Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høj overførselshastighed SiRNA Screening for Chloropicrin og hydrogenfluorid-induceret hornhinden epitelcelle skade

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Høj overførselshastighed lille hæmmende RNA screening er et vigtigt redskab, som kunne bidrage til hurtigere belyse de molekylære mekanismer i kemiske hornhinden epitelial skade. Heri, præsenterer vi udviklingen og valideringen af eksponering modeller og metoder for high throughput screening af hydrogenfluorid - og chloropicrin-induceret hornhinden epitelial skade.

Abstract

Giftstoffet-induceret okulær skade er en sand okulær nødsituation fordi kemikalier har potentiale til at hurtigt forårsage betydelige vævsskade. Behandlinger for giftstoffet-induceret hornhinde skader er generelt støttende, som ingen specifikke therapeutics eksisterer for at behandle disse skader. I bestræbelserne på at udvikle behandlinger og therapeutics at drage omsorg for eksponering, kan det være vigtigt at forstå de molekylære og cellulære mekanismer af disse skader. Vi foreslår, at udnyttelsen af høj overførselshastighed lille hæmmende RNA (siRNA) screening kan være et vigtigt redskab, som kunne bidrage til hurtigere belyse de molekylære mekanismer i kemiske hornhinden epitelial skade. siRNA er dobbelt strandede RNA molekyler, der er 19-25 nukleotider lange og udnytte den post-transcriptional genhæmning pathway for at forringe mRNA som har homologi til siRNA. Den deraf følgende reduktion af udtryk for det bestemte gen kan derefter undersøges i giftstof udsatte celler at fastslå funktionen af dette gen i den cellulære reaktion på giftstoffet. Udvikling og validering af in vitro- eksponering modeller og metoder for den høje overførselshastighed screening (HTS) af hydrogenfluorid-(HF) og chloropicrin-(CP) induceret okulær skade er præsenteret i denne artikel. Selv om vi har valgt disse to giftige stoffer, finder vores metoder anvendelse på undersøgelse af andre giftige stoffer med mindre ændringer i giftstof eksponering protokollen. SV40 store T antigen udødeliggjort menneskelige hornhindens epitel cellelinie SV40-HCEC blev udvalgt til undersøgelse. Cellernes levedygtighed og IL-8 produktion blev valgt som slutpunkter i screening protokol. Flere udfordringer forbundet med udviklingen af giftstof eksponering og celle kultur metoder egnet til HTS undersøgelser præsenteres. Etablering af HTS modeller for disse giftstoffer giver mulighed for yderligere undersøgelser til bedre at forstå mekanismen af skade og at skærmen for potentielle therapeutics for kemiske okulær skade.

Introduction

Giftstoffet-induceret okulær skade er en sand okulær nødsituation fordi kemikalier har potentiale til at hurtigt forårsage betydelige vævsskade. Desværre, behandlinger for giftstoffet-induceret hornhinde skader er kun generelt støttende som ingen specifikke therapeutics eksisterer for at behandle disse skader. Den nuværende behandlingsstrategi er uspecifikke og primært omfatter aktuelle terapeutiske behandlinger såsom smøremidler, antibiotika, og cycloplegics efterfulgt af anti-inflammatoriske (fx, steroider) engang hornhinden har re epithelialized1 ,2. Trods de bedste nuværende terapeutiske behandlingsmuligheder til rådighed er langsigtet prognose generelt dårlig på grund af progressiv hornhinde uklarhed og neovascularization2,3.

Dyremodeller har traditionelt været brugt til at undersøge kemiske toksicitet og forstå mekanismer af skade. Men dyreforsøg er tidskrævende og dyrt. Der er også bestræbelser på at reducere dyreforsøg. For eksempel, har REACH-lovgivningen (EF 1907/2006) i den Europæiske Union bestemmelser, som skal reducere dyreforsøg. Bestemmelserne omfatter et krav om, at virksomheder deler data for at undgå animalsk test og at opnå godkendelse fra Det Europæiske Kemikalieagentur inden du udfører foreslåede forsøg på dyr. I henhold til REACH, bør dyreforsøg være sidste udvej. Der er også europæiske kosmetik forordningen (EF 1223/2009), udfaset testning af kosmetik på dyr. Når animalske undersøgelser, de er styret af princippet om 3R (raffinement, reduktion og erstatning), som giver en ramme for udfører mere human animalsk forskning, reduktion af antallet af dyr, der anvendes, og ved hjælp af ikke-animalsk alternativer hvor det er muligt. Af disse grunde har inden for toksikologi søgt at vedtage in vitro- assays, der kan give indsigt i molekylære mekanismer af toksicitet og kan gøres i højere overførselshastighed4. Dette er en funktionel toksikologi tilgang, hvor giftige stoffer defineres af deres funktion og ikke udelukkende af deres kemi. Taget et skridt videre, funktionelle toxicogenomics søge at forstå de roller, at specifikke gener spiller i virkningerne af giftige stoffer5. Med anvendelsen af siRNA teknologi, kan skærme til at undersøge genfunktion i de molekylære og cellulære svar til giftige stoffer gøres på høj overførselshastighed. siRNA er dobbelt strandede RNA-molekyler, der er 19-25 nukleotider lange, drage fordel af den post transcriptional gene silencing vej til stede i alle pattedyrceller6. Disse er syntetisk fremstillet og designet til at målrette en bestemt gen. Når indføres i en celle, at siRNA er behandlet og en strand, strand guide er indlæst i RNA-induceret silencing complex (RISC). SiRNA dirigerer RISC til en supplerende region i et mRNA-molekyle, og RISC nedbryder mRNA. Dette resulterer i reduktion af udtryk for det bestemte gen. Den deraf følgende reduktion af udtryk for det bestemte gen kan derefter undersøges i giftstof udsatte celler at fastslå funktionen af dette gen i den cellulære reaktion på giftstoffet. En sådan fremgangsmåde har været anvendt til yderligere at forstå mekanismerne af ricin modtagelighed og AHR-afhængige induktion af CYP1A17,8.

Listen kemisk terrorisme risiko vurdering (CTRA) og giftige industrielle kemikalier (TIC) lister har inddelt Vælg kemikalier baseret på deres toksicitet og potentiale til at blive frigivet under en terrorist, krigsførelse eller arbejdsulykker begivenhed9. Vi anvender en siRNA high throughput screening (HTS) toxicogenomic tilgang til studiet af CTRA liste giftstoffer, som er blevet påvist for at være høj risiko for brug i et terrorangreb. Traditionel toksikologi søger at forstå de skadelige virkninger, at kemikalier har på levende organismer; Vi har dog en yderligere ønske om at forstå mekanismerne for skade med henblik på at informere udviklingen af therapeutics og terapeutiske tilgange, og eventuelt at opdage molekyler, som kan målrettes for terapeutisk udvikling. Denne indsats på nogle måder kan betragtes som svarende til anvendelsen af høje overførselshastighed siRNA screening og celle-baserede assays i drug discovery proces10. En væsentlig forskel ville være, at drug discovery typisk søger en ental mål for terapeutisk opdagelse i vores tilgang er det noget usandsynligt, at der ville være en enestående mål med høje terapeutiske værdi til behandling af giftstof eksponering. Vi forventer at nogen effektiv behandling paradigme for giftstof eksponering ville kræve en flerstrenget tilgang til at opnå høje terapeutiske værdi, og toxicogenomic data kan afgørende underrette en effektiv behandling paradigme.

Benchtop automation bringer høj overførselshastighed metode til laboratorier uden for de farmaceutiske og bioteknologiske industrier. In vitro- undersøgelser på vores Institut har historisk set været traditionelle assays, som er lav dataoverførselshastighed11,12,13. I de sidste par år, har vores laboratorium skiftet til brugen af benchtop robotteknologi til at udføre høj overførselshastighed siRNA screening. Heri, præsenterer vi forfinelse af okulær cell modeller og udvikling af in vitro- eksponering metoder til hydrogenfluorid (HF) og chloropicrin (CP) egnet til høj overførselshastighed siRNA screening. Vores mål er at identificere molekyler, der regulerer cellular personskader som svar på disse giftige stoffer. Af biblioteket siRNA vi valgt mål omfatter G protein koblede receptorer, protein kinaser, proteaser, fosfataser, ionkanaler og andre potentielt druggable mål. HF og CP blev udvalgt til undersøgelse af krydshenvisninger CTRA liste agenter med ToxNet rapporter om industriulykker at finde dem, der udgør den største risiko for okulær skade via damp eksponering9,14. CP (kemisk formel Cl3CNO2, CAS-nummer 76-06-2) blev oprindeligt brugt som en tåregas i WWI15. Det er i øjeblikket bruges som en landbrugs fumigeringsmidler og funktioner som en nematicid, fungicider og insekticider16. Hydrogenfluorid (HF) bruges i processer, herunder alkylering i olieraffinaderier og elektrokemiske fluorination af organiske forbindelser17. HF (kemisk formel HF, CAS-nummer 62778-11-4) er en gas, men i dens vandige form er flussyre (HFA, CAS-nummer 7664-39-3). Derfor, vi valgt at bruge HFA i vores i celle eksponering modeller. SV40 store T antigen udødeliggjort menneskelige hornhindens epitel cellelinie SV40-HCEC blev udvalgt til undersøgelse. Cellernes levedygtighed og inflammatorisk markør IL-8 blev valgt som slutpunkter fordi mål, der er involveret i cellulære skader bør afspejles i celledød og det inflammatoriske respons. Specielt, hvis mål var en beskyttende rolle i giftstof eksponering, bør celledød og/eller inflammatorisk cytokin produktion øge når målet udtryk er hæmmet af siRNA. Modsat ville være tilfældet for mål, spiller en negativ rolle. Kronisk inflammation synes også, at spille en rolle i hornhinden patologi efter eksponering og intervention i celle død veje kan forbedre kliniske resultater2,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur vedligeholdelse

  1. Vokse cellelinie SV40-HCEC ved 37 ° C, 5% CO2og 90% luftfugtighed i DMEM F-12 med 15% føtal bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 10 µg/L epidermal vækstfaktor (EGF) og 5 mg/L insulin.
  2. Passage cellelinie hver 3-4 dage (afhængigt af seeding tæthed) for at sikre, at confluency aldrig overstiger 80% under kultur vedligeholdelse.
  3. Frigør cellerne fra kolber ved hjælp af et detachement løsning (14 mL løsning for hver 150 cm2 kolbe) og inkubation ved 37 ° C i højst 8 min.
  4. Neutralisere detachement løsning med et lige saa stort volumen af cellekulturmedium og sammenpresse cellerne i 50 mL konisk rør ved centrifugering i 7 min. ved 160 x g.
  5. Genopslæmmes celle pellet i medium (20 mL for hver 150 cm2 kolbe).
  6. Tælle celler med en automatiseret håndholdte celle counter og frø i nye kolber med en tæthed, der vil tillade dem at vokse i 3 til 4 dage uden at overskride 80% confluency.

2. plade celler for eksperimenter

  1. Check kolber af SV40-HCECs af fase kontrast lysmikroskopi at sikre, at confluency er mindre end 80% og at vurdere generelle celle sundhed.
  2. Frigøre, pellet, resuspend og tælle SV40-HCECs fra kolberne som beskrevet i trin 1.3 til 1,6 i celle kultur vedligeholdelse. Bruge SV40-HCEC medium indeholdende 0,5 µg/mL hydrocortison (HCORT medium) til resuspend celler.
  3. I en engangs mellemstore flaske, der forberedes en suspension af SV40-HCECs ved 17,857 celler/mL i pre varmede HCORT medium.
    1. Forberede en tilstrækkelig mængde af cellesuspension til antallet af plader skal forhåndsudfyldes.
    2. Frø mindst 14 x 96-brønd plader med celler for hver siRNA bibliotek plade skal undersøges.
  4. Hvirvle flasken for at jævnt suspendere cellerne, hæld en tilstrækkelig mængde af cellesuspension i et reservoir på orbitalryster reden af en automatiseret flydende handler, og gemme flasken indeholder cellesuspension på en 37 ° C opvarmning plade under celle plating proces.
  5. Bruge den automatiske flydende handleren til at føje celler til plader med en tæthed på 1000 celler pr. brønd (5000 celler/cm2) i 70 µL af medium pr. brønd af en 96-brønd plade. Bruge en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin.
    1. Kør den orbitalryster på 100 rpm konstant under seeding-processen.
    2. Bland cellesuspension, tre gange (140 µL mix bind) ved hjælp af automatiserede flydende handleren.
    3. Opsug 140 µL af cellesuspension og dispensere 70 µL i hver brønd af to celle kultur plader.
    4. Gentag trin 2.5.3 og 2.5.4 indtil alle plader har været seedet med celler.
    5. Refill celle suspension reservoir efter behov under seeding-processen.
  6. Efter pladerne har været seedet, fjerne dem fra den automatiserede flydende handler og Inkuber dem i 30 min. ved stuetemperatur før du overfører dem til en celle kultur inkubator.
  7. Evaluere celle tæthed af hver godt for hver plade den følgende morgen ved hjælp af en automatiseret billedbehandling system, som har til huse i en celle kultur inkubator og udelukke enhver plader fra den undersøgelse, som har indvendige brønde, som ikke er mellem 15% og 22% sammenflydende.

3. transfect celler med siRNA

  1. Erhverve siRNA bibliotek plader fra kreditoren pre-konfigureret til at indeholde 80 siRNA mål pr. plade (Se fig. 4), med kolonne 1 og 12 tilbage tom.
  2. Rekonstruere siRNA bibliotek plade med siRNA buffer til en slutkoncentration på 2 pmol/µL til hver brønd med siRNA ifølge producentens instruktioner19.
  3. Transfect celler 24 h efter såning med 4 pmol/brønd af siRNA og 0,3 µL/brønd Transfektion reagens. Udfør alle trin efter Transfektion reagens producentens protokol (Se figur 4 for plade layout)20.
    1. Udføre alle transfections ved hjælp af en automatiseret flydende handler, og bruge en 25 µL/s pipettering hastighed for alle trin. Bruge pre-konfigureret tip kasser til at behandle kun de brønde, der vil være transfekteret.
    2. Brug den øverste halvdelen af bibliotek pladen til transfect et sæt af seks Repliker plader omtales som "Top plade sæt" (seks replikater pr. siRNA, n = 6).
    3. Bruge den nederst halvdelen af bibliotek pladen til transfect et andet sæt af seks Repliker plader omtales som "Bunden plade sæt" (seks replikater pr. siRNA, n = 6).
    4. Bruge udtrykket "Fuld plade sæt" til at beskrive de 12 celle plader, der har været transfekteret med biblioteket siRNA.
    5. Transfect wells B2-B6 af alle plader i fuld plade sæt med negative pool siRNA efter alle øverste og nederste plade sæt har været transfekteret med biblioteket siRNA.
    6. Også transfect wells B2-B6 af en anden to plader, der ikke modtager bibliotek siRNA og vil tjene som eksponerede kontrolelementer (én for topplade sæt) og en for det nederste plade sæt, med negative pool siRNA.
  4. Inkuber alle celle plader i en celle kultur inkubator for 4 timer efter alle Transfektion blander er blevet tilføjet og blanding af blid trykke hver time.
  5. Brug en automatiseret flydende handler at vaske alle brønde af pladerne to gange med pre varmede HCORT medium fortyndet til 1:5 i PBS. Bruge en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin.
    1. Aspirér 100 µL fra hver godt og kassér, til en affald reservoir.
    2. Føje til hver godt 100 µL/brønd pre varmede HCORT medium fortyndet 1:5 i PBS, som er indeholdt i en anden reservoir på en tilstrækkelig mængde for antallet af plader.
    3. Gentag trin 3.5.1 og 3.5.2 for hver plade.
      1. Tøm affald reservoiret, efter behov.
      2. Refill reservoir med HCORT medium fortyndet til 1:5 i PBS efter behov.
    4. Opsug 100 µL fra hver godt og kassér der i affald reservoiret.
  6. Refeed alle brønde af plader med 100 µL/brønd pre varmede HCORT medium, som er indeholdt i en anden reservoir på en tilstrækkelig mængde af medium for antallet af plader.
    1. Refill reservoir med medium, efter behov.
  7. Bruge wells C2-C6 af alle plader som ikke-transfekteret kontrol.
  8. Holde wells B7-B11 og C7-C11 af alle plader ikke transfekteret for at blive brugt som lægemiddel og køretøj kontrol for giftstof eksponering.

4. refeed cellerne følgende dag

  1. Bruge en automatiseret flydende handler til refeed alle brønde af pladerne. Bruge en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin.
    1. Aspirér 100 µL fra hver godt og kassér, til en affald reservoir.
    2. Refeed hver godt med 100 µL/brønd pre varmede HCORT medium, der er indeholdt i en forskellige reservoir og har en tilstrækkelig mængde af medium for antallet af plader til at være refed.
    3. Gentag trin 4.1.1 og 4.1.2 som skulle refeed alle celle pladerne.
      1. Tøm affald reservoiret, efter behov.
      2. Refill reservoir med medium, efter behov.

5. positiv kontrol tilsætning

  1. To dage forberede efter Transfektion og to timer før eksponering, en 62,5 µM løsning af positive kontrol cardamonin i HCORT medium bruges til HFA engagementer og føje til række B af en 8-rækket fortynding reservoir.
    1. CP eksponering, forberede og bruge en 25 µM løsning af SKF 86002.
    2. Forberede et volumen på positiv kontrol tilstrækkelig for antallet af plader til at blive testet.
  2. Forberede en 0,625% opløsning af DMSO på HCORT medium (køretøj kontrol) og tilføje til række C i den samme reservoir.
    1. CP eksponering, forberede og bruge en 0,5% opløsning af DMSO.
    2. Forberede et volumen på køretøjet kontrol tilstrækkelig for antallet af plader til at blive testet.
  3. Brug den automatiske flydende hændelseshandler tilføje positive og køretøj kontrolelementer til brønde B7-B11 og C7-C11 af hver celle plade og bruge en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin. Bruge pre-konfigureret tip kasser til at behandle kun de brønde, der får positive og køretøj kontrollen.
    1. Fjern 10 µL af medium fra brønde B7-B11 og C7-C11 af hver celle plade og kassér den i række G og H i 8-række fortynding reservoir.
    2. Overfør 10 µL af positive og køretøj kontrollen til disse brønde og bland 3 gange.
  4. Returnere disse celle plader til rugemaskine.
  5. Gentag trin 5.3 til 5.4 indtil alle celle plader har modtaget positive og betjeningsanordninger.

6. HF eksponering af dyrkede celler

Forsigtig: HFA er ætsende og meget giftig.

  1. Udføre alle kemiske eksponering operationer i en kemisk stinkskab iført dobbelt nitrilhandsker, en laboratoriekittel, engangs polyethylen ærmebeskyttere og sikkerhedsbriller.
    1. Erhverve HFA som en 48% løsning.
    2. Fortyndes HFA til 1% med ultrarent vand og opbevares i 5 mL alikvoter i 10 mL tykvæggede polyethylen hætteglas til forbedring af sikkerheden.
    3. Dekontaminering pipette tips og reservoirer, der er kommet i kontakt med HFA og eventuelle rester flydende HFA med 2,5% calciumglukonat inden bortskaffelse i farligt affald strøm.
  2. For hver siRNA bibliotek plade under undersøgelsen, forberede en 0.0036% HFA medium opløsning ved at tilføje 288 µL 1% HFA 80 ml pre varmede HCORT medium i en 150 mL flaske.
    1. Hvirvle flasken og inkuberes fortyndet HFA i et 37 ° C inkubator i den kemiske stinkskab i 10 min.
  3. Bland HFA medium løsning igen af hvirvlende flasken og tilføje HFA medium løsning til et reagens reservoir på en plade varmere.
  4. Udføre eksponeringen med to teknikere, der arbejder i tandem.
    1. Har teknikeren på højre aspirat 100 µL af hver af de indvendige brønde i en celle plade ved hjælp af en 12 kanal pipette og derefter passere pladen til teknikeren til venstre.
    2. Har tekniker til venstre Tilsæt 100 µL pr. brønd af HFA medium løsning.
    3. Gentag trin 6.4.1 og 6.4.2 for alle celle plader, der er at være udsat for giftstoffet.
    4. Også Gentag trin 6.4.1 og 6.4.2 for ikke eksponerede kontrol plader, udnytte friske HCORT medium i stedet for HFA medium løsning.
  5. Læg pladerne i kemiske aftræk hood inkubator i 20 min. og derefter returnere dem til celle kultur inkubator.
  6. Gentag positiv kontrol tilføjelse trin (trin 5.1 til 5.5) som tidligere vist når alle pladerne er blevet udsat og vendte tilbage til celle kultur inkubator.

7. CP eksponering af dyrkede celler

Forsigtig: CP er akut giftige og irriterende.

  1. Udføre alle kemiske eksponering operationer i en kemisk stinkskab iført dobbelt nitrilhandsker, en laboratoriekittel, engangs polyethylen ærmebeskyttere og sikkerhedsbriller.
    1. Erhverve CP.
    2. Fortyndes CP til 5% i DMSO og gemme i 10 mL alikvoter i 10 mL scintillationshætteglas at forbedre sikkerheden.
    3. Dekontaminering pipette tips og reservoirer, der er kommet i kontakt med CP og eventuelle rester flydende CP med 2,5% natrium bisulfite inden bortskaffelse i farligt affald strøm.
  2. Forberede en tilstrækkelig mængde af præ varmede HCORT medium indeholdende 1 x Pen/Strep og pre varmede PBS for antallet af plader til at blive udsat.
  3. For hver Top plade sæt eller bundplade, tilføje 8,04 µL af 5% CP i DMSO til en 50 mL alikvot pre varmede HCORT medium og bland godt for en endelig CP koncentration af 0,0008%. Cap røret stramt og inkuberes løsning i et 37 ° C inkubator i den kemiske stinkskab for 1 h.
    1. Tid tilføjelsen af CP til 50 mL alikvoter af medium, så hver udsat Top plade sæt og nederste plade sat modtager giftstoffet præcis 1 h efter CP blev tilføjet til 50 mL alikvot af mediet.
  4. Fjerne en Top plade sæt og 1 ueksponeret kontrol plade fra celle kultur inkubator og placere dem i den kemiske stinkskab nær slutningen af inkubationstiden.
  5. Bland CP løsning ved at vende røret og derefter dekanteres det til et reagens reservoir for enden af inkubationstiden 1 h.
  6. Udføre eksponeringen med to teknikere, der arbejder i tandem.
    1. Har teknikeren på højre aspirat 100 µL af hver af de indvendige brønde i en celle plade ved hjælp af en 12 kanal pipette og derefter passere pladen til teknikeren til venstre.
    2. Har tekniker til venstre Tilsæt 100 µL pr. brønd af CP medium løsning.
    3. Gentag trin 7.6.1 og 7.6.2 for alle celle plader af Top plade sæt udsættes for giftstoffet.
    4. Også Gentag trin 7.6.1 og 7.6.2 for ikke eksponerede kontrol plader, udnytte friske HCORT medium i stedet for CP medium løsning.
  7. Læg pladerne i et 37 ° C inkubator i den kemiske stinkskab i 10 min.
  8. Tilføje en tilstrækkelig mængde af PBS og HCORT medium indeholdende 1 x Pen/Strep til reagens reservoirer nær slutningen af inkubationstiden 10 min.
  9. Fjerne CP løsningen fra celle plader ved hjælp af en 12 kanal pipette og erstatte det med 100 µL pr. brønd PBS for enden af inkubationstiden 10 min.
  10. Straks fjerne PBS fra celle plader og erstatte det med 100 µL pr. brønd HCORT medium indeholdende 1 x Pen/Strep.
  11. Også Gentag trin 7,9 og 7.10 for ikke eksponerede kontrol plader.
  12. Returnere celle plader til en standard celle kultur inkubator.
  13. Gentag trin 7.3 til 7.12 for den nederste plade sæt.
  14. Gentag positiv kontrol tilføjelse trin (trin 5.1 til 5.5) som tidligere beskrevet når alle pladerne er blevet udsat og vendte tilbage til celle kultur inkubator.

8. prøve indsamling og celle levedygtighed Assay

  1. Fireogtyve timer efter eksponering, forberede en opløsning af 0,5 mg/mL MTT substrat i PBS, som indeholder 10 g/L glukose og varme til 37 ° C21. Forberede 10 mL af substratet for hver plade skal analyseres.
  2. For antallet af plader til analyseres, skal du tilføje en tilstrækkelig mængde af MTT substratopløsning til et reservoir på en automatiseret flydende handler.
  3. Brug den automatiske flydende hændelseshandler indsamle prøve og tilføje MTT substrat ved hjælp af en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin. Forudkonfigurere tip kasser for at løse kun disse brønde til analyseres.
    1. Aspirat 95 µL i medium fra de indre 60 wells af celle plade og depositum 42,5 µL i hver af to 384-godt opbevaring plader.
    2. Straks tilføje 100 µL pr. brønd MTT substratopløsning til celle-plader og inkuberes ved 37 ° C i en celle kultur inkubator for 1,5 h.
    3. Refill reservoir med MTT substratopløsning efter behov.
  4. Inkuber celle plader ved 37 ° C i en celle kultur inkubator for 1 h.
  5. Forsegle 384-godt opbevaring plader og gemme dem på-80 ° C til efterfølgende analyse.
  6. Gentag trin 8.3 til 8,5 for alle øverste og nederste plade sæt og den tilknyttede ueksponeret kontrol.
    1. Genbruge tips mellem replikater, hvis ønsket, men vaske dem, når du tilføjer MTT substratopløsning og Hvornår skifter mellem plade sæt.
  7. Tilføje en tilstrækkelig mængde af DMSO til et reservoir på en automatiseret flydende handler efter inkubationen 1 h.
  8. Brug den automatiske flydende hændelseshandler tilføje DMSO og bruge en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin.
    1. Opsug 100 µL af hver af de inderste wells af celle plader og kassér MTT substratopløsning til en affald reservoir.
      1. Tøm affald reservoiret, efter behov.
    2. Overlay hver brønd med 100 µL DMSO.
      1. Refill DMSO reservoir efter behov.
  9. Ryste pladerne på en plade shaker i 3 min.
  10. Måling af absorbans ved 570 og 690 nm ved hjælp af en plade Spektrofotometer.
  11. Subtrahere baggrunden og beregne % cellernes levedygtighed ved at dividere de udsatte absorbans værdier af de eksponerede kontrolelementer. Bruge gennemsnittet ueksponeret negative pool siRNA kontrol til at beregne % cellernes levedygtighed for alle mål.

9. foranstaltningen IL-8 koncentration i celle kultur analysere

  1. Foranstaltning koncentration af IL-8 i celle kultur analysere ved hjælp af en no vaske perle-baserede assay ifølge producentens instruktioner22. Oprette en assay plade layout til at rumme prøver og standardkurven.
  2. Fjerne 384-godt opbevaring plader fra-80 ° C fryseren, tø op ved stuetemperatur og kortvarigt centrifugeres plader for at indsamle prøven i bunden af brøndene.
  3. For antallet af assay plader til at køre, skal du gøre en tilstrækkelig mængde af anti-IL-8 acceptor perler og biotinylated anti-IL-8 antistof i analysebuffer inkluderet i sættet. Brug forholdet mellem 50 µL af anti-IL8 acceptor perler og 50 µL af biotinylated anti-IL8 antistof til 9,9 mL analysebuffer.
    1. Bruge en mulitkanalpipette, tilføje perle/antistof blandingen til en sort 384-godt opbevaring plade.
      1. Tilføje acceptor perle/antistof til brøndene udpeget til brug for prøver og standardkurven ifølge analysen plade layout.
      2. Tilføje et tilstrækkeligt volumen pr. brønd for antallet af assay plader skal køres.
  4. Rekonstruere IL-8 standard til 1000 pg/mL ved hjælp af cellekulturmedium indeholdende 354 µM NaCl. Gøre et tilstrækkeligt volumen til antallet af assay plader skal køres.
  5. Gøre otte serial Tofoldsfortyndinger af standardkurven.
  6. Tilføje standardkurven i tre eksemplarer til de relevante wells af en sort 384-godt opbevaring plade ifølge analysen plade layout. Tilføje et tilstrækkeligt volumen pr. brønd for antallet af assay plader skal køres.
    1. På samme måde tilføje cellekulturmedium indeholdende 354 µM NaCl med IL-8 for baggrunden måling.
  7. Bruge en automatiseret flydende handler til at udføre analysen. Bruge pre-konfigureret tip kasser til at adressere kun brøndene udpeget af assay plade layout. Bruge en 50 µL/s pipettering hastighed for alle trin.
    1. Overføre 8 µL af acceptoren perle-antistof blanding til wells af hvid 384-godt lavvandet godt assay pladerne.
      1. Tilføj kun til brøndene udpeget til prøver og standardkurven ifølge analysen plade layout.
    2. Overføre 2 µL af standardkurven passende brønde af lavvandet godt assay pladerne ifølge analysen plade layout.
    3. Forberede en 3,54 M NaCl opløsning og tilføje et tilstrækkeligt volumen til antallet af plader til analyseres til en lavvandet reservoir på automatiseret flydende handleren.
    4. Justere saltkoncentration af prøver til at matche det af standardkurven ved at overføre 4,5 µL af opløsningen NaCl til prøver i sort 384-godt opbevaring plader.
    5. Bland prøverne tre gange ved hjælp af en blanding volumen af 30 µL, og overdragelse 2 µL af prøverne til den hvide lavvandede assay godt plader ifølge analysen plade layout.
      1. Ændre tips i mellem prøve plader.
    6. Inkuber i 1 time i mørke ved stuetemperatur.
    7. For antallet af assay plader til at køre, skal du gøre en tilstrækkelig mængde af acceptoren perler i analysebuffer. Brug forholdet mellem 200 µL af sekundære acceptor perler til 12,3 mL analysebuffer.
    8. Bruge en mulitkanalpipette, tilføje sekundære perler til en sort 384-godt opbevaring plade.
      1. Tilføje sekundære perler til brøndene udpeget til brug for prøver og standardkurven ifølge analysen plade layout.
      2. Tilføje et tilstrækkeligt volumen pr. brønd for antallet af assay plader skal køres.
    9. Ved hjælp af automatiserede flydende handleren, overføre 10 µL af de sekundære perler til wells af hvid 384-godt lavvandet godt assay plader.
      1. Tilføj kun til de brønde, der modtog prøver og standardkurven ifølge analysen plade layout og vaske tips mellem hver plade.
    10. Der inkuberes i en time i mørke ved stuetemperatur.
  8. Forsegle assay plader med klare plade sæler og scanne ved hjælp af en kompatibel med analysen pladelæseren. Bruge 0,2 mm afstand mellem plade og detektor, 180 ms excitation tid og 550 ms måling tid til scanning.
  9. Importere de rå data fra IL-8 assays til et regneark.
  10. Bruge automatiserede kurve montering til standardkurven af IL-8 assays, og derefter konvertere de rå data til pg/mL for hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksponering metodeudvikling

Vi forfinede og vurderes egnethed af menneskelige hornhinde epitelcelle linje SV40-HCEC til brug i HTS undersøgelser. SV40-HCEC blev udødeliggjort ved hjælp af SV-40 store T antigen og var en gave fra Dhanajay Pal23. Der var for mange variabler udforsket i eksponering metodeudvikling til at præsentere koncist heri, og så kun nogle prøver af resultater mener vi kan være mere bredt gældende til flere giftstoffer er præsenteret.

Giftstof eksponering af Spike eller mellemlang Exchange

I første omgang søgte vi at udsætte celler ved spiking 5 µL af en arbejdende koncentration af giftstoffet fortyndet i vand, saltvand eller medium i 95 µL af medium allerede er til stede i hver brønd af celler i en 96-brønd plade til at opnå den endelige ønskede eksponeringskoncentration. SV40-HCEC blev udsat ved hjælp af denne spike eksponere/refeed metode til 1 X LD50 af HFA i 24 timer (1 X LD50 = 0,02% HFA ved denne metode, når HFA spike blev fortyndet i medium), og brøndene blev refed med frisk medium 10 min senere. Efter 24 h, var cellerne belagt med MTT substrat som beskrevet ovenfor for celle levedygtighed assay. Billeder blev taget til fange af photomicroscopy forud for oploesning af formazankoncentrationen krystaller med DMSO. Nærlæsning af brønde viste, at en stor grad af celledød blev lokaliseret på ét sted, og dette er på trods af, at pladen var rystet til 15 s umiddelbart efter spidsen blev tilføjet til hele pladen (figur 1a). Dette fænomen blev observeret, når spidsen blev tilføjet til bunden af den godt eller Hvornår tilføjet på menisken. En højere forstørrelse billede af dette område ved hjælp af fase kontrast viser, at celler er stadig til stede i området unstained af MTT (figur 1b). Vi har også testet en mellemlang exchange eksponere/refeed metode hvor medium blev fjernet fra brønde, erstattet med cellekulturmedium indeholdende 1 X LD-50 af HFA (1 X LD50 = 0,035% HFA ved denne metode) og wells var refed med frisk medium 10 min senere. Efter 24 h, var cellerne belagt med MTT substrat som beskrevet ovenfor. Denne metode opnåede en tilsyneladende mere selv celle død svar af celler i hver brønd (figur 1 c og 1 d). Eksponerede kontrolelementer er fastsat reference og viser ingen lokaliserede områder af celledød (figur 1e og 1f). For CP engagementer resulterede metoden spike ikke i en stor grad af celledød er lokaliseret til et sted i hver brønd; men celle død svar var mere ensartet fra en iteration til næste ved hjælp af metoden medium exchange eksponering (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1 : Celle død fremkaldt af spike og medium exchange eksponering metoder. Alle billeder blev taget 1,5 time efter tilsætning af MTT substrat. Panelet (a) er en lysfelt billede af SV40-HCEC udsat for HFA spike eksponere/refeed metode. Panel (b) er en højere forstørrelse af samme godt i panelet (a) ved hjælp af fasekontrast. Panelet (c) er en lysfelt billede af SV40-HCEC udsat af medium exchange eksponere/refeed metode. Panel (d) er en højere forstørrelse af samme godt i panelet (c) ved hjælp af fasekontrast. Paneler (e) og (f) er fra en ueksponeret godt, lyse felt og fase kontrast højere forstørrelse, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Giftstof stabilitet i Medium

Det blev observeret, når fortyndet i medium, den tilsyneladende cytotoksicitet af HF og CP ændringer og derefter stabiliserer. HFA blev fortyndet i medium til 0.0036% og tilladt at inkuberes ved 37 ° C i 1-60 min før udsætter SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. For HFA øger cytotoksicitet indenfor de første 5 min, HFA er fortyndet i medium og derefter stabil mindst en time (figur 2a). Én måde ANOVA efterfulgt af Dunnetts flere sammenligning Test viste at % cellernes levedygtighed på alle tidspunkter var markant forskellige fra punktet 1 min. gang. Der var ingen væsentlige forskelle mellem 2,5 til 60 min tid point. CP er økologisk og er først fortyndes til 5% i DMSO. Det blev derefter fortyndes i medium til 0,0008% og tilladt at inkuberes ved 37 ° C i 5-120 min. før udsætter SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. Når fortyndet i medium, cytotoksicitet af CP falder over 60 min og derefter stabiliserer mindst det næste h (figur 2b). Én måde ANOVA efterfulgt af Dunnetts flere sammenligning Test viste at % cellernes levedygtighed på alle tidspunkter var markant forskellige fra punktet 5 min gang. Der var ingen væsentlige forskelle mellem 60 og 120 min tid point.

Figure 2
Figur 2 : Giftstof tab af cytotoksicitet i medium fortyndinger. Dataene er udtrykt som gennemsnitlig procent levedygtighed ± SD (n = 6). Panelet (a) viser stabiliteten af 0.0036% HFA cytotoksicitet når fortyndet i medium og inkuberes ved stuetemperatur i 1-60 min før udsætter SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. Panel (b) viser stabilitet af 0,0008% CP cytotoksicitet når fortyndet i medium og tilladt for at inkuberes ved 37 ° C i 5-120 min. før udsætter SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Udsætte/Refeed eller afsløre kun

En anden faktor, der undersøges i eksponering metode var om skal: A) Tilføj giftstoffet for 10 min., vask, refeed, fjerne plader fra den kemiske stinkskab, og Inkuber 24 h i en standard celle kultur inkubator (eksponere/refeed metode); eller B) tilføje giftstoffet, lad det sidde, fjerne plader fra den kemiske stinkskab og inkuberes 24 h i en standard celle kultur inkubator (afsløre kun metode). Sikkerhed er en vigtig faktor, som det ikke kan være tilladt at fjerne plader af celler, der indeholder fortyndet giftstoffet fra den kemiske stinkskab, fordi giftstoffet bliver off-gas og udsætte personale. En beslægtet overvejelse er antallet af pladerne udsættes på et givet tidspunkt siden de flere plader der er, vil der være en større mængde off-gasning. I vores HTS metoder udsætter vi 48 x 96-brønd plader i en given undersøgelse dag. Vi lagde udsatte celle kultur plader i en forseglet pose og derefter brugte kolorimetriske gas detektor rør for at vurdere CP og HF off-gasning fra udsatte plader. Vi fandt, at udsætte 48 plader til 1 x LD50 af HFA ikke resulterede i nogen påviselig HF off-gasning (data ikke vist). For CP engagementer fandt vi, at der var nok CP off-gasning fra 48 plader udsat for 1 x LD50 forelægger mindst nogle sikkerhedsmæssige forhold (data ikke vist). Både eksponere/refeed og afsløre kun metoder blev evalueret for HFA engagementer. SV40-HCEC celler blev udsat for HFA og levedygtighed blev vurderet af MTT assay 24 timer efter eksponering. Dosis svar gentagelser blev udført på forskellige dage. I forhold til at eksponere/refeed metode (figur 3a), fandt vi, at eksponere eneste metode produceret mere konsekvent celle levedygtighed assay resultater (figur 3b). Derfor, denne metode blev valgt som en del af den endelige eksponering metode. For CP, eventuelle forskelle i sammenhængen i celle levedygtighed assay resultater mellem de to forskellige eksponering metoder kunne ikke evalueres da sikkerhedsproblemer udelukket at fjerne CP udsat plader fra den kemiske stinkskab for 24 h inkubation i en standard celle kultur inkubator.

Figure 3
Figur 3 : Eksponering konsistens med expose/refeed og afsløre kun metoder. Dataene er udtrykt som gennemsnitlig procent levedygtighed ± SD (n = 6). a HFA blev fortyndet i medium, inkuberes ved stuetemperatur i 10 min og derefter bruges til at afsløre celler af metoden eksponere/refeed. b HFA blev fortyndet i medium, inkuberes ved stuetemperatur i 10 min og derefter bruges til at eksponere SV40-HCEC af expose eneste metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Celle Model raffinement

Medium bestanddele

Vi overholdt dyrkningsbetingelserne etableret af de oprindelige efterforskere for passage og vedligeholdelse af disse cellelinjer; men vi har ændret dem til celler i eksperimenter. Cellekulturmedium ordineret af de oprindelige efterforskere for SV40-HCEC celler omfatter ikke hydrocortison, men vi udnyttede et lavt niveau af hydrocortison (0,5 µg/mL) under eksponering studier til at undertrykke den lejlighedsvise spike i cytokin produktion set i naive SV40-HCEC (data ikke vist) som negativt påvirket analyse af data fra én gentagelse til næste under raffinement studier.

Fænotypiske stabilitet

Under vores celle model raffinement undersøgelser, fandt vi, at SV40-HCEC begynder at have nedsat cytokin produktion i reaktion på giftstof eksponering starter omkring passage nummer 60 (data ikke vist). Derfor vi opretholdt cryostocks af lav passage celler, udføres alle undersøgelser ved hjælp af celler under passage nummer 60, og overvåges cytokin produktion under screeningen.

Plade Layout

En vigtig kilde til eksperimentel variation i høj overførselshastighed undersøgelser er kant effekter af multi godt plader. Vi fandt at cytokin svar af celler i kanten wells var ikke i overensstemmelse med eller svarer til indvendige brønde i begge HFA og CP undersøgelser (data ikke vist). Median polsk af data, en statistisk øvelse bruges til at minimere effekterne kant på et datasæt, løser ikke tilstrækkeligt spørgsmålet (data ikke vist). Derfor blev ingen celle pladen kant wells brugt til eksperimenter eller kontrolelementer (figur 4).

Figure 4
Figur 4 : Bibliotek og celle plade layouts. De grå skyggelagte områder i biblioteket plade Layout repræsenterer brønde, der indeholder siRNA. Hvid brøndene er tomme. De 40 mål fra rækker A-D af den bibliotek plade der bruges i "Top plade sæt", og de 40 mål fra rækker E-H af bibliotek plade der bruges i "Bunden plade sæt". Brønde B2-B6 bruges til negative pool siRNA kontrol. Brønde C2-C6 er ikke-transfekteret. Brønde B7-B11 bruges til enten cardamonin eller SKF 86002 positiv kontrol narkotika som beskrevet, og brønde C7-C11 bruges til DMSO køretøj kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

I Vitro Model validering for HTS

Vi brugte Z' faktor analyse for at fastslå egnethed SV40-HCEC til brug i HTS undersøgelser som denne statistiske test bruges til at bestemme assay kvalitet for HTS24. For HF Z' faktor analyse, celler var seedet på 1,25 x 103 celler/brønd, transfekteret med negative pool siRNA (som beskrevet ovenfor) 24 h efter såning og udsatte 48 timer efter Transfektion til 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. For CP Z' faktor analyse, celler var seedede og transfekteret som beskrevet ovenfor, og udsat 48 h efter Transfektion til 0,0008% CP (1 x LD50), n = 5. En større n blev brugt til CP undersøgelser på grund af den større variation i denne eksponering model. Z' faktor var beregnet for IL-8 udtryk fra eksponerede vs udsat celler og negative pool siRNA transfekteret ikke eksponerede vs udsat dataceller for CP og HFA engagementer. Vi har også analyseret ikke transfekteret celler for at afgøre, om der var en effekt på assay kvalitet på grund af siRNA Transfektion. Mange gentagelser af valideringsundersøgelserne blev udført mens raffinering eksponering og kultur betingelser i et forsøg på at maksimere Z' faktor resultater. SV40-HCEC passeret efterprøvelse og de fleste gentagelser havde Z' faktor værdier større end 0,50 for HF engagementer (tabel 1) og CP engagementer (tabel 2). Hver replikeres i disse tabeller blev fra celler belagt på forskellige dage.

Eksponering grupper Z'-faktor analyse
Rep. #1 Rep. #2 Rep. #3
HF-eksponerede negativ kontrol vs. ueksponeret negativ kontrol 0,68 0,5 0,56
HF-eksponerede vs naive 0,4 0,68 0,56

Tabel 1: SV40-HCEC HFA eksponering Z' faktor analyse af IL-8

Eksponering grupper Z'-faktor analyse
Rep. #1 Rep. #2 Rep. #3
CP-eksponerede negativ kontrol vs. ueksponeret negativ kontrol 0,6 0,18 0,46
CP-eksponerede vs naive 0,42 0,29 0,42

Tabel 2: SV40-HCEC CP eksponering Z' faktor analyse af IL-8

Primære siRNA Screening resultater af HFA sårede celler

Transfektion optimering undersøgelser blev udført før screening, og siRNA målretning cyclophilin b blev brugt til disse undersøgelser. En i situ RNA påvisning analyse blev brugt til at måle cyclophilin b mRNA niveauer, og en høj content analyzer blev brugt til at kvantificere resultaterne. Vi opnåede nær 90% knockdown cyclophilin b og typisk ikke mere end 5-10% celletab med 4 pmol siRNA/brønd og 0,3 µL/brønd Transfektion reagens (data ikke vist). Større mængder af siRNA faktisk resulterede i fattigere cyclophilin b knockdown (data ikke vist). Lignende niveauer af knockdown blev opnået med 1,2 pmol/brønd af siRNA og 0,09 µL/brønd Transfektion reagens, men vi valgte at bruge 4 pmol pr. brønd for at imødegå eventuelle mål, der kunne kræver større mængder af siRNA at opnå effektiv knockdown. Target knockdown kinetik blev også vurderet, og det konstateredes, at målet knockdown var maksimal af to dage efter Transfektion (data ikke vist). Target knockdown konsistens på tværs af pladen var også valideret (data ikke vist). Den anti-inflammatoriske lægemidler cardamonin og SKF 86002 bruges som positive kontroller til hæmning af cytokin produktion for HFA og CP eksponering, hhv. Disse blev udvalgt ved at teste en række forbindelser med kendte anti-inflammatoriske egenskaber i udsatte celler. Den dosis, der udnyttes i screening undersøgelser blev valgt af dosis svar optimering undersøgelser.

Den høje overførselshastighed siRNA screening strategi vi udnyttede er industri-standard og omfatter tre hovedtrin: 1) primære screening, 2) bibliotek deconvolution og 3) target validering. I primære screening evalueres Fænotypen af hvert mål udnytte en blanding af forskellige siRNA sekvenser som en enkelt reagens til at målrette hvert Gen. Mål er derefter ned-valgt til biblioteket deconvolution. I dette trin, hver af de forskellige siRNA sekvenser, der er samlet for at målrette hvert gen i primære screening er testet separat. Mål underkastes en anden ned-udvalg i target validering som target fænotype er bekræftet med narkotika, fænotype restaurering og/eller siRNA fra en anden leverandør. For vores primære skærm valgt vi til at udføre en fokuseret sub-genomisk skærm i stedet for en genom bred skærm af hensyn til økonomien. Microarray data fra HF og CP såret mus hornhinder og opfindsomhed Pathway analyse (IPA) blev brugt til at fokusere vores mål bibliotek til den primære skærm (manuskripter under forberedelse). Kort blev mus hornhinder udsat for giftstof damp ved hjælp af en svarende til tidligere beskrevne metoder25damp cup. Udsatte hornhinden knapper og kontrolelementer er høstet på forskellige tidspunkt punkter post eksponering. RNA er isoleret, og kvalitet og mængden af RNA overvåges. Alle microarray eksperimenter blev udført ifølge producentens protokol26. Rå signal støtteintensiteter var normaliseret og analyseret af principal komponent analyse (PCA) til at bestemme de betydelige kilder af variabiliteten i dataene. Gener var rang beordrede af Statistisk signifikans. Dataene blev udvindes og i forhold til gen lister over forudkonfigurerede siRNA biblioteker. Fra listerne gen valgt vi 3120 mål for screening. SiRNA bibliotek blev screenet i SV40-HCEC celler (Se figur 5 for et flowdiagram af HTS protokollen til den primære skærm). Slutpunkt vurderinger inkluderet IL-8 niveauer i cellekulturmedium af no-vask perle-baseret analyse og celle levedygtighed af MTT assay. Cellerne blev udsat for 0.0036%HFA, som tidligere beskrevet, som er ca 1 x LD50. Cellernes levedygtighed blev vurderet af MTT assay 24 timer efter eksponering. Effekten af hver siRNA pool på cellernes levedygtighed blev analyseret for Statistisk signifikans i forhold til udsatte negative pool gennemsnittet for hver plade ved hjælp af strengt standardiseret gennemsnitlige forskel (SSMD)27. En dual-lommelygte plot af SSMD og celle levedygtighed fold-ændringen er vist i figur 6. Hit udvalg tærskler valgt for mål, forværret celledød eller forbedret cellernes levedygtighed blev SSMD ≤-1.28 og SSMD ≥ 1,28, henholdsvis.

Figure 5
Figur 5 : Primær skærm HTS protokol flowdiagram. Dette diagram viser de væsentlige skridt, der er udført på hver dag for HTS-protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Dual-lommelygte Plot af siRNA virkning på Cell Viability of HFA-Exposed SV40-HCEC celler. Resultaterne vises for hvert mål er gennemsnittet af seks replikater (n = 6). Celle levedygtighed data er udtrykt som en fold-ændring i forhold til udsatte negative pool kontrol siRNA, og Statistisk signifikans blev analyseret ved SSMD. Mål, som havde en SSMD ≤-1.28 eller ≥ 1,28 blev valgt som hits. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Effekten af hver siRNA pool på HFA-induceret IL-8 produktion blev analyseret for Statistisk signifikans i forhold til udsatte negative pool gennemsnittet for hver plade. IL-8 i cellekultur supernatanten blev vurderet assay 24 timer efter eksponering. En dual-lommelygte plot af SSMD og IL-8 fold-ændringen er vist i figur 7. Hit udvalg tærskler valgt for mål, nedsat IL-8 produktion var et fald på 40% og SSMD ≤ -1,0. Hit udvalg tærskler valgt for mål, øget IL-8 produktion var en femdobling og SSMD > 1.28.

Figure 7
Figur 7 : Dual-lommelygte Plot af siRNA effekten på IL-8 produktion af HFA-Exposed SV40-HCEC celler. Resultater vist er gennemsnittet af seks replikater (n = 6). IL-8 udtryk niveau data er udtrykt som en fold-ændring i forhold til udsatte negative pool siRNA, og Statistisk signifikans blev analyseret ved SSMD. Hits blev defineret som mål, som havde en 40% fald i IL-8 niveauer og SSMD ≤ -1,0 eller en femdobling af IL-8 niveauer og SSMD > 1.28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri beskriver vi vores metoder og resultater på udviklingen af en høj overførselshastighed hornhinden epitelcelle screening model for studiet af HF og CP skader. Vi præsenterer også resultaterne fra den primære siRNA skærmen for HF skade. Der var mange udfordringer for udviklingen af HTS modeller for studiet af TIC skader. Metoder, som vi kunne finde i litteraturen relateret til undersøgelse af HF, HFA eller CP i celle kultur modeller var til lidt hjælp. De fleste in vitro- undersøgelser på fluor ion involverer oral celler og udnyttet natriumfluorid og ikke HF eller HFA (for eksempler Se28,29). Nogle metode på in vitro- eksponeringen af bronchiale epitel celler til CP er blevet offentliggjort af Pesonen et al. 30. i sidste ende, vi fandt ikke specifikke metoder i litteraturen relateret til HTS undersøgelse af HF, HFA eller CP, og størstedelen af udfordringer og variabler i relation til studiet af disse giftstoffer i HTS kræves udvikling. Særlig var opmærksomhed til at opnå den høje grad af eksponering konsistens på tværs af tid og talrige screening plader nødvendig for en vellykket HTS undersøgelse.

Én type af udfordring opstod var relateret til anvendelsen af giftstoffet til celle kultur systemer. Nogle giftstoffer er enten reaktivt med eller ustabile i vandig opløsning. Giftige stoffer vi valgte for undersøgelse er ikke anses for at have disse ustabilitet problemer. En landbrugs studie undersøger photohydrolysis af CP viste, at en 0,001 M opløsning af CP i vandet havde en halveringstid på 31,1 h når de udsættes for en 1100 lux xenon lyskilde (sollys intensitet af en overskyet dag) for 10 dage, 12 timer pr. dag31. Der var ingen målelig hydrolyse i samme 10 dages periode når løsningen blev opbevaret i mørke. Proton og fluor ion af HFA er klart stabile i vand. Der er dog yderligere stabilitet overvejelser med hensyn til giftstof fortyndinger i cellekulturmedium. Vi fandt, at der var en første ændring af cytotoksicitet til en vis grad, når de giftige stoffer blev først fortyndet i cellekulturmedium, der derefter stabiliserer efter en kort periode. Vi tror, at det skyldes giftstof bindende eller kompleksbindende med bestanddele i mediet. Celle medium indeholder calcium, magnesium, protein, osv ., der er kendt for at interagere med fluor ion32,33. CP er kendt for at have oxidative reaktioner med biologiske dithioler, men det kan også binde DNA, proteiner og andre nukleofiler34,35. Når disse reaktioner og interaktion har udfyldt eller nået ligevægt, mængden af tilgængelige giftstoffet stabiliserer og dermed den tilsyneladende cytotoksicitet stabiliserer. Vi udforsket oprindeligt brugen af saltvand og vand fortyndinger af giftstoffer til arbejder bestande anvendes for engagementer for at undgå giftstof interaktioner med medium bestanddele i orden fortyndinger. Brugen af saltvand vil også bevare den syre komponent af HFA skade for engagementer, der udføres af medium exchange. Vi fandt, at celle død svar for giftige stoffer i vand og saltvand fortyndinger var mere variabel end den metode, der anvendes celle næringssubstratet fortyndinger med medium exchange (data ikke vist). Med hensyn til metoden spike eksponering med HFA variabiliteten kan være på grund af uoverensstemmelse i spike sprede i den godt fører til cellulære mål konkurrerer med medium vælgere til rådighed fluor ion. Årsagerne til variabiliteten i HFA engagementer ved medium udveksling med HFA saltvand fortyndinger er fuldstændig uklart. Under alle omstændigheder blev eksponering metoder ved hjælp af saltvand fortyndinger for HFA opgivet og ikke udforsket i CP. Toksicitet af vores HFA fortyndinger i medium efterligner formentlig nøje undersøgelser ved hjælp af natriumfluorid, fordi celle medium buffere gratis proton i vores HFA fortyndinger.

Andre udfordringer, vi stødte på var relateret til finjustering af celle kultur modeller til brug i HTS. Vi fandt det nødvendigt at ændre celle næringssubstratet vælgere for celler i eksperimenter, specielt hydrocortison og antibiotika. Vi udnyttede et lavt niveau af hydrocortison (0,5 µg/mL) under eksponering studier til at undertrykke den lejlighedsvise spike i cytokin produktion set i naive SV40-HCEC. Dette lavt beløb af hydrocortison påvirkede ikke negativt svar af celler til giftstoffet og var under niveauet typisk bruges til at undertrykke cytokin produktion af dyrkede celler som reaktion på stimulerende36,37. De nøjagtige grunde Hvorfor naive SV40-HCEC celler lejlighedsvis producerer overskydende cytokiner er ikke kendt, men det er muligt, at cellerne er trinløst følsomme over for de mindre stressfaktorer, der opstår under celle passaging og plating. Mange laboratorier omfatter rutinemæssigt antibiotika i vedligeholdelse cellekulturmedium, men nogle antibiotika, tetracykliner især har vist sig at udstille anti-inflammatoriske virkninger på kulturperler celler herunder hornhindens epitel celler38. Generelt undgår vores laboratorium antibiotika, når det er muligt, da disse kan potentielt forvirre undersøgelser. Vi har også undersøgt den fænotypiske glider over flere passager i vores celler i kultur. Det er fælles for udødeliggjort celler til at underkaste sig genetiske og/eller fænotypiske drift over flere passager, hvis ikke vedligeholdes i den eksponentielle fase, hvis lov til at nå confluency, eller hvis de udsættes for visse miljømæssige stressfaktorer39,40 ,41. Derfor er det kritisk under en høj overførselshastighed skærm, cellelinjer vedligeholdes ordentligt, og at skærmen er fuldført ved hjælp af celle passage numre, der opretholder den kendte fænotypiske svar. Multi godt pladen kanteffekter er det fænomen, at celler dyrket i de ydre perimeter wells af multi godt plader ofte reagerer ikke den samme eller med den samme konsistens som celler dyrkes i interiør brønde42. Der er statistiske øvelser, såsom median polsk, der kan udnyttes til at minimere kant effekter på et datasæt43. Der er dog ingen statistiske øvelse, der kan eliminere kant effekter på et særligt mål eller kontrol, hvis det altid er testet i en kanten godt, og varierende layoutet plade mellem replikater for at flytte mål eller kontrol ud af kant brønde er ikke logistisk praktiske eller omkostningseffektiv. Det er vores opfattelse, at beslutningen om at omfatte brugen af kant brønde i celle-baserede HTS assays bør gøres forsigtigt. Vi fandt det nødvendigt at eliminere brugen af celler dyrkes i kanten brønde for kontrol og mål.

Vores HTS celle model og eksponering metode til in vitro- HF skade blev brugt til at fuldføre den primære siRNA skærm af 3120 mål. SSMD blev brugt til hit udvalg, fordi det blev foreslået specielt til at måle omfanget af forskellen mellem et kontrolelement og en siRNA27. Vores resultater for cellernes levedygtighed viser, at der var et lineært forhold i dual-lommelygte plot mellem SSMD og fold-ændringen til stort set alle mål. Af denne grund brugte vi den enkelt kriterium af SSMD til hit udvalg for dette slutpunkt. IL-8 data afveg i, at nogle mål havde svag men konsekvent effekter, mens andre viste stærk men inkonsekvent effekter. Derfor brugte vi både fold-ændring og SSMD for hit udvælgelseskriterier for dette slutpunkt. SSMD værdier anvendes til hit udvalg for både cellernes levedygtighed og IL-8 data blev valgt fordi cutoffs mellem 1 og 1.645 (eller -1 og-1.65) opnå lav falsk opdagelse og ikke-discovery satser44. Der var nogle mål, der blev hits i cellernes levedygtighed og IL-8 data. I disse tilfælde, præference for integration i biblioteket deconvolution blev givet til de mål, der udøvede deres virkninger i den samme retning af forbedring af overordnede sundhed (forbedret levedygtighed og nedsat IL-8) eller forværrer skaden (øget celledød og øget IL-8). Alt i alt, vi valgt ialt 250 mål mellem cellernes levedygtighed og IL-8 slutpunkter til at gøre op i deconvolution biblioteket for HF skade. Den primære skærm til in vitro- CP skade er i gang.

I Resumé, har vi udviklet eksponering og kultur betingelser egnet til HTS undersøgelse af okulær skade af HF og CP. Flere variabler i eksponering og kultur betingelser blev raffineret og optimeret, og modellerne blev valideret for at være egnet til HTS undersøgelser af Z' faktor analyse. Vi har yderligere vist nytten af disse modeller ved at udfylde den primære skærm af en siRNA bibliotek i HF-modellen. Der er mange skader og sygdomme, der ingen er eller begrænset interesse for den farmaceutiske eller biotekindustrien, giftstof skade af CP og HF inkluderet, og fremkomsten af benchtop robotics letter HTS undersøgelse af skader og sygdomme i stort set ethvert laboratorium . Høj overførselshastighed genomisk data sæt kan bidrage væsentligt til forståelsen af de roller at specifikke gener spiller i skade eller sygdom, som kan bidrage til mere effektiv fokus følger på in vitro- eller i vivo undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

DISCLAIMER: synspunkter i denne artikel er de af forfatter og afspejler ikke den officielle politik i afdelingen hær, Department of Defense, eller den amerikanske regering. Denne forskning blev støttet af en interministeriel aftale mellem NIH/NIAID og USAMRICD, og i en del af en aftale om at den Postgraduate Research deltagelse Program på den amerikanske hær medicinsk forskning institut af kemiske forsvar administreres af eg Ridge Institut for videnskab og uddannelse gennem en tværinstitutionelle aftale mellem den amerikanske Department of Energy og USAMRMC.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af den nationale institutter for sundhed modvirke Program tværinstitutionelle aftale # AOD13015-001. Vi vil gerne takke Stephanie Froberg og Peter Hurst for deres indsats og ekspertise om videoproduktion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

Biologi sag 136 Chloropicrin hydrogenfluorid cornea epitelceller hornhinde skader siRNA high throughput screening
Høj overførselshastighed SiRNA Screening for Chloropicrin og hydrogenfluorid-induceret hornhinden epitelcelle skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter