mekanismer för kemiska hornhinnan epitelial skador. siRNA är dubbel stranded RNA molekyler som är 19-25 nukleotider långa och utnyttja den post-transcriptional nedtystning väg för att försämra mRNA som har homologi till siRNA. Den resulterande minskningen av uttryck av specifika genen kan sedan studeras i toxiska exponerade cellerna att kontrollera funktionen av denna gen den cellulära svar på den för människor. Utveckling och validering av in vitro- exponering modeller och metoder för hög genomströmning screening (HTS) av vätefluorid (HF) och klorpikrin-(CP) inducerad okulär skada presenteras i denna artikel. Även om vi valt dessa två ämnen, är våra metoder tillämpliga på studiet av andra gifter med smärre ändringar till protokollet toxiska exponering. SV40 stora T antigenet förevigade mänsklig korneal epitelial cell linje SV40-HCEC valdes ut för studien. Cellernas viabilitet och IL-8 produktion valdes som slutpunkter i protokollet screening. Flera utmaningar associerade med utveckling av toxiska exponering och cell kultur metoder passar HTS studier presenteras. Inrättandet av HTS modeller för dessa gifter kan ytterligare undersökningar för att bättre förstå mekanismen av skada och till skärmen för potentiella therapeutics för kemiska okulär skada.

Introduction

För människor-inducerad okulär skada är en sann okulär nödsituation eftersom kemikalier har potential att snabbt orsaka betydande vävnadsskada. Behandlingar för människor-inducerad korneal skada finns tyvärr bara allmänt stödjande som inga specifika therapeutics finns för att behandla dessa skador. Den nuvarande behandlingsstrategin är ospecifika och främst inkluderar aktuella terapeutiska behandlingar såsom smörjmedel, antibiotika, och cycloplegics följt av antiinflammatoriska medel (t.ex., steroider) en gång hornhinnan har åter epithelialized1 ,2. Trots de bästa nuvarande terapeutiska behandlingsalternativ tillgängliga är långsiktiga prognosen allmänt dåliga på grund av progressiva korneal grumling och kärlnybildning2,3.

Djurmodeller har traditionellt använts för att undersöka kemiska toxicitet och förstå mekanismer för skada. Djurstudier är dock tidskrävande och dyrt. Det finns också insatser för att minska djurförsök. REACH-lagstiftningen (EG 1907/2006) i Europeiska unionen har till exempel bestämmelser avsedda att minska djurförsök. Bestämmelserna omfatta ett krav att företag dela data för att undvika animaliskt testning och godkännande från Europeiska kemikaliemyndigheten före utföra föreslagna tester på djur. Enligt bestämmelserna i REACH, bör djurförsök vara en sista utväg. Det finns också Europeiska kosmetikaförordningen (EG 1223/2009) att fasas ut provning av kosmetika på djur. När djurförsök genomförs, de styrs av principerna om 3R (förfining, minskning och byte), som ger en ram för utför humanare djurförsök, att minska antalet djur som används och använda alternativ till djurförsök där så är möjligt. Av dessa skäl har inom toxikologi velat anta in vitro- analyser som kan ge insikt i molekylära mekanismer för toxicitet och kan göras i högre genomströmning4. Detta är en funktionell toxikologi strategi där gifter definieras av deras funktion snarare än enbart av deras kemi. Tagit ett steg längre, funktionella toxikogenomik försöker förstå de roller som specifika gener spelar i effekterna av gifter5. Med tillämpning av siRNA teknik, kan skärmar att undersöka geners funktion i de molekylära och cellulära svar på gifter göras med högt dataflöde. siRNA är dubbel stranded RNA-molekyler som är 19-25 nukleotider långa som utnyttja post transkriptionell gen tysta vägen i alla däggdjursceller6. Dessa är syntetiskt gjort och utformade för att rikta en specifik gen. När införs i en cell, siRNA bearbetas och en strand, guide strand, läses in i RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC). SiRNA leder RISC till en kompletterande region i en mRNA-molekyl, och RISC försämrar mRNA. Detta resulterar i en minskning av uttryck av specifika genen. Den resulterande minskningen av uttryck av specifika genen kan sedan studeras i toxiska exponerade cellerna att kontrollera funktionen av denna gen den cellulära svar på den för människor. Ett sådant tillvägagångssätt har använts för att ytterligare förstå mekanismerna i ricin känslighet och AHR-beroende framkallande av CYP1A17,8.

Listan kemisk Terrorism Risk bedömning (CTRA) och toxiska industrikemikalier (TIC) listor har specificerade Välj kemikalier baserat på deras toxicitet och potential att släppas under en terrorist, krigföring, eller industriolycka händelse9. Vi tillämpar en siRNA hög genomströmning screening (HTS) toxikogenomiska inställning till studien av CTRA lista gifter, som identifierats vara hög risk för användning i en terrorist incident. Traditionella toxikologi syftar till att förstå de negativa effekter som kemikalier har på levande organismer. Vi har dock en ytterligare önskan att förstå mekanismerna bakom skadan för att informera utvecklingen av läkemedel och terapier, och eventuellt att upptäcka molekyler som kan inriktas för terapeutisk utveckling. Denna insats på något sätt kan anses jämförbar med användning av hög genomströmning siRNA screening och cellbaserade analyser i drug discovery process10. En stor skillnad skulle vara att läkemedelsutveckling syftar vanligtvis ett singular mål för terapeutiska upptäckt i vår strategi är det något osannolikt att det skulle finnas ett singular mål med högt terapeutiskt värde för behandling av toxiska exponering. Vi räknar med att någon effektiv behandling paradigm för toxiska exponering skulle kräva en mångfacetterad strategi att uppnå höga terapeutiska värde, och toxikogenomiska data kan oerhört informera en effektiv behandling-paradigm.

Bänkmonterade automation tar hög genomströmning metodik till laboratorier utanför i farmaceutiska eller biotech industri. In vitro- studier vid våra institute har historiskt traditionella analyser som är låg genomströmning11,12,13. I de senaste åren, har vårt laboratorium övergått till användningen av bänkmonterade robotics att utföra hög genomströmning siRNA screening. Häri, presenterar vi förfining av okulär cellmodeller och utvecklingen av in vitro- exponering metoder för vätefluorid (HF) och klorpikrin (CP) lämpar sig för hög genomströmning siRNA screening. Vårt mål är att identifiera molekyler som reglerar cellulär skada som svar på dessa gifter. Målen i siRNA biblioteket vi valt inkluderar G-proteinkopplade receptorer, proteinkinaser, proteaser, fosfataser, jonkanaler och andra potentiellt druggable mål. HF och CP valdes ut för studien av korsreferenser CTRA lista agenter med ToxNet rapporter av industriolyckor att hitta de som medför störst risk för okulär skada via vapor exponering9,14. CP (kemisk formel Cl3CNO2, CAS-nummer 76-06-2) användes ursprungligen som en tårgas i WWI15. Det används för närvarande som en jordbruks fumigant och funktioner som en nematicid, fungicid och insektsmedel16. Vätefluorid (HF) används i processer inklusive alkylering i oljeraffinaderier och elektrokemiska fluorination organiska föreningar17. HF (kemisk formel HF, CAS-nummer 62778-11-4) är en gas men i dess vattenhaltiga form är fluorvätesyra (HFA, CAS nummer 7664-39-3). Därför valde vi att använda HFA i vår i cell exponering modeller. SV40 stora T antigenet förevigade mänsklig korneal epitelial cell linje SV40-HCEC valdes ut för studien. Cellernas viabilitet och inflammatorisk markör IL-8 valdes som slutpunkter eftersom mål som är involverade i cellulär skada bör återspeglas i celldöd och det inflammatoriska svaret. Specifikt, om ett mål var en skyddande roll i toxiska exponering, bör celldöd och/eller inflammatorisk cytokin produktion öka när målet uttrycket hämmas av siRNA. Motsatsen skulle vara sant för mål som en negativ roll. Också, kronisk inflammation tycks spela en roll i hornhinnan patologi efter exponering och ingripande i cell death vägar kan förbättra kliniskt utfall2,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell kultur underhåll

  1. Växer cellinje SV40-HCEC vid 37 ° C, 5% CO2och 90% luftfuktighet i DMEM F-12 med 15% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 10 µg/L epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 5 mg/L insulin.
  2. Passage av cellinje var 3 till 4 dagar (beroende på sådd densitet) för att säkerställa att konfluens aldrig överskrider 80% under kultur underhåll.
  3. Lossa cellerna från kolvar med en avlossning lösning (14 mL lösning för varje 150 cm2 kolv) och inkubation vid 37 ° C i mer än 8 min.
  4. Neutralisera avlossning lösningen med en lika stor volym cellodlingsmedium och pellet cellerna i 50 mL koniska rör genom centrifugering för 7 min vid 160 x g.
  5. Återsuspendering cellpelleten i medium (20 mL för varje 150 cm2 kolv).
  6. Räkna cellerna med en automatiserad handhållna cell counter och utsäde i nya kolvar med en täthet som gör det möjligt för dem att växa för 3 till 4 dagar utan att överskrida 80% konfluens.

2. platta celler för experiment

  1. Kontrollera kolvarna av SV40-HCECs av fas kontrast ljusmikroskopi att säkerställa att konfluens är mindre än 80% och att bedöma allmänna cell hälsa.
  2. Lossa, pellet, Omsuspendera och räkna SV40-HCECs från kolvar som beskrivs i steg 1,3 till 1,6 cell kultur underhåll. Använd SV40-HCEC medel innehållande 0,5 µg/mL hydrokortison (HCORT medel) för att resuspendera cellerna.
  3. I en disponibel medelstor flaska, Preparera en suspension av SV40-HCECs vid 17,857 celler/mL i förväg värmde HCORT medium.
    1. Förbered en tillräcklig volym cellsuspension på antalet plattor att dirigeras.
    2. Utsäde minst 14 x 96 brunnar med celler för varje siRNA bibliotek plattan som ska studeras.
  4. Snurra flaskan för att jämnt avbryta cellerna, häll en tillräcklig volym av cellsuspensionen i en reservoar på orbital shaker boet av en automatiserad flytande hanterare och Förvara flaskan som innehåller cellsuspension på en 37 ° C uppvärmningen plattan under cell plätering processen.
  5. Använd automatiserade flytande hanteraren att lägga till celler till plattor med en täthet av 1000 celler per brunn (5000 celler/cm2) i 70 µL av medium per brunn av en plattan med 96 brunnar. Använda en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg.
    1. Kör den roterande blandare vid 100 rpm ständigt under sådd.
    2. Blanda cellsuspensionen tre gånger (140 µL mix-volym) med automatiserade flytande hanterare.
    3. Aspirera 140 µL cellsuspension och fördela 70 µL i varje brunn av två cell kultur plattor.
    4. Upprepa steg 2.5.3 och 2.5.4 tills alla plattor har varit seedade med celler.
    5. Fylla reservoaren cell suspension som behövs under sådd.
  6. När plattorna har varit seedade, ta bort dem från den automatiserade flytande handler och inkubera dem i 30 min i rumstemperatur innan du överför dem till en cell kultur inkubator.
  7. Utvärdera cell densiteten av varje brunn för varje platta morgonen därpå använder ett automatiserat imaging system som är inrymt i en cell kultur inkubator och utesluta alla plattor från studien som har invändig brunnar som inte är mellan 15% och 22% konfluenta.

3. transfect celler med siRNA

  1. Förvärva siRNA bibliotek plattor från leverantören förkonfigurerad för att innehålla 80 siRNA mål per platta (se figur 4), med kolumnerna 1 och 12 tomt.
  2. Beredes siRNA bibliotek plattan med siRNA buffert till en slutlig koncentration på 2 pmol/µL för varje brunn siRNA enligt tillverkarens instruktioner19.
  3. Transfect cellerna 24 h efter sådd med 4 pmol/väl av siRNA och 0,3 µL per brunn transfection reagens. Utföra alla steg enligt transfection reagens tillverkarens protokollet (se figur 4 för plattan layout)20.
    1. Utföra alla de transfections med en automatiserad flytande hanterare och använda en 25 µL/s pipettering hastighet för alla steg. Använda förkonfigurerade tip boxar för att adressera endast brunnarna som kommer vara transfekterade.
    2. Använda upp hälften av bibliotek plattan till transfect sex replikera tallrikar benämns ”topp plattan Set” (sex replikat per siRNA, n = 6).
    3. Använd den nedre hälften av bibliotek plattan till transfect en annan uppsättning sex replikera plåtar benämns ”botten plattan Set” (sex replikat per siRNA, n = 6).
    4. Använda termen ”Full tallrik Set” för att beskriva 12 cell plattorna som har transfekterats med bibliotek siRNA.
    5. Transfect brunnar B2-B6 i alla plåtar i Full tallrik Set med negativa pool siRNA efter alla topp och botten plattan uppsättningar har transfekterats med bibliotek siRNA.
    6. Också transfect brunnar B2-B6 i en annan två plattor, som inte får biblioteket siRNA och kommer att fungera som oexponerade kontroller (en för den övre plattan) och ett för botten plattan set, med negativa pool siRNA.
  4. Inkubera alla cell plåtar i en cell kultur inkubator i 4 timmar efter alla transfection mixar har lagts och mix av mild knacka varje timme.
  5. Använda en automatiserad flytande hanterare att tvätta alla brunnar i plattorna två gånger med pre värmde HCORT medium spädd 1:5 i PBS. Använda en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg.
    1. Aspirera 100 μl från varje brunn och kassera som in en avfall reservoaren.
    2. Lägg till varje väl 100 µL per brunn före värmde HCORT medium spädd 1:5 i PBS som ingår i en annan reservoar på en tillräcklig volym för antalet plattor.
    3. Upprepa steg 3.5.1 och 3.5.2 för varje platta.
      1. Tömma reservoaren avfall som behövs.
      2. Fyll behållaren med HCORT medium spädd 1:5 i PBS som behövs.
    4. Aspirera 100 μl från varje brunn och kasta det in i avfall reservoaren.
  6. Refeed alla brunnar i plattorna med 100 µL per brunn före värmde HCORT medium, som ingår i en annan reservoar på en tillräcklig volym medium för antalet plattor.
    1. Fyll på behållaren med medium som behövs.
  7. Använda brunnar C2-C6 i alla plattor som icke-transfekterade kontroller.
  8. Håll brunnar B7-B11 och C7-C11 av alla plattor icke-transfekterade för att användas som läkemedel och fordonets kontroller för toxiska exponering.

4. refeed cellerna följande dag

  1. Använda en automatiserad flytande hanterare till refeed alla brunnar av plattorna. Använda en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg.
    1. Aspirera 100 μl från varje brunn och kassera som in en avfall reservoaren.
    2. Refeed varje väl med 100 µL per brunn före värmde HCORT medium som finns i en annan behållare och har en tillräcklig volym på medium för antalet plattor att vara görs.
    3. Upprepa steg 4.1.1 och 4.1.2 som behövs för att refeed alla cell plattor.
      1. Tömma reservoaren avfall som behövs.
      2. Fyll på behållaren med medium som behövs.

5. positiv kontroll tillägg

  1. Två dagar efter transfection och två timmar före exponering, Bered en 62,5 µM av den positiva kontrollen cardamonin i HCORT medium att användas för HFA exponeringar och lägga till rad B i en 8-rad utspädning reservoar.
    1. CP exponering, förbereda och använda en 25 µM lösning av SKF 86002.
    2. Förbereda en volym positiva kontrollen tillräcklig för antalet plattor som ska testas.
  2. Förbereda en 0,625% lösning av DMSO i HCORT medium (kontroll av fordon) och Lägg till rad C i samma reservoaren.
    1. CP exponering, förbereda och använda en lösning av DMSO 0,5%.
    2. Förbereda en volym av fordonskontroll tillräckligt för antalet plattor som ska testas.
  3. Använd automatiserade flytande hanteraren lägga till positiva och fordonets kontroller i brunnar B7-B11 och C7-C11 av varje cell platta och använda en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg. Använda förkonfigurerade tip boxar för att adressera endast brunnarna som får kontrollerna positiva och fordon.
    1. Ta bort 10 µL av medium från brunnar B7-B11 och C7-C11 av varje cell platta och kasta den i rader G och H i reservoaren 8-rad utspädning.
    2. Överför 10 µL av kontrollerna positiva och fordon till dessa brunnar och blanda 3 gånger.
  4. Tillbaka dessa cell plåtar till inkubatorn.
  5. Upprepa steg 5.3 till 5.4 tills alla cell plattor har fått positiva och fordonets reglage.

6. HF exponering av odlade celler

Varning: HFA är frätande och akut giftiga.

  1. Utföra alla kemisk exponering operationer i kemiska spiskåpa bär dubbla nitrilhandskar, laboratorierock, disponibel polyeten Ärmskydd och skyddsglasögon.
    1. Förvärva HFA som 48% lösning.
    2. Späd HFA till 1% med ultrarent vatten och förvara i 5 mL alikvoter i 10 mL tjock vägg polyeten flaskor att förbättra säkerheten.
    3. Dekontaminera pipettspetsar och reservoarer som har kommit i kontakt med HFA och eventuella överblivna flytande HFA med 2,5% kalciumglukonat före bortskaffande i farligt avfall strömmen.
  2. För varje siRNA bibliotek plattan under utredning, förbereda en 0,0036% HFA medium lösning genom att lägga till 288 µL av 1% HFA till 80 mL före värmde HCORT medium i en 150 mL flaska.
    1. Snurra flaskan och inkubera i utspädd HFA i en 37 ° C inkubator i den kemiska dragskåp i 10 min.
  3. Blanda HFA medium lösningen igen genom omskakning flaskan och lägga HFA medium lösningen till en reagens reservoar på en tallrik som är varmare.
  4. Utföra exponering med två tekniker som arbetar i tandem.
    1. Har teknikern på den högra aspirera 100 µL från varje interiör brunnarna cell platta använder vi rekommenderar att en 12 kanal och sedan passera plattan till teknikern till vänster.
    2. Har teknikern till vänster Tillsätt 100 µL per brunn av HFA medium lösningen.
    3. Upprepa steg 6.4.1 och 6.4.2 för alla cell-plattor som ska utsättas för människor.
    4. Också upprepa steg 6.4.1 och 6.4.2 för oexponerade kontrollplattor, utnyttja färsk HCORT medium i stället för HFA medium lösningen.
  5. Placera plåtarna i kemisk rök hood inkubatorn i 20 min och sedan tillbaka dem till cell kultur inkubatorn.
  6. Upprepa positiva kontrollen tillägg (steg 5.1 till 5,5) som tidigare visat när alla plattor har utsatt och återvände till cell kultur inkubatorn.

7. CP exponering av odlade celler

Varning: CP är akut giftigt och irriterande.

  1. Utföra alla kemisk exponering operationer i kemiska spiskåpa bär dubbla nitrilhandskar, laboratorierock, disponibel polyeten Ärmskydd och skyddsglasögon.
    1. Förvärva CP.
    2. Späd CP till 5% i DMSO och lagra i 10 mL alikvoter i 10 mL injektionsflaskor av scintillation att förbättra säkerheten.
    3. Dekontaminera pipettspetsar och reservoarer som har kommit i kontakt med CP och eventuella överblivna flytande CP med 2,5% natrium bisulfite före bortskaffande i farligt avfall strömmen.
  2. Förbereda en tillräcklig volym före värmde HCORT medium innehållande 1 x penna/Strep och pre värmde PBS för antalet plattor att exponeras.
  3. För varje topp plattan inställd eller bottenplattan, tillsätt 8.04 µL av 5% CP i DMSO till en 50 mL alikvot pre värmde HCORT medium och blanda väl till en slutkoncentration CP 0,0008%. Förslut röret tätt och inkubera lösningen i en 37 ° C inkubator i den kemiska dragskåp för 1 h.
    1. Tid tillägg av CP till de 50 mL alikvoter av medium så att varje utsatt topp plattan inställd och botten plattan inställd får människor exakt 1 h efter CP lades till 50 mL alikvoten av medium.
  4. Ta bort en topp plattan inställd och 1 oexponerad kontrollplattan från cell kultur inkubatorn och placera dem i den kemiska dragskåp nära slutet av inkubationstiden.
  5. Blanda den CP-lösningen genom att vända tuben och sedan Dekantera det att en reagens reservoir i slutet av 1 h inkubationstiden.
  6. Utföra exponering med två tekniker som arbetar i tandem.
    1. Har teknikern på den högra aspirera 100 µL från varje interiör brunnarna cell platta använder vi rekommenderar att en 12 kanal och sedan passera plattan till teknikern till vänster.
    2. Har teknikern till vänster Tillsätt 100 µL per brunn av CP medium lösningen.
    3. Upprepa steg 7.6.1 och 7.6.2 för alla cell plattor av topp plattan Set att utsättas för människor.
    4. Också upprepa steg 7.6.1 och 7.6.2 för oexponerade kontrollplattor, utnyttja färsk HCORT medium i stället för CP medium lösningen.
  7. Lägg plattorna i en 37 ° C inkubator i den kemiska dragskåp i 10 min.
  8. Lägga till en tillräcklig volym av PBS och HCORT medium innehållande 1 x penna/Strep till reagens reservoarer nära slutet av 10 min inkubationstiden.
  9. Ta bort CP lösningen från cell plattor använder vi rekommenderar att en 12 kanal och ersätta det med 100 µL per brunn PBS i slutet av 10 min inkubationstiden.
  10. Omedelbart ta bort PBS från cell plattor och ersätta det med 100 µL per brunn HCORT medium innehållande 1 x penna/Strep.
  11. Också upprepa steg 7,9 och 7.10 för de oexponerade kontrollplattor.
  12. Returnera cell plattorna till en vanlig cell kultur inkubator.
  13. Upprepa steg 7,3 till 7.12 för botten plattan Set.
  14. Upprepa positiva kontrollen tillägg (steg 5.1 till 5,5) som tidigare beskrivs när alla plattor har utsatt och återvände till cell kultur inkubatorn.

8. prova samling och Cell livskraft Assay

  1. Tjugofyra timmar efter exponering, bereda en lösning av 0,5 mg/mL MTT substrat i PBS som innehåller 10 g/L glukos och Värm till 37 ° C21. Förbereda 10 mL av substrat för varje platta att analyseras.
  2. För antalet plattor att analyseras, lägga till en tillräcklig volym MTT substratlösning i en reservoar på en automatiserad flytande hanterare.
  3. Använd automatiserade flytande hanteraren samlar in prov och lägga till MTT substrat med en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg. Förkonfigurera tip boxar för att ta itu med endast dessa brunnar analyseras.
    1. Aspirera 95 µL i medium från inre 60 brunnarna av cell plattan och insättning 42,5 µL i var och en av två 384 brunnar lagring skyltar.
    2. Omedelbart Tillsätt 100 µL per brunn MTT substratlösningen till cell plattorna och inkubera dem vid 37 ° C i en cell kultur inkubator för 1,5 h.
    3. Fyll behållaren med MTT substratlösningen som behövs.
  4. Inkubera cell plattorna vid 37 ° C i en cell kultur inkubator för 1 h.
  5. Försegla 384 brunnar lagring plattorna och lagra dem vid-80 ° C för efterföljande analys.
  6. Upprepa steg 8,3 till 8,5 för alla topp och botten plattan set och de associera oexponerade kontrollerna.
    1. Återanvända tips mellan replikat om önskat, men tvätta dem när du lägger till MTT substratlösningen och när växlar mellan plattan sätter.
  7. Efter 1 h ruvning, lägga till en tillräcklig volym av DMSO till en reservoar på en automatiserad flytande hanterare.
  8. Använd automatiserade flytande hanteraren lägga DMSO och använda en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg.
    1. Aspirera 100 µL från varje inre brunnarna av cell pläterar och kassera MTT substratlösningen till en avfall reservoar.
      1. Tömma reservoaren avfall som behövs.
    2. Radarbild varje brunn med 100 µL DMSO.
      1. Fylla reservoaren DMSO som behövs.
  9. Skaka plattorna på en tallrik shaker för 3 min.
  10. Mät absorbansen vid 570 och 690 nm med en spektrofotometer som plattan.
  11. Subtrahera bakgrunden och beräkna % cell livskraft genom att dividera de exponerade absorptionsvärdena med oexponerade kontroller. Använda den genomsnittliga oexponerad negativa pool siRNA kontrollen för att beräkna % cellernas viabilitet för alla mål.

9. åtgärd IL-8 koncentration i Cell cellkulturer

  1. Mäter koncentrationen av IL-8 i cell kultur supernatanterna använder ett nej tvätta pärla-baserad analys enligt tillverkarens instruktioner22. Skapa en assay plattan layout för att rymma prover och standardkurvan.
  2. Bort 384 brunnar lagring plattorna från-80 ° C frysen, Tina i rumstemperatur och centrifugera kort plattorna för att samla in provet i botten av brunnarna.
  3. För antalet assay plattor som ska köras, göra en tillräcklig volym av anti-IL-8 acceptor pärlor och biotinylerade anti-IL-8 antikropp i analysbuffert ingår i satsen. Använda förhållandet mellan 50 µL anti-IL8 acceptor pärlor och 50 µL av biotinylerade anti-IL8 antikroppen 9,9 mL analysbuffert.
    1. Med hjälp av en multikanalpipett, tillsätt pärla/antikropp blandning till en svart 384 brunnar lagring tallrik.
      1. Lägga till acceptorn pärla/antikropp brunnarna utsetts för användning för prover och standardkurvan enligt assay plattan layouten.
      2. Lägga till en tillräcklig volym per brunn för antalet assay plattor som ska köras.
  4. Rekonstituera IL-8 standard 1000 pg/ml med cellodlingsmedium innehållande 354 µM NaCl. Göra en tillräcklig volym för antalet assay plattor som ska köras.
  5. Gör åtta dubbla seriella utspädningar av standardkurvan.
  6. Lägga till standardkurvan i tre exemplar i lämpliga brunnar av en svart 384 brunnar lagring tallrik enligt assay plattan layouten. Lägga till en tillräcklig volym per brunn för antalet assay plattor som ska köras.
    1. På samma sätt lägga cellodlingsmedium innehållande 354 µM NaCl med IL-8 för bakgrunden mätning.
  7. Använda en automatiserad flytande hanterare för att utföra analysen. Använda förkonfigurerade tip boxar för att adressera endast brunnarna utsetts av layouten assay plattan. Använda en 50 µL/s pipettering hastighet för alla steg.
    1. Överföra 8 µL av acceptor pärla-antikropp blandningen till brunnarna av vit 384-väl grunt väl assay pläterar.
      1. Bara lägga till brunnarna utsetts för prover och standardkurvan enligt assay plattan layouten.
    2. Över 2 µL av standardkurvan till lämpliga brunnar av grunt väl assay plattorna enligt assay plattan layouten.
    3. Förbered en 3.54 M NaCl-lösning och tillsätt en tillräcklig volym för antalet plattor att analyseras till en grunt reservoar på automatiserade flytande hanteraren.
    4. Justera salt koncentration av proverna att matcha standardkurvan genom att överföra 4,5 µL av NaCl lösning till proverna i svart 384 brunnar lagring plattorna.
    5. Blanda proverna tre gånger med en blandande volym av 30 µL och överföring 2 µL av proverna till vitt grunt assay väl plattor enligt assay plattan layouten.
      1. Ändra tips mellan prov plattor.
    6. Inkubera i 1 h i mörker vid rumstemperatur.
    7. För antalet assay plattor som ska köras, göra en tillräcklig volym av acceptor pärlor i analysbuffert. Använda förhållandet mellan 200 µL av sekundära acceptor pärlor till 12,3 mL analysbuffert.
    8. En multikanalpipett Lägg till sekundära pärlor till en svart 384 brunnar lagring tallrik.
      1. Lägg till sekundära pärlor till brunnarna utsetts för användning för prover och standardkurvan enligt assay plattan layouten.
      2. Lägga till en tillräcklig volym per brunn för antalet assay plattor som ska köras.
    9. Med automatiserad flytande hanterare, överföra 10 µL av sekundära pärlor till brunnarna av vit 384-väl grunt väl assay pläterar.
      1. Bara lägga till brunnarna som fick prover och standardkurvan enligt assay plattan layouten och tvätta tips mellan varje platta.
    10. Inkubera i en timme i mörker vid rumstemperatur.
  8. Försegla analysen plattor med Rensa plattan tätningar och skanna med hjälp av en tallrik läsare kompatibel med analysen. Använda 0.2 mm avstånd mellan plattan och detektor, 180 ms excitation tid och 550 ms mättid för genomsökningen.
  9. Importera raw-data från IL-8 analyserna till ett kalkylblad.
  10. Använd automatiserade kurva passande för standardkurvan av IL-8 analyserna och sedan konvertera rådata till pg/mL för varje prov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Exponering metodutveckling

Vi raffinerade och utvärderas lämpligheten av raden mänsklig korneal epitelial cell SV40-HCEC för användning i HTS studier. SV40-HCEC var förevigade med hjälp av SV-40 stora T antigenet och var en gåva från Dhanajay Pal23. Det fanns alltför många variabler utforskas i exponering metodutveckling att presentera koncist häri, och så, bara några prover av fynd som vi tror kan vara mer allmänt tillämpliga till flera gifter presenteras.

Toxiska exponering av Spike eller utbyte av datamedium

Vi försökte inledningsvis utsätta celler av tillsatta 5 µL av en arbetande koncentration av utspädd i vatten, saltlösning eller medium till 95 µL av medium redan finns i varje brunn av celler i en plattan med 96 brunnar att uppnå den slutliga önskad exponeringskoncentrationen för människor. SV40-HCEC utsattes använder denna spike exponera/refeed metodik till 1 X LD50 av HFA för 24 h (1 X LD50 = 0,02% HFA genom denna metod HFA spike var utspädd i medium), och wells var görs med färska medium 10 min senare. Efter 24 h, var cellerna övertäckt med MTT substrat som beskrivs ovan för cell lönsamhet analysen. Bilder fångades av photomicroscopy före lösbarhet av formazan kristallerna med DMSO. Noggrann granskning av brunnar visade att en stor grad av celldöd var lokaliserad på ett ställe, och detta är trots att plattan var skakad för 15 s omedelbart efter spettet lades till hela plattan (figur 1a). Fenomenet observerades när spettet lades till botten av den väl eller när extra på menisken. En högre förstoring bild av detta område med hjälp av fas kontrast visar att cellerna finns kvar i området ofärgade av MTT (figur 1b). Vi testade även ett utbyte av datamedium exponera/refeed metodik där medium togs bort från brunnarna, ersatt med cellodlingsmedium innehållande 1 X LD50 av HFA (1 X LD50 = 0,035% HFA genom denna metod) och brunnar var görs med färska medium 10 min senare. Efter 24 h, var cellerna övertäckt med MTT substrat som beskrivs ovan. Denna metod uppnådde en tydligen mer även cell death svar av celler i varje brunn (figur 1 c och 1 d). Oexponerade kontroller tillhandahålls för referens och visar ingen lokaliserade områden av celldöd (figur 1e och 1f). För exponeringar som CP ledde metoden spike inte till en stor grad av celldöd lokaliserad till en plats inom varje brunn; cell death svaret var dock mer konsekvent från en iteration till nästa metoden utbyte av datamedium exponering (inga data anges).

Figure 1
Figur 1 : Celldöd som orsakas av insamling och utbyte av datamedium exponering metoder. Alla bilder var tagna 1,5 h efter tillägg av MTT substrat. Panelen (a) är en ljusa fältet bild av SV40-HCEC utsätts för HFA spike exponera/refeed metodik. Panelen (b) är en högre förstoring av samma brunnen i panelen (a) använda faskontrast. Panelen (c) är en ljusa fältet bild av SV40-HCEC exponeras av utbyte av datamedium exponera/refeed metodik. Panelen (d) är en högre förstoring av samma brunnen i panelen (c) använda faskontrast. Paneler (e) och f är från en oexponerad väl, ljusa fält och fas kontrast högre förstoring, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Toxiska stabilitet i Medium

Det observerades att när utspätt i medium, uppenbara cytotoxiciteten hos HF och CP ändras och sedan stabiliserar. HFA var utspädd i medium till 0,0036% och inkubera vid 37 ° C i 1-60 min före exponera SV40-HCECs som beskrivs ovan. För HFA ökar cytotoxiciteten inom de första 5 min som HFA är utspätt i medium och är sedan stabilt i minst en timme (figur 2a). Envägs ANOVA följt av Dunnetts flera jämförande Test visade att % cellernas viabilitet vid alla tidpunkter skilde sig avsevärt från 1 min tidpunkt. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan 2,5 till 60 min tidpunkter. CP är ekologiskt och späds först till 5% i DMSO. Det var sedan utspätt i medium till 0,0008% och inkubera vid 37 ° C i 5-120 min före exponera SV40-HCECs som beskrivs ovan. När utspätt i medium, cytotoxiciteten hos CP minskar över 60 min och sedan stabiliserar för minst nästa h (figur 2b). Envägs ANOVA följt av Dunnetts flera jämförande Test visade att % cellernas viabilitet vid alla tidpunkter skilde sig avsevärt från 5 min tidpunkt. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan 60-120 min tidpunkter.

Figure 2
Figur 2 : Toxiska förlust av cytotoxicitet i medelstora spädningar. Data uttrycks som ett genomsnitt av den procentuella viabilitet ± SD (n = 6). Panelen (a) visar stabilitet 0,0036% HFA cytotoxicitet när utspätt i medium och inkuberas i rumstemperatur i 1-60 min före exponera SV40-HCECs som beskrivs ovan. (B) visar stabilitet 0,0008% CP cytotoxicitet när utspätt i medium och inkubera vid 37 ° C i 5-120 min före exponera SV40-HCECs som beskrivs ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Exponera/Refeed eller exponera endast

En annan faktor som undersökts i exponering metod var att: A) lägga till människor för 10 min, tvätta, refeed, ta bort plattorna från den kemiska spiskåpa, och inkubera 24 h i en vanlig cell kultur inkubator (exponera/refeed metod). eller B) lägga till för människor, lämna det på, ta bort plattorna från den kemiska spiskåpa och inkubera 24 h i en vanlig cell kultur inkubator (exponera enda metod). Säkerhet är en viktig faktor som inte kan det vara tillåtet att ta bort plattor av celler som innehåller utspädda för människor från den kemiska dragskåp eftersom den för människor kommer off-gas och utsätta personal. Relaterad ersättning är antalet plattor att exponeras vid en given tidpunkt sedan mer plattorna finns, det blir en större volym off-gasning. I våra HTS metoder utsätter vi 48 x 96 brunnar i en studiedag. Vi placerade exponerade cell kultur plattor i en försluten påse och sedan används kolorimetriska gas detektor rör för att bedöma CP och HF off-gasning från frilagda plattor. Vi hittade att utsätta 48 tallrikar till 1 x LD50 av HFA inte resulterade i någon detekterbar HF off-gasning (inga data anges). För exponeringar som CP hittade vi att det var nog CP off-gasning från 48 plattor utsätts för 1 x LD50 att presentera åtminstone några säkerhetsrisker (inga data anges). Både exponera/refeed och exponera endast metoder utvärderades för HFA exponeringar. SV40-HCEC celler utsattes för HFA och lönsamhet bedömdes genom MTT assay 24 h efter exponering. Dosen svar iterationer utfördes på olika dagar. Jämfört med metoden exponera/refeed (figur 3a), hittade vi att exponera enda metoden produceras mer enhetliga cell livskraft analysens resultat (figur 3b). Därför valdes denna metod som en del av den slutliga exponeringsscenariot metoden. För CP, eventuella skillnader i cell livskraft assay resultaten överensstämmer mellan de två olika exponering metoderna kunde inte utvärderas eftersom säkerhetsproblemen uteslutet att ta bort CP utsätts plattorna från den kemiska spiskåpa för 24 h inkubering i en standard cell kultur inkubator.

Figure 3
Figur 3 : Exponering konsekvens med exponera/refeed och exponera endast metoder. Data uttrycks som ett genomsnitt av den procentuella viabilitet ± SD (n = 6). (a) HFA var utspädd i medium, inkuberas vid rumstemperatur i 10 min och sedan brukade utsätta celler av metoden exponera/refeed. (b) HFA var utspädd i medium, inkuberas vid rumstemperatur i 10 min och sedan används för att exponera SV40-HCEC av metoden exponera bara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cell modell förfining

Medelstora beståndsdelar

Vi följt de kultur-villkor som fastställts av de ursprungliga utredarna för passage och underhåll av dessa cellinjer; men ändrade vi dem för celler i experimenterande. Den cellodlingsmedium som ordinerats av ursprungliga utredarna för SV40-HCEC cellerna innehåller inte hydrokortison, men utnyttjade vi en låg nivå av hydrokortison (0,5 µg/mL) under exponeringsstudier att undertrycka den tillfällig stegring i cytokin produktion sett i naiva SV40-HCEC (inga data anges) som påverkas negativt analys av data från en iteration till nästa vid förfining studierna.

Fenotypiska stabilitet

Under vår cell modell förfining studier, fann vi att den SV40-HCEC börjar har minskad cytokin produktion i svar på toxiska exponering börjar runt passagen nummer 60 (inga data anges). Av denna anledning vi underhålls cryostocks låg passage celler, avrättades alla studier med hjälp av celler under passagen nummer 60, och övervakas cytokin produktion under granskningsprocessen.

Skylt Layout

En viktig källa till experimentell variation i hög genomströmning studier är kanteffekter av plattor med flera. Vi hittade att cytokin svar av celler i kanten brunnar inte var förenliga med eller motsvarar, interiör brunnar i båda HFA och CP studier (inga data anges). Median polska av data, en statistisk övning som används för att minimera kanteffekter på en datamängd, inte tillräckligt problemet (inga data anges). Därför användes inga cell platta kanten brunnar för experiment eller kontroller (figur 4).

Figure 4
Figur 4 : Bibliotek och cell plattan layouter. De grå skuggade områdena i layouten bibliotek plattan representerar brunnar som innehåller siRNA. Vita brunnarna är tomma. De 40 mål från rader A-D på bibliotek plattan används i ”topp plattan Set”, och de 40 mål från rader E-H av bibliotek plattan används i ”botten plattan Set”. Wells B2-B6 används för negativa pool siRNA kontroller. Wells C2-C6 är icke-transfekterade. Wells B7-B11 används för antingen cardamonin eller SKF 86002 positiv kontroll droger som beskrivs, och wells C7-C11 används för kontroll av fordon DMSO. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I Vitro modellvalidering för HTS

Vi använde Z' faktor analys för att fastställa lämplighet av SV40-HCEC för användning i HTS studier som denna statistiska test används för att fastställa analysens kvalitet för HTS24. För HF Z' faktor analys, celler var seedad på 1,25 x 103 celler per brunn, transfekterade med negativa pool siRNA (enligt ovan) 24 h efter sådd och exponerade 48 h efter transfection 0,0036% HFA (1 x LD50), n = 3. För CP Z' faktor analys, celler var seedad transfekterade som beskrivs ovan och utsatt 48 h efter transfection 0,0008% CP (1 x LD50), n = 5. En större n användes för CP studierna på grund av det större variabilitet i exponering modellen. Z' faktor beräknades för IL-8 uttrycket data från oexponerade vs. utsatt celler och negativa pool siRNA transfekterade oexponerad vs. utsatt celler för CP och HFA exponeringar. Vi analyserade också icke-transfekterade celler för att avgöra om det fanns en effekt på analysens kvalitet på grund av siRNA transfection. Många iterationer av validering studierna utfördes samtidigt finjustera exponeringen och odlingsbetingelser i ett försök att maximera Z' faktor resultat. SV40-HCEC passerat giltighet och de flesta iterationer hade Z' faktor värden större än 0,50 för HF exponeringar (tabell 1) och CP exponeringar (tabell 2). Varje replikat i dessa tabeller var från celler pläterade på olika dagar.

Exponering för Z'-faktor analysen.
Rep. #1 Rep. #2 Rep. #3
HF-exponerade negativ kontroll vs. oexponerad negativ kontroll 0,68 0,5 0,56
HF-exponerade jämfört naiv 0,4 0,68 0,56

Tabell 1: SV40-HCEC HFA exponering Z' faktor analys av IL-8

Exponering för Z'-faktor analysen.
Rep. #1 Rep. #2 Rep. #3
CP-exponerade negativ kontroll vs. oexponerad negativ kontroll 0,6 0,18 0,46
CP-exponerade jämfört naiv 0,42 0,29 0,42

Tabell 2: SV40-HCEC CP exponering Z' faktor analys av IL-8

Primära siRNA Screening resultat av HFA skadade celler

Transfection optimering studier utfördes före screening och siRNA inriktning cyklofilinhämmarna b användes för dessa studier. Ett i situ RNA detection test användes för att mäta cyklofilinhämmarna b mRNA nivåer, och en hög content analyzer användes att kvantifiera resultaten. Vi uppnått nära 90% knockdown cyklofilinhämmarna b och vanligtvis inte mer än 5-10% cellförlust med 4 pmol siRNA per brunn och 0,3 µL per brunn transfection reagens (inga data anges). Större mängder siRNA faktiskt resulterat i sämre cyklofilinhämmarna b knockdown (inga data anges). Liknande nivåer av knockdown uppnåddes med 1,2 pmol/väl siRNA och 0,09 µL per brunn transfection reagens, men vi valde att använda 4 pmol per brunn för att ta itu med alla mål som kan kräva större mängder siRNA att uppnå effektiva knockdown. Målet knockdown kinetik utvärderades också, och det observerades att målet knockdown var maximal av två dagar efter transfection (inga data anges). Målet knockdown konsekvens över plattan var också validerade (inga data anges). De antiinflammatoriska cardamonin och SKF 86002 används som positiva kontroller för hämning av cytokin produktion för HFA och CP exponering, respektive. Dessa valdes genom att testa en mängd föreningar med kända anti-inflammatoriska egenskaper i utsatta celler. Dosen utnyttjas i screening studier valdes av dosstudier svar optimering.

Den hög genomströmning siRNA screening strategi utnyttjade vi är branschstandard och innebär tre viktiga steg: 1) primärscreening, 2) bibliotek deconvolution och (3) målet validering. I primärscreening utvärderas fenotypen av varje mål genom att använda en blandning av olika siRNA sekvenser som en enda reagens att rikta varje gen. Målen är sedan ned-valt att biblioteket deconvolution. I det här steget var och en av de olika siRNA sekvenser som sammanförs för att rikta varje gen i primärscreening testas separat. Mål genomgå en annan ned-markering i målet validering där målet fenotypen bekräftas med droger, fenotyp restaurering eller siRNA från en annan leverantör. För våra primära skärmen valde vi att utföra en fokuserad sub-genomisk skärm i stället för en genome wide skärm på grund av ekonomin. Microarray data från HF och CP skadade mus hornhinnor och uppfinningsrikedom väg analys (IPA) som användes för att fokusera våra målbibliotek för den primära skärmen (manuskript i förberedelse). Kort, mus hornhinnor exponerades för toxiska ångor använder en vapor kopp liknar tidigare beskrivna metoder25. Exponerade kornea knappar och reglage skördades vid olika tid punkter efter exponering. RNA isolerades och kvalitet och mängd RNA övervakas. Alla microarray experiment utfördes enligt tillverkarens protokoll26. Råa signalen stödnivåer var normaliserade och analyseras av principalkomponentanalys (PCA) för att fastställa betydande källorna av variabiliteten i uppgifterna. Generna var rank som beställts av statistisk signifikans. Data var minerade och jämfört gen listor över förkonfigurerade siRNA bibliotek. Från dessa gen listor valt vi 3120 mål för screening. SiRNA biblioteket den visades SV40-HCEC celler (se figur 5 för ett flödesschema för HTS protokollet för den primära skärmen). Endpoint bedömningar ingår IL-8 nivåer i cellodlingsmedium av nr-tvätta pärla-baserad analys och cellernas viabilitet av MTT-analysen. Celler exponerades för 0.0036%HFA, som tidigare beskrivits, vilket är ungefär 1 x LD50. Cellernas viabilitet bedömdes av MTT assay 24 h efter exponering. Effekten av varje siRNA pool på cellernas viabilitet analyserades för statistisk signifikans i förhållande till genomsnittet i exponerade negativ pool för varje platta med strikt standardiserade genomsnittliga skillnaden (SSMD)27. En dual-ficklampa tomt på den SSMD och cell livskraft-faldig förändringen visas i figur 6. Hit urval tröskelvärdena valt för mål som förvärras celldöd eller förbättrad cellviabilitet var SSMD ≤-1.28 respektive SSMD ≥ 1.28.

Figure 5
Figur 5 : Primära skärmen HTS protokoll flödesschema. Detta flödesschema visar de viktiga steg som utförs varje dag för HTS-protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Dual-ficklampa tomt på siRNA effekt på Cell Viability of HFA-Exposed SV40-HCEC cellerna. Resultaten visas för varje mål är genomsnittet av sex replikat (n = 6). Celldata lönsamhet uttrycks som en-faldig förändring i förhållande till den exponerade negativ pool kontroll siRNA och statistisk signifikans analyserades av SSMD. Mål som hade en SSMD ≤-1.28 eller ≥ 1.28 valdes som träffar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Effekten av varje siRNA pool på HFA-inducerad IL-8 produktionen analyserades för statistisk signifikans i förhållande till det exponerade negativ pool genomsnittet för varje platta. IL-8 i cellkultur supernatant var bedömda assay 24 h efter exponering. En dual-ficklampa tomt på den SSMD och IL-8 faldig förändringen visas i figur 7. De drabbade urval tröskelvärden valt för mål som minskad produktion av IL-8 var en 40% minskning och SSMD ≤ -1,0. De drabbade urval tröskelvärden valt för mål som ökad produktion av IL-8 var en femfaldigt ökad och SSMD > 1.28.

Figure 7
Figur 7 : Dual-ficklampa tomt på siRNA effekten på IL-8 produktion av HFA-Exposed SV40-HCEC cellerna. Resultaten som visas är genomsnittet av sex replikat (n = 6). IL-8 uttryck nivå data uttrycks som en-faldig förändring i förhållande till den exponerade negativ pool siRNA och statistisk signifikans analyserades av SSMD. Träffar definierades som mål som hade en 40% minskning av IL-8 nivåer och SSMD ≤ -1,0 eller en femfaldigt ökning av IL-8 nivåer och SSMD > 1.28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument beskriver vi våra metoder och resultat på utvecklingen av en hög genomströmning hornhinnan epitelial cell screening modell för studier av HF och CP skador. Vi presenterar också resultaten från den primära siRNA skärmen för HF skada. Det fanns många utmaningar för utvecklingen av HTS modeller för studien av TIC skador. Metoder som vi kunde hitta i litteraturen relaterade till studien av HF, HFA eller CP i cell kultur modeller var till lite hjälp. Flertalet in vitro- studier på fluor jonen involvera muntliga celler och utnyttjade natriumfluorid och inte HF eller HFA (för några exempel, se28,29). Någon metod på in vitro- exponering bronkial epitelceller för CP har publicerats av Pesonen o.a. 30. Slutligen, Vi hittade inga specifika metoder i litteraturen relaterade till HTS studiet av HF, HFA eller CP och majoriteten av utmaningar och variabler med anknytning till studiet av dessa gifter i HTS krävs utveckling. Särskild uppmärksamhet ägnades till att uppnå den höga graden av exponering konsekvent över tid och många screening plattor behövs för en lyckad HTS-studie.

En typ av utmaning stött avsåg tillämpningen av människor på kultur cellsystem. Vissa ämnen är antingen reaktiva med eller instabil i vattenlösningar. De gifter som vi valt för studie betraktas inte som har dessa problem med instabilitet. En jordbruks studie undersöka photohydrolysis CP visade att en 0,001 M lösning av CP i vatten hade en halveringstid på 31,1 h när den utsätts för en 1100 lux xenon ljuskälla (solljus intensitet av en mulen dag) för 10 dagar, 12 h per dag31. Fanns inga mätbara hydrolys över den samma 10-dagarsperiod när lösningen lagrades i mörkret. Proton och fluor jonen av HFA är klart stabila i vatten. Det finns dock ytterligare stabilitet överväganden när det gäller toxiska spädningar som gjorts i cellodlingsmedium. Vi fann att det fanns en första ändring av cytotoxicitet till viss del när gifter späddes först i cellodlingsmedium som sedan stabiliserar efter en kort tid. Vi tror att detta beror på den toxiska bindande eller komplexbildande med väljare i mediet. Cell medium innehåller kalcium, magnesium, protein, etc. som är kända för att interagera med de fluor ion32,33. CP är kända för att ha oxidativa reaktioner med biologiska tioler, men det kan också binda DNA, proteiner och andra nukleofiler34,35. När dessa reaktioner och interaktioner har slutförts eller nått jämvikt, mängden tillgängliga för människor stabiliserar och således den uppenbar cytotoxiciteten stabiliserar. Vi utforskade initialt användning av saltlösning och vatten utspädningar av gifter för arbetande bestånd användas för exponeringar för att undvika toxiska interaktioner med medellång beståndsdelar i arbetande spädningar. Användning av saltlösning skulle också bevara den syrliga komponenten i HFA skada för exponeringar utförs av utbyte av datamedium. Vi fann att cell death svaren på gifter i vatten och saltlösning utspädningar var mer variabel än den metod som används cell odlingsmedium spädningar med utbyte av datamedium (inga data anges). Angående metoden exponering spike med HFA, variationen kan bero på inkonsekvens i spetsen spridning i den väl leder till cellulära mål konkurrerar med medellång beståndsdelar för tillgängliga fluor jonen. Orsakerna till variationerna i HFA exponeringar av medium utbyte med HFA saltlösning utspädningar är helt oklart. Som helst var exponering metoder med saltlösning spädningar för HFA övergiven och inte utforskat för CP. Toxiciteten hos våra HFA utspädningar i medium härmar förmodligen nära studier med natriumfluorid eftersom cellen medium buffertar gratis protonen i vår HFA spädningar.

Andra utmaningar som vi stött var relaterade till förfining av cell kultur modeller för användning i HTS. Vi fann det nödvändigt att ändra de odlingsmedium lipider för celler i experiment, särskilt hydrokortison och antibiotika. Vi utnyttjade en låg nivå av hydrokortison (0,5 µg/mL) under exponeringsstudier att undertrycka den tillfällig stegring i cytokin produktion ses i naiva SV40-HCEC. Här låg mängd hydrokortison negativt påverkade inte svaren av cellerna till för människor och var under nivåer som vanligtvis används för att undertrycka cytokin produktion av odlade celler som svar på stimulerande36,37. De exakta skälen varför naiva SV40-HCEC cellerna ibland producerar överskott cytokiner är inte kända, men det är möjligt att cellerna är steglöst känsliga för de mindre stressfaktorer som inträffar under cell passaging och plätering. Många labs omfatta rutinmässigt antibiotika i cellodlingsmedium underhåll, men vissa antibiotika, tetracykliner har särskilt visat sig uppvisar antiinflammatoriska effekter på odlade celler inklusive korneal epitelceller38. Vårt laboratorium undviker i allmänhet användningen av antibiotika när det är möjligt eftersom dessa kan potentiellt förvirra studier. Vi undersökte också fenotypiska drivan över flera passager av våra celler i kultur. Det är vanligt att förevigade celler att genomgå genetiska eller fenotypiska drift över flera passager, om inte underhålls i den exponentiella fasen, om tillåtet att nå konfluens, eller om de utsätts för vissa miljöfaktorer39,40 ,41. Därför är det kritiska under en hög genomströmning skärm som cellinjer hanteras korrekt och att skärmen är klar använder cell passage nummer som upprätthåller den kända fenotypiska svaren. Flera plattan kanteffekter är fenomenet att celler odlade i de yttre omkretsen brunnarna i plattor med flera ofta inte svarar samma eller med samma konsekvens som celler odlas i inre brunnar42. Det finns statistiska övningar, såsom median polska, som kan utnyttjas för att minimera kanteffekter på en uppsättning data43. Det finns dock ingen statistisk övning som kan eliminera kanteffekter på ett visst mål eller en kontroll om det alltid är testat i en edge Tja, och varierande layouten plattan mellan replikerar för att flytta mål eller kontroller utanför kanten brunnar är inte logistiskt praktiskt eller kostnadseffektivt. Det är vår uppfattning att beslutet att inkludera användning av kanten brunnar i cellbaserade HTS analyser bör göras med försiktighet. Vi fann det nödvändigt att eliminera användningen av celler odlade i kanten brunnar för kontroller och mål.

Vår HTS cell modell och exponering metodik för in vitro- HF skada användes till lyckosam komplett primära siRNA skärmen 3120 mål. SSMD användes för träff urval eftersom föreslogs specifikt för att mäta omfattningen av skillnaden mellan en kontroll och en siRNA27. Våra resultat för cellviabilitet visar att det fanns ett linjärt förhållande i dual-ficklampa tomten mellan SSMD och för nästan alla mål-faldig förändring. Av denna anledning använde vi det enda kriteriet av SSMD för träff urval för denna endpoint. IL-8 data skilde sig i att vissa mål hade svag men konsekvent effekter medan andra visade stark men inkonsekvent effekter. Därför använde vi både-faldig förändring och SSMD för träff urvalskriterier för denna endpoint. SSMD värdena används för träff urval för både cellernas viabilitet och IL-8 data valdes eftersom cutoffs mellan 1 och 1,645 (eller -1 och-1.65) uppnå låg falsk upptäckten och icke-discovery priser44. Det fanns några mål som var träffar både i cellernas viabilitet och IL-8 data. I dessa fall preferens för inkludering i deconvolution biblioteket gavs till de mål som utövade sina effekter i samma riktning för att förbättra allmänna hälsotillståndet (förbättrad lönsamhet och minskad IL-8) eller förvärrar skada (ökad celldöd och ökad IL-8). Sammantaget har vi valt totalt 250 mål mellan cellernas viabilitet och IL-8 slutpunkter för att kompensera deconvolution biblioteket för HF skada. Den primära skärmen för in vitro- CP skada pågår.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat exponering och odlingsbetingelser som är lämplig för HTS studiet av okulär skada av HF och CP. Flera variabler i exponering och odlingsbetingelser var förfinat och optimerat och modellerna validerades för att vara lämplig för HTS studier av Z' faktor analys. Vi har ytterligare visat nyttan av dessa modeller genom att fylla i den primära skärmen av ett siRNA bibliotek i HF-modellen. Det finns många skador och sjukdomar som är nr eller begränsat intresse att den farmaceutiska eller bioteknikindustrin, toxiska skador av CP och HF ingår, och tillkomsten av bänkmonterade robotics underlättar HTS studiet av skador och sjukdomar i praktiskt taget alla laboratorium . Hög genomisk data set kan starkt bidra till förståelsen av de roller som specifika gener spelar i skada eller sjukdom som kan bidra till att effektivare fokus Följ på in vitro- eller in-vivo studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

DISCLAIMER: de åsikter som uttrycks i denna artikel är de av författaren och återspeglar inte den officiella politiken av den avdelning av armén, försvaret eller den amerikanska regeringen. Denna forskning var stöds av en institutionsöverskridande avtal mellan NIH/NIAID och USAMRICD, och delvis av en avtalad tid till programmet deltagande forskarutbildning forskning vid US Army medicinsk forskning institutet av kemiska försvar administreras av Eken Ridge Institutet för vetenskap och utbildning genom en institutionsöverskridande avtal mellan US Department of Energy och USAMRMC.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av nationella institut för hälsa motverka Program institutionsöverskridande avtal # AOD13015-001. Vi vill tacka Stephanie Fröberg och Peter Hurst för deras insatser och expertis på videoproduktion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

Biologi fråga 136 klorpikrin vätefluorid korneal epitelceller korneal skada siRNA high throughput screening
Hög genomströmning SiRNA Screening för klorpikrin och vätefluorid-inducerad hornhinnan epitelial Cell skada
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter