Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høy gjennomstrømning SiRNA Screening for Chloropicrin og fluor-indusert hornhinnen Epithelial celle skade

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Høy gjennomstrømning liten hemmende RNA screening er et viktig verktøy som kan bidra til raskere belyse molekylære mekanismer av kjemiske hornhinnen epithelial skade. Her presenterer vi utvikling og validering av eksponering modeller og metoder for høy gjennomstrømning screening av fluor - og chloropicrin-indusert hornhinnen epithelial skade.

Abstract

Toxicant-indusert okulær skade er en sann okulær krise siden kjemikalier har potensial til å raskt påføre betydelig vevsskade. Behandlinger for toxicant-indusert hornhinnen skade er generelt støttende som ingen bestemt therapeutics eksisterer for å behandle disse skader. I arbeidet med å utvikle behandlinger og therapeutics å omsorg for eksponering, kan det være viktig å forstå molekylære og cellulære mekanismer for disse skader. Vi foreslår at utnyttelse av høy gjennomstrømning liten hemmende RNA (siRNA) screening kan være et viktig verktøy som kan bidra til raskere belyse molekylære mekanismer av kjemiske hornhinnen epithelial skade. siRNA er dobbel strandet RNA molekyler som er 19-25 nukleotider lang og utnytte post-transcriptional genet stanse sti å svekke mRNA som har homologi til siRNA. Den resulterende reduksjonen av uttrykk for bestemte genet kan deretter studeres i toxicant eksponert cellene for å fastslå funksjonen av det genet i cellulær respons til toxicant. Utvikling og validering av i vitro eksponering modeller og metoder for den høy gjennomstrømningen screening (HTS) fluor-(HF) og chloropicrin-(CP) indusert okulær skade presenteres i denne artikkelen. Selv om vi valgte disse to giftstoffer, er våre metoder aktuelt å studere andre giftstoffer med små endringer i toxicant eksponering-protokollen. SV40 store T antigen udødeliggjort menneskelig hornhinnen epithelial celle linje SV40-HCEC ble valgt for studien. Cellen levedyktighet og IL-8 produksjon ble valgt som endepunktene i screening-protokollen. Flere utfordringer knyttet til utviklingen av toxicant eksponering og celle kultur metoder egnet for HTS studier presenteres. Etableringen av HTS modeller for disse giftstoffer lar for videre studier for å bedre forstå mekanismen av skade og skjermen for potensielle legemiddelselskap for kjemiske okulær skade.

Introduction

Toxicant-indusert okulær skade er en sann okulær krise siden kjemikalier har potensial til å raskt påføre betydelig vevsskade. Dessverre er behandlinger for toxicant-indusert hornhinnen skade bare generelt støttende som ingen bestemt therapeutics eksisterer for å behandle disse skader. Den nåværende behandling strategien er uspesifikke og primært inneholder aktuelle terapeutiske behandlinger som smøremidler, antibiotika, og cycloplegics etterfulgt av anti-inflammatories (f.eks, steroider) når hornhinnen har nytt epithelialized1 ,2. Til tross for de beste nåværende terapeutiske behandlingstilbud tilgjengelig er langsiktige prognosen dårlig progressiv hornhinnen clouding og neovascularization2,3.

Dyremodeller har tradisjonelt brukt til å undersøke kjemiske giftighet og forstå mekanismene for skade. Dyrestudier er imidlertid tidkrevende og kostbar. Det er også tiltak for å redusere dyreforsøk. For eksempel har nå lovgivning (EC 1907/2006) i EU bestemmelser er ment å redusere dyreforsøk. Bestemmelsene er et krav at selskapene dele data for å unngå dyr testing og få godkjenning fra den europeiske kjemikalier Agency før du utfører foreslåtte tester på dyr. Under bestemmelsene i rekkevidde, bør dyr testing være en siste utvei. Det er også europeiske kosmetikk regulering (EC 1223/2009) som faset ut testing av kosmetikk i dyr. Når dyrestudier er utført, de guidet av prinsippene i 3Rs (raffinement, reduksjon og erstatning), som gir et rammeverk for mer Human dyr forsket, redusere antall dyr som brukes, og bruke ikke-dyr alternativer der det er mulig. For disse grunner, har feltet toksikologi søkt å vedta i vitro analyser som kan gi innsikt i molekylære mekanismer toksisitet og kan gjøres i høyere gjennomstrømming4. Dette er en funksjonell toksikologi tilnærming der giftstoffer defineres av sin funksjon, og ikke av deres kjemi. Tatt et steg videre, funksjonelle toxicogenomics søker å forstå roller bestemt genene spiller i effekten av giftstoffer5. Med anvendelse av siRNA teknologi, kan skjermer å undersøke gen funksjon i giftstoffer molekylære og mobilnettet svar gjøres på høy gjennomstrømning. siRNA er dobbel strandet RNA molekyler som er 19-25 nukleotider lang som Utnytt innlegget transcriptional gene stanse veien i alle pattedyrceller6. Disse syntetisk laget og designet for å målrette et bestemt gen. Når introdusert i en celle, siRNA er behandlet og en tråd, guide Peasmarsh, lastes inn RNA-indusert stanse komplekset (RISC). SiRNA leder RISC til en supplerende region i en mRNA molekyl, og RISC forringer mRNA. Dette resulterer i reduksjon av uttrykk for bestemte genet. Den resulterende reduksjonen av uttrykk for bestemte genet kan deretter studeres i toxicant eksponert cellene for å fastslå funksjonen av det genet i cellulær respons til toxicant. En slik tilnærming er brukt til videre forstå mekanismer for Risin mottakelighet og AHR-avhengige induksjon av CYP1A17,8.

Listen kjemiske terrorisme risiko vurdering (CTRA) og giftige industrikjemikalier (TIC) oppføringene har spesifiserte Velg kjemikalier basert på toksisitet og potensial til å bli utgitt under en terrorist, krigføring eller industrielle ulykke hendelsen9. Vi søker en siRNA høy gjennomstrømning screening (HTS) toxicogenomic tilnærming til studiet av CTRA listen giftstoffer, er definert til å være høy risiko for bruk i en terrorist hendelsen. Tradisjonelle toksikologi søker å forstå de negative effektene som kjemikalier har på levende organismer; men vi har en ytterligere ønske om å forstå mekanismene for skade for å informere utviklingen av legemiddelselskap og terapeutiske metoder, og muligens oppdage molekyler som kan målrettes for terapeutisk utvikling. Dette arbeidet på noen måter kan anses tilsvarende bruk av høy gjennomstrømning siRNA screening og cellen basert analyser i stoffet funnet prosess10. En stor forskjell vil være at stoffet funnet vanligvis søker et entall mål for terapeutisk funnet mens i vår tilnærming er det noe usannsynlig at det skulle være et entall mål med høy terapeutisk verdi for behandling av toxicant eksponering. Vi forventer at en effektiv behandling paradigme for toxicant eksponering ville kreve en mangesidig tilnærming til å oppnå høy terapeutisk verdi og toxicogenomic data kan livsviktig informere en effektiv behandling paradigme.

Borstemmaskin automatisering gir høy gjennomstrømning metodikk laboratorier utenfor farmasøytisk eller bioteknologi industrien. I vitro studier ved våre institute har historisk vært tradisjonelle analyser som er lav overføringshastighet11,12,13. I de siste årene, har vårt laboratorium overført til bruk av Borstemmaskin robotikk utføre høy gjennomstrømning siRNA screening. Her presenterer vi avgrensningen av okulære celle modeller og utviklingen av in vitro eksponering metoder for fluor (HF) og chloropicrin (CP) egnet for høy gjennomstrømning siRNA screening. Vårt mål er å identifisere molekyler som regulerer cellular skade svar på disse giftstoffer. Målene for siRNA biblioteket vi valgte inkluderer G protein-kombinert reseptorer, protein kinaser, proteaser, phosphatases, ionekanaler og andre potensielt druggable mål. HF og CP ble valgt for studier av kryssreferanser CTRA listen agenter med ToxNet rapporter av industriulykker å finne de som presenterer den største risikoen for okulær skade via damp eksponering9,14. CP (kjemisk formel Cl3CNO2, CAS-nr 76-06-2) ble opprinnelig brukt som et tåregass i WWI15. Det brukes nå som et landbruket fumigant og funksjoner en nematicide soppdreper og insektmiddel16. Fluor (HF) brukes i prosesser inkludert alkylation oljeraffinerier og elektrokjemisk fluorination organiske forbindelser17. HF (kjemisk formel HF, CAS-nr 62778-11-4) er en gass men i vandig form flussyre (HFA, CAS nummer 7664-39-3). Derfor vi valgt å bruke HFA i våre i celle eksponering modeller. SV40 store T antigen udødeliggjort menneskelig hornhinnen epithelial celle linje SV40-HCEC ble valgt for studien. Cellen levedyktighet og provoserende markøren IL-8 ble valgt som endepunkter fordi mål som er involvert i cellular skade bør gjenspeiles i celledød og betennelsesreaksjon. Spesielt hvis mål spiller en beskyttende rolle toxicant eksponering, bør celledød og/eller inflammatoriske cytokiner produksjonen øke når Måluttrykket er hemmet av siRNA. Motsatt ville være sant for mål som spiller en negativ rolle. Kronisk betennelse vises også, å spille en rolle i hornhinnen patologi etter eksponering og intervensjon i celle død trasé kan forbedre kliniske utfallet2,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur vedlikehold

  1. Vokse celle linjen SV40-HCEC på 37 ° C, 5% CO2og 90% fuktighet i DMEM F-12 med 15% fosterets bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 10 µg/L til epidermal vekstfaktor (EGF) og 5 mg/L insulin.
  2. Passasje celle linjen hver 3-4 dager (avhengig av seeding tetthet) for å sikre at confluency aldri overstiger 80% under kultur vedlikehold.
  3. Koble cellene fra kolber bruker avdeling løsning (14 mL løsning for hver 150 cm2 kolbe) og inkubasjon på 37 ° C i mer enn 8 min.
  4. Nøytralisere avdeling løsningen med en lik mengde celle kultur medium og pellets cellene i 50 mL konisk rør med sentrifugering i 7 min 160 x g.
  5. Nytt avbryte celle pellet medium (20 mL for hver 150 cm2 kolbe).
  6. Telle celler med en automatisert håndholdte celle teller og frø i nye flasker på en tetthet som vil tillate dem å vokse i 3 til 4 dager uten å overskride 80% confluency.

2. plate celler for eksperimentering

  1. Sjekk flasker av SV40-HCECs av * fase kontrast lys å sikre at confluency er mindre enn 80% og å vurdere generelle cell helse.
  2. Koble, pellets, resuspend og telle SV40-HCECs fra kolber som beskrevet i trinn 1.3 til 1.6 celle kultur vedlikehold. Bruke SV40-HCEC mediet som inneholder 0,5 µg/mL hydrocortisone (HCORT medium) til resuspend celler.
  3. I en engangs middels flaske, Forbered en suspensjon av SV40-HCECs på 17,857 celler/mL forvarmes HCORT medium.
    1. Forberede en tilstrekkelig mengde celle suspensjon antall plater å bli sådd.
    2. Frø minimum 14 x 96-brønns plater med celler for hver siRNA biblioteket platen som studeres.
  4. Swirl flasken jevnt suspendere cellene, hell en tilstrekkelig mengde celle suspensjon i et reservoar på orbital shaker reiret til en automatisert flytende handler og lagre flasken inneholder cellen suspensjon på en 37 ° C varmeplate under cellen plating prosessen.
  5. Bruk det automatiserte flytende hånd for å legge celler til plater på en tetthet av 1000 celler per brønn (5000 celler/cm2) i 70 µL av medium per brønn av en 96-brønns plate. Bruke en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene.
    1. Kjør orbital shaker 100 RPM stadig under seeding prosessen.
    2. Bland celle suspensjon tre ganger (140 µL miks-volum) ved bruk av automatiserte flytende protokollbehandler.
    3. Sug opp 140 µL av cellen suspensjon og dispensere 70 µL i hver brønn for to celle kultur plater.
    4. Gjenta trinn 2.5.3 og 2.5.4 til alle platene har blitt plantet med celler.
    5. Fylle cellen suspensjon reservoaret behov under seeding prosessen.
  6. Når platene har blitt sådd, fjerne dem fra den automatiserte flytende handler og ruge dem i 30 min ved romtemperatur før du overfører dem til en celle kultur inkubator.
  7. Vurdere celle tettheten av alle bra for hver plate morgenen med et automatisert tenkelig system som ligger i en celle kultur inkubator og utelukke alle platene fra studien som har interiør brønner som ikke er mellom 15% og 22% confluent.

3. transfect celler med siRNA

  1. Kjøpe siRNA biblioteket plater fra leverandøren forhåndskonfigurert inneholder 80 siRNA mål per plate (se Figur 4), med kolonner 1 og 12 tomt.
  2. Rekonstituer siRNA biblioteket platen med en siste konsentrasjon av 2 pmol/µL for hver brønn av siRNA i henhold til produsentens instruksjoner19siRNA-buffer.
  3. Transfect cellene 24 timer etter seeding med 4 pmol/godt av siRNA og 0,3 µL/vel av transfection reagensen. Utføre alle trinnene etter transfection reagens produsentens protokollen (se Figur 4 plate layout)20.
    1. Utføre transfections ved hjelp av en automatisert flytende handler, og bruk en 25 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene. Bruk forhåndskonfigurert tips boksene for å adressere bare brønner som vil være transfected.
    2. Bruk toppen halvparten av biblioteket platen til transfect et sett med seks Repliker plater omtales som "Topp Plate Set" (seks replikerer per siRNA, n = 6).
    3. Bruk nederst halvparten av biblioteket platen til transfect et annet sett av seks Repliker plater omtales som "Bunn Plate Set" (seks replikerer per siRNA, n = 6).
    4. Bruk begrepet "Full Plate Set" for å beskrive 12 cellen platene som har vært transfekterte med biblioteket siRNA.
    5. Transfect wells B2-B6 fra alle platene i Full Plate Set med negative bassenget siRNA etter alle topp og Bunn platen sett har vært transfekterte med biblioteket siRNA.
    6. Også transfect brønner B2-B6 av en annen to plater, som mottar ikke bibliotek siRNA og vil tjene som ueksponerte kontroller (en for topplate settet) og én for det nedre settet, med negative bassenget siRNA.
  4. Inkuber alle cellen platene i en celle kultur inkubator for 4 timer etter at alle transfection mikser er lagt til og blandingen av milde tapping hver time.
  5. Bruk en automatisert flytende hånd å vaske alle brønnene av platene to ganger med forvarmes HCORT medium utvannet 1:5 i PBS. Bruke en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene.
    1. Sug opp 100 µL fra hver brønn og kast det i et avfall reservoar.
    2. Legge til hver vel 100 µL/brønn forvarmes HCORT medium utvannet 1:5 i PBS som finnes i en annen reservoaret på en tilstrekkelig mengde av plater.
    3. Gjenta trinn 3.5.1 og 3.5.2 for hver plate.
      1. Tømme avfall reservoaret etter behov.
      2. Påfyll reservoaret med HCORT medium utvannet 1:5 i PBS etter behov.
    4. Sug opp 100 µL fra hver brønn og kast det i avfall reservoaret.
  6. Refeed alle brønnene av platene med 100 µL/vel forvarmes HCORT medium, som finnes i en annen reservoaret på et tilstrekkelig antall medium av plater.
    1. Fylle reservoaret med middels etter behov.
  7. Bruk brønner C2-C6 av alle platene som ikke-transfekterte kontroller.
  8. Hold brønner B7-B11 og C7-C11 av alle platene ikke-transfekterte brukes som narkotika og kjøretøy for toxicant eksponering.

4. refeed cellene følgende dagen

  1. Bruk en automatisert flytende hånd for å refeed alle brønnene av platene. Bruke en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene.
    1. Sug opp 100 µL fra hver brønn og kast det i et avfall reservoar.
    2. Refeed hver med 100 µL/vel forvarmes HCORT medium som finnes i et annet reservoar, og har et tilstrekkelig volum av medium for antall til å være refed.
    3. Gjenta trinn 4.1.1 og 4.1.2 for å refeed alle cellen platene.
      1. Tømme avfall reservoaret etter behov.
      2. Fylle reservoaret med middels etter behov.

5. positiv kontroll tillegg

  1. To dager forberede etter transfection og to timer før eksponering, en 62.5 µM løsning av positiv kontroll cardamonin HCORT medium brukes for HFA eksponeringer og legge raden B i en 8-rad fortynning reservoaret.
    1. For CP eksponering, forberede og bruke en 25 µM løsning av SKF 86002.
    2. Forberede et antall positiv versjonskontroll tilstrekkelig for antall plater som skal testes.
  2. Forberede en 0.625% løsning av DMSO i HCORT medium (kjøretøy kontroll) og legge raden C i samme reservoaret.
    1. For CP eksponering, forberede og bruke en 0,5% løsning med DMSO.
    2. Forberede en mengde kjøretøy versjonskontroll tilstrekkelig for antall plater som skal testes.
  3. Bruk det automatiserte flytende hånd å legge positiv og kjøretøy brønner B7-B11 og C7-C11 av hver celle plate og bruke en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene. Bruk forhåndskonfigurert tips boksene for å adressere bare brønner som får positiv og kjøretøy kontrollene.
    1. Fjern 10 µL av medium fra brønner B7-B11 og C7-C11 av hver celle plate og kaste den i rader G og H av 8-rad fortynning reservoaret.
    2. Overføre 10 µL av positive og kjøretøy Kontroller de brønner og bland 3 ganger.
  4. Tilbake disse celle platene til inkubator.
  5. Gjenta trinn 5.3 til 5,4 før alle cellen platene har mottatt positivt og kjøretøy kontroller.

6. HF eksponering av kultivert celler

FORSIKTIG: HFA er etsende og akutt giftig.

  1. Utfør alle kjemisk eksponering operasjoner i kjemisk avtrekksvifte iført dobbel nitrilhansker, en laboratoriet frakk, disponibel polyetylen ermet beskyttere og vernebriller.
    1. Erverve HFA som 48% løsning.
    2. Fortynne HFA til 1% med ultrapure vann og lagre i 5 mL dele i 10 mL tykk vegg polyetylen ampuller å forbedre sikkerheten.
    3. Dekontaminere pipette-spisser og reservoarer som har kommet i kontakt med HFA og noen leftover flytende HFA med 2,5% kalsium gluconate før deponering i farlig avfall strømmen.
  2. For hver siRNA biblioteket plate under etterforskning, forberede en 0.0036% HFA middels løsning ved å legge til 288 µL av 1% HFA til 80 mL forvarmes HCORT medium i en 150 mL flaske.
    1. Swirl flasken og ruge fortynne HFA i en 37 ° C inkubator i den kjemiske avtrekksvifte i 10 min.
  3. Bland HFA middels løsningen igjen av virvlende flasken og Legg HFA middels løsningen til en reagens reservoaret på en tallerken varmere.
  4. Utføre eksponering med to teknikere arbeider i tandem.
    1. Har teknikeren på høyre leveringstanken 100 µL fra hver av interiør av en celle plate med en 12 kanal å hindre og deretter platen til teknikeren til venstre.
    2. Har teknikeren til venstre legge 100 µL per brønn av HFA middels løsning.
    3. Gjenta trinn 6.4.1 og 6.4.2 for alle celle-platene som skal bli utsatt for toxicant.
    4. Også gjenta trinn 6.4.1 og 6.4.2 for ueksponerte kontroll plater, utnytte friskt HCORT medium i stedet for HFA middels løsningen.
  5. Plasser platene i kjemisk fume hette inkubator for 20 min og deretter returnere dem til celle kultur inkubator.
  6. Gjenta positive kontroll tillegg trinn (trinn 5.1 til 5,5) som tidligere vises når alle platene er utsatt og tilbake til celle kultur inkubator.

7. CP eksponering av kultivert celler

FORSIKTIG: CP er akutt giftig og irriterende.

  1. Utfør alle kjemisk eksponering operasjoner i kjemisk avtrekksvifte iført dobbel nitrilhansker, en laboratoriet frakk, disponibel polyetylen ermet beskyttere og vernebriller.
    1. Erverve CP.
    2. Fortynne CP 5% i DMSO og lagre i 10 mL dele i 10 mL scintillation ampuller å forbedre sikkerheten.
    3. Dekontaminere pipette-spisser og reservoarer som har kommet i kontakt med CP og noen leftover flytende CP med 2,5% natrium bisulfite før deponering i farlig avfall strømmen.
  2. Forberede en tilstrekkelig mengde forvarmes HCORT medium som inneholder 1 x penn/Strep og forvarmes PBS av platene for å bli utsatt.
  3. For hvert øverste Plate angi eller bunnplaten, legge 8.04 µL på 5% CP i DMSO til en 50 mL aliquot av forvarmes HCORT medium og bland godt for en siste CP konsentrasjon på 0.0008%. Cap røret tett og ruge løsningen i en 37 ° C inkubator i den kjemiske avtrekksvifte 1t.
    1. Tid tillegg av CP til 50 mL dele middels slik at hver utsatt topp Plate satt og Bunn platen satt mottar toxicant nøyaktig 1 h etter CP ble lagt til 50 mL aliquot av medium.
  4. Fjerne en topp Plate satt og 1 ueksponerte kontroll plate fra celle kultur inkubator og plassere dem i den kjemiske avtrekksvifte nær slutten av inkubasjonstiden.
  5. Bland den CP-løsningen ved å snu røret og deretter Dekanter det til en reagens reservoaret på slutten av inkubasjonstiden 1t.
  6. Utføre eksponering med to teknikere arbeider i tandem.
    1. Har teknikeren på høyre leveringstanken 100 µL fra hver av interiør av en celle plate med en 12 kanal å hindre og deretter platen til teknikeren til venstre.
    2. Har teknikeren til venstre legge 100 µL per brønn av CP middels løsning.
    3. Gjenta trinn 7.6.1 og 7.6.2-programvaren for alle cellen plater av toppen Plate Set utsettes toxicant.
    4. Også gjenta trinn 7.6.1 og 7.6.2-programvaren for ueksponerte kontroll plater, utnytte friskt HCORT medium i stedet for CP middels løsningen.
  7. Sett platene i en 37 ° C inkubator i den kjemiske avtrekksvifte i 10 min.
  8. Legge til et tilstrekkelig antall PBS og HCORT medium som inneholder 1 x penn/Strep til reagens reservoarer nær slutten av inkubasjonstiden 10 min.
  9. Fjerne den CP-løsningen fra cellen plater ved hjelp av en 12 kanal å hindre og erstatte den med 100 µL per brønn av PBS på slutten av inkubasjonstiden 10 min.
  10. Umiddelbart fjerne PBS fra cellen plater og erstatte den med 100 µL per brønn av HCORT medium som inneholder 1 x penn/Strep.
  11. Også gjenta trinn 7.9 og 7.10 for ueksponerte kontroll platene.
  12. Returner celle platene til en standard celle kultur inkubator.
  13. Gjenta trinn 7.3 til 7.12 for bunn Plate Set.
  14. Gjenta Positive kontroll tillegg trinn (trinn 5.1 til 5,5) som tidligere beskrevet når alle platene er utsatt og tilbake til celle kultur inkubator.

8. eksempel innsamling og celle levedyktighet analysen

  1. Tjuefire timer etter eksponering, utarbeide en løsning av 0,5 mg/mL MTT underlaget i PBS med 10 g/L glukose og varme til 37 ° C-21. Forberede 10 mL av substrat for hver plate å være assayed.
  2. For antall til å være assayed, legge til et tilstrekkelig antall MTT substratløsningen et reservoar en automatisert flytende handler.
  3. Bruk det automatiserte flytende hånd å samle prøven og legge til MTT underlaget ved hjelp av en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene. Forhåndskonfigurer tips boksene for å ta bare de brønnene for å være assayed.
    1. Leveringstanken 95 µL av medium fra indre 60 brønnene celle plate og innskudd 42,5 µL i hver av to 384-og lagring plater.
    2. Umiddelbart legger 100 µL per brønn av MTT substratløsningen celle platene og ruge dem på 37 ° C i en celle kultur inkubator for 1,5 t.
    3. Fylle reservoaret med MTT substratløsningen etter behov.
  4. Inkuber celle platene på 37 ° C i en celle kultur inkubator 1t.
  5. Seal 384-og lagring platene og lagre dem på-80 ° C for senere analyse.
  6. Gjenta trinn 8.3 til 8,5 for alle topp og Bunn platen sett og tilknyttede ueksponerte kontrollene.
    1. Gjenbruk tips mellom gjentak hvis ønskelig, men vaske dem når du legger til MTT substratløsningen og når bytte mellom platen setter.
  7. Etter den 1t inkubering, legge til et tilstrekkelig antall DMSO et reservoar en automatisert flytende handler.
  8. Bruk det automatiserte flytende hånd å legge DMSO og bruke en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene.
    1. Sug opp 100 µL fra hver av indre av cellen platene og kast MTT substratløsningen i et avfall reservoar.
      1. Tømme avfall reservoaret etter behov.
    2. Overlappe hver brønn med 100 µL DMSO.
      1. Fylle DMSO reservoaret etter behov.
  9. Riste platene på en plate shaker i 3 minutter.
  10. Måle absorbans ved 570 og 690 nm bruker et spektrofotometer plate.
  11. Trekke fra bakgrunnen og beregne % celle levedyktighet ved utsatt absorbansen verdiene med ueksponerte kontrollene. Bruke kontrollen gjennomsnittet ueksponerte negative pool siRNA for å beregne % celle levedyktighet for alle mål.

9. mål IL-8 konsentrasjon i celle kultur Supernatants

  1. Mål konsentrasjonen av IL-8 i celle kultur supernatants med nei vask perle-baserte analysen i henhold til produsentens instruksjoner22. Opprette en analysen plate layout prøvene og standardkurve.
  2. Fjerne 384-og lagring platene fra-80 ° C fryseren tine ved romtemperatur og kort sentrifuge platene for å samle prøven i bunnen av brønnene.
  3. For antall plater som analysen kjøres, kan du gjøre et tilstrekkelig antall anti-IL-8 acceptor perler og biotinylated anti-IL-8 antistoff i analysebuffer følger med i pakken. Bruk forholdet 50 µL av anti-IL8 acceptor perler og 50 µL av biotinylated anti-IL8 antistoff 9.9 mL av analysebuffer.
    1. Bruker analyser, Legg bead/antistoff blanding en svart 384-og lagring plate.
      1. Legge til acceptor bead/antistoff brønnene utpekt for bruk for prøver og standardkurve ifølge analysen plate oppsettet.
      2. Legge til et tilstrekkelig volum per brønn for antall plater som analysen kjøres.
  4. Rekonstituer IL-8-standarden til 1000 pg/mL bruker celle kultur medium med 354 µM NaCl. Gjør et tilstrekkelig volum for antall plater som analysen kjøres.
  5. Gjøre åtte todelt føljetong fortynninger av standardkurve.
  6. Legge til standardkurven i tre eksemplarer riktig fordelt av en svart 384-og lagring plate i henhold til oppsettet for analysen plate. Legge til et tilstrekkelig volum per brønn for antall plater som analysen kjøres.
    1. Likeledes legger du til celle kultur medium med 354 µM NaCl med ingen IL-8 for bakgrunnen måling.
  7. Bruke en automatisert flytende hånd til å utføre analysen. Bruk forhåndskonfigurert tips boksene for å adressere bare brønner som er utpekt av analysen plate oppsettet. Bruke en 50 µL/s pipettering hastighet for alle trinnene.
    1. Overføring 8 µL av acceptor perle-antistoff blandingen fordelt av hvite 384-og grunne godt analysen platene.
      1. Bare legge til brønnene utpekt for prøver og standardkurve ifølge analysen plate oppsettet.
    2. Overføre 2 µL av standardkurve riktig fordelt av grunne godt analysen platene ifølge analysen plate oppsettet.
    3. Forberede en 3,54 M NaCl løsning og legge til et tilstrekkelig volum av til å være assayed til et grunt reservoar på automatiserte flytende behandleren.
    4. Juster salt konsentrasjonen av prøvene å matche standardkurven ved å overføre 4,5 µL av NaCl løsningen til eksemplene i svart 384-og lagring platene.
    5. Bland prøvene tre ganger ved hjelp av en blanding mengden 30 µL, og overføring 2 µL av prøvene til hvit grunne analysen godt platene ifølge analysen plate oppsettet.
      1. Endre tips mellom eksempel plater.
    6. Inkuber 1t i mørket ved romtemperatur.
    7. For antall plater som analysen kjøres, kan du gjøre et tilstrekkelig antall acceptor perler i analysebuffer. Bruk forholdet mellom 200 µL av sekundær acceptor perler til 12.3 mL av analysebuffer.
    8. Bruke analyser, legge til sekundære perler til en svart 384-og lagring plate.
      1. Legge til sekundære perler brønnene utpekt for bruk for prøver og standardkurve ifølge analysen plate oppsettet.
      2. Legge til et tilstrekkelig volum per brønn for antall plater som analysen kjøres.
    9. Bruke automatisert flytende behandlingsprogrammet, overføring 10 µL av sekundær perler fordelt hvit 384-og grunne godt analysen plater.
      1. Bare legge til brønnene mottatt prøvene og standardkurve ifølge analysen plate oppsettet og vask tips mellom hver plate.
    10. Inkuber for en time i mørket ved romtemperatur.
  8. Sel på analysen med Fjern plate sel og skanner med en plate leser kompatibel med analysen. Bruk 0.2 mm avstanden mellom platen og detektor, 180 ms eksitasjon tid og 550 ms måling tid for søket.
  9. Importere rådata fra IL-8 analyser til et regneark.
  10. Bruk automatiserte kurven som passer for standardkurven av IL-8 analyser, og deretter konvertere rådata til pg/mL for hvert utvalg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksponering metodeutvikling

Vi finjusterte og evalueres hensiktsmessigheten av menneskelig hornhinnen tarmepitelet linjen SV40-HCEC for bruk i HTS studier. SV40-HCEC ble udødeliggjort med SV-40 store T antigen og var en gave fra Dhanajay Pal23. Det var for mange variabler utforsket i eksponering metodikk utvikling å presentere presist her, og så bare noen eksempler på resultatene som vi tror kan være mer bredt aktuelt til flere giftstoffer blir presentert.

Toxicant eksponering av Spike eller middels Exchange

Vi søkt utgangspunktet å avsløre celler av skyter 5 µL av en arbeider konsentrasjonen av toxicant fortynnet i vann, saltvann eller middels til 95 µL av medium allerede i hver brønn av celler i en 96-brønnen-plate for å oppnå den endelige ønskede eksponering konsentrasjonen. SV40-HCEC ble utsatt bruker dette spiker utsett/refeed metode 1 X LD50 av HFA 24 h (1 X LD50 = 0.02% HFA ved denne metoden når HFA innsamlingslageret ble utvannet i medium), og brønner ble refed med ferske middels 10 min senere. Etter 24 timer, var cellene kledde med MTT substrat som beskrevet ovenfor for cellen levedyktighet analysen. Bildene ble tatt av photomicroscopy før solubilization av formazan krystaller med DMSO. Lukk undersøkelse av wells viste at en stor grad av celledød ble lokalisert på ett sted, og dette er til tross for det faktum at platen var rystet for 15 s umiddelbart etter at spike ble lagt til hele platen (figur 1a). Dette fenomenet ble observert når topp ble lagt til nederst på godt eller når lagt på meniscus. En høyere forstørrelse bilde av dette området bruker fase kontrast viser at cellene er fortsatt til stede i området unstained kvinne av MTT (figur 1b). Vi testet en middels utveksling utsett/refeed metode der mediet ble fjernet fra brønnene, erstattet med celle kultur medium med 1 X LD50 av HFA (1 X LD50 = 0.035% HFA ved denne metoden) og brønner ble refed med ferske middels 10 min senere. Etter 24 timer, var cellene kledde med MTT substrat som beskrevet ovenfor. Denne metoden oppnådd en tilsynelatende mer selv celle død respons av celler i hver brønn (figur 1 c og 1 d). Ueksponerte kontroller tilbys for referanse og viser ingen områder celledød (figur 1e og 1f). For CP eksponeringer resulterte spike metoden ikke i stor grad av celledød lokalisert til ett sted i hver brønn; men cellen død svaret var mer enhetlig fra ett gjentakelse til neste med metoden for middels exchange eksponering (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1 : Celle død av spike og middels exchange eksponering metoder. Alle bildene ble tatt 1,5 t etter MTT substrat. Panelet (a) er et lysende felt bilde av SV40-HCEC utsatt for HFA spike utsett/refeed metodikk. Panelet (b) er en høyere forstørrelse av den samme brønnen i panelet (a) bruke kontrast. Panel (c) er en lysende felt bilde av SV40-HCEC ved middels exchange utsett/refeed metodikk. Panelet (d) er en høyere forstørrelse på samme brønnen i panel (c) bruke kontrast. Paneler (e) og (f) er fra en ueksponerte Vel, lyse felt og fase kontrast høyere forstørrelse, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Toxicant stabilitet i Medium

Det ble observert at når fortynnet i medium, den tilsynelatende cytotoksisitet HF og CP endringer og deretter stabiliserer. HFA var fortynnet i middels til 0.0036% og lov til å ruge på 37 ° C i 1-60 minutter før utsette SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. For HFA øker cytotoksisitet innen de første 5 min som HFA blir fortynnet i medium og er så stabil minst en time (figur 2a). En måte ANOVA etterfulgt av Dunnetts flere sammenligning Test viste at % celle levedyktighet på alle tidspunkt var signifikant forskjellig fra 1 min tidspunktet. Det var ingen vesentlig forskjell mellom 2,5 til 60 min tidspunkt. CP er organisk og er først fortynnet 5% i DMSO. Det var så fortynnet i middels til 0.0008% og lov til å ruge på 37 ° C i 5-120 minutter før utsette SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. Når fortynnet i medium, cytotoksisitet av CP reduseres over 60 min og deretter stabiliserer for minst neste h (figur 2b). En måte ANOVA etterfulgt av Dunnetts flere sammenligning Test viste at % celle levedyktighet på alle tidspunkt var signifikant forskjellig fra 5 min tidspunktet. Det var ingen vesentlig forskjell mellom 60 til 120 min tidspunkt.

Figure 2
Figur 2 : Toxicant tap av cytotoksisitet i middels fortynninger. Dataene blir uttrykt som gjennomsnittet av prosent levedyktighet ± SD (n = 6). Panelet (a) viser stabiliteten på 0.0036% HFA cytotoksisitet når fortynnet i medium, og inkubert ved romtemperatur for 1-60 minutter før utsette SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. Panelet (b) viser stabiliteten på 0.0008% CP cytotoksisitet når fortynnet i medium og lov til å ruge på 37 ° C i 5-120 minutter før utsette SV40-HCECs som beskrevet ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Utsett/Refeed eller utsette bare

En annen faktor undersøkt i eksponering metodikk var om: A) legge til toxicant for 10 min, vask, refeed, fjerner plater fra den kjemiske avtrekksvifte, og ruge 24 timer i en standard celle kultur inkubator (utsett/refeed metoden). eller B) legge toxicant, la den på, fjerne plater fra den kjemiske avtrekksvifte og ruge 24 timer i en standard celle kultur inkubator (utsett eneste metode). Sikkerhet er en viktig faktor som det ikke kan være tillatt å fjerne plater celler som inneholder fortynnet toxicant fra den kjemiske avtrekksvifte fordi toxicant vil av gass og utsette personell. En relaterte vurdering er antall plater å bli utsatt til en tid siden flere plater finnes, vil det være et større volum av-gassing. I vår HTS metoder utsette vi 48 x 96-brønns plater i en gitt studie dag. Vi plassert synlig celle kultur plater i en forseglet bag og deretter brukt kolorimetrisk gass detektoren rør for å vurdere CP og HF av-gassing fra eksponert plater. Vi fant at utsette 48 plater til 1 x LD50 av HFA ikke resulterte i noen synlig HF av-gassing (data ikke vist). For CP eksponeringer fant vi at det var nok CP av-gassing fra 48 plater utsatt for 1 x LD50 å presentere minst sikkerhetsnett bekymring (data ikke vist). Både utsett/refeed og utsette bare metoder ble vurdert for HFA eksponeringer. SV40-HCEC celler ble utsatt for HFA og levedyktighet ble vurdert av MTT analysen 24 timer etter eksponering. Dose svar gjentakelser ble utført på forskjellige dager. Sammenlignet med metoden utsett/refeed (figur 3a), fant vi at metoden utsett bare produsert mer enhetlige celle levedyktighet analysen resultater (figur 3b). Derfor ble denne metoden valgt som en del av den endelige eksponering metodikken. For CP, eventuelle forskjeller i konsistensen av cellen levedyktighet analyseresultatene mellom de to forskjellige eksponering-metodikkene kan ikke evalueres siden sikkerhet bekymringer utelukket fjerne CP utsatt platene fra den kjemiske avtrekksvifte for 24-timers inkubasjon i en standard celle kultur inkubator.

Figure 3
Figur 3 : Eksponering konsistens med utsett/refeed og vise bare metoder. Dataene blir uttrykt som gjennomsnittet av prosent levedyktighet ± SD (n = 6). (a) HFA ble utvannet i medium, ruges ved romtemperatur for 10 min og deretter brukes til å eksponere celler av metoden utsett/refeed. (b) HFA ble utvannet i medium, ruges ved romtemperatur for 10 min og deretter brukes til å eksponere SV40-HCEC ved å utsette bare metoden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Celle modell raffinement

Middels bestanddeler

Vi overholder oppdrettsforholdene etablert av den opprinnelige etterforskere for passasje og vedlikehold av disse linjer; men endret vi dem for cellene i eksperimentering. Celle kultur medium foreskrevet av den opprinnelige etterforskere for cellene som SV40-HCEC inkluderer ikke hydrocortisone, men benyttet vi et lavt nivå av hydrocortisone (0,5 µg/mL) under eksponering studier å undertrykke sporadisk topp i cytokiner produksjonen Sett i naiv SV40-HCEC (data ikke vist) som negativt påvirket dataanalyse fra en gjentakelse til neste under raffinement studier.

Fenotypiske stabilitet

Under vår celle modell raffinement studier, fant vi at SV40-HCEC begynner å ha redusert cytokiner produksjonen som svar på toxicant eksponering starter rundt passasje nummer 60 (data ikke vist). Derfor vi opprettholdt cryostocks med lav passasje celler, utføres alle studier med celler under passering nummer 60 og overvåket cytokiner produksjonen under utvelgelsesprosedyren.

Plate oppsett

En viktig kilde til eksperimentell variasjoner i høy gjennomstrømning studier er kanteffekter av flere godt plater. Vi fant at cytokin svarene på celler i kanten brønner samsvarte ikke med, eller tilsvarende, interiør brønner i begge HFA og CP studier (data ikke vist). Median polsk data, en statistisk øvelse til effekten kanten på et datasett, løste ikke tilstrekkelig problemet (data ikke vist). Derfor ble ingen celle plate kant brønner brukt for eksperimentering eller kontroller (Figur 4).

Figure 4
Figur 4 : Bibliotek og celle plate. De grå skyggelagte områdene i oppsettet biblioteket Plate representerer brønner som inneholder siRNA. Hvit brønnene er tomme. 40 mål fra rader A-D av biblioteket platen brukes i "Topp Plate Set", og 40 mål fra rader eh av biblioteket platen brukes i "Bunn Plate Set". Wells B2-B6 brukes for negative bassenget siRNA kontroller. Wells C2-C6 er ikke-transfekterte. Wells B7-B11 brukes for enten cardamonin eller SKF 86002 positive kontroll narkotika som beskrevet, og brønner C7-C11 brukes for DMSO kjøretøy kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I Vitro modell validering for HTS

Vi brukte Z' faktor analyse for å fastslå hensiktsmessigheten av SV40-HCEC for bruk i HTS studier som dette statistisk test brukes til å bestemme analysen kvalitet HTS24. For HF Z' faktor analyse, celler var frø på 1,25 x 103 celler/Vel, transfekterte med negativ bassenget siRNA (som beskrevet ovenfor) 24 timer etter såing og utsatt 48 timer etter hva 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. For CP Z' faktor analyse, var frø og transfekterte som beskrevet ovenfor og utsatt 48 timer etter hva 0.0008% CP (1 x LD50), n = 5. En større n ble brukt for CP studiene på grunn av større variasjon i denne eksponering modellen. Z' faktor var beregnet for IL-8 uttrykk fra ueksponerte vs eksponert cellene og negative bassenget siRNA transfekterte ueksponerte vs utsatt datacellene for CP og HFA eksponeringer. Vi også analysert ikke-transfekterte celler for å fastslå om det var en effekt på analysen kvalitet på grunn av siRNA hva. Mange gjentakelser av validering studiene ble utført mens raffinering eksponering og kultur å maksimere Z' faktor resultater. SV40-HCEC passert godkjenningen og de fleste gjentakelser hadde Z' faktor verdier større enn 0,50 for HF eksponeringer (tabell 1) og CP eksponeringer (tabell 2). Hver replikere i disse tabellene var fra celler belagt på ulike dager.

Eksponering grupper Z "-faktor analyse
Rep #1 Rep #2 Rep #3
HF-eksponerte negativ kontroll vs ueksponerte negativ kontroll 0,68 0,5 0,56
HF-eksponerte vs naiv 0,4 0,68 0,56

Tabell 1: SV40-HCEC HFA eksponering Z' faktor analyse av IL-8

Eksponering grupper Z "-faktor analyse
Rep #1 Rep #2 Rep #3
CP-eksponerte negativ kontroll vs ueksponerte negativ kontroll 0,6 0,18 0.46
CP-eksponerte vs naiv 0.42 0.29 0.42

Tabell 2: SV40-HCEC CP eksponering Z' faktor analyse av IL-8

Primære siRNA Screening av HFA skadet resultatcellene

Hva optimalisering studier som ble utført før screening, og siRNA rettet mot cyclophilin b ble brukt i disse studiene. I situ RNA oppdagelsen analysen ble brukt til å måle cyclophilin b mRNA nivåer, og en høy innhold analysator ble brukt om å kvantifisere resultatene. Vi oppnådd nær 90% knockdown cyclophilin b og vanligvis ikke mer enn 5-10% celle tap med 4 pmol siRNA/godt og 0,3 µL/godt hva reagens (data ikke vist). Høyere mengder siRNA faktisk resulterte i dårligere cyclophilin b knockdown (data ikke vist). Lignende nivåer av knockdown ble oppnådd med 1,2 pmol/godt siRNA og 0.09 µL/godt hva reagens, men vi valgte å bruke 4 pmol per brønn for å møte alle mål som kan kreve større mengder siRNA å oppnå effektiv knockdown. Målet knockdown kinetics ble også vurdert, og det ble observert at målet knockdown var maksimal av to dager etter transfection (data ikke vist). Målet knockdown konsistens over tallerkenen var også godkjent (data ikke vist). Den anti-inflammatoriske legemidler cardamonin og SKF 86002 brukes som positive kontroller for hemming av cytokin produksjon for HFA og CP eksponering, henholdsvis. Dette ble valgt testet en rekke forbindelser med kjente anti-inflammatorisk egenskaper i synlige celler. Dosen benyttet i screening studier ble valgt av dose svar optimalisering studier.

Høy gjennomstrømning siRNA screening strategi benyttet vi er industristandard og innebærer tre hovedtrinn: 1) primære screening, 2) bibliotek deconvolution og 3) mål validering. I primære screening evalueres fenotypen av hvert mål bruker en blanding av forskjellige siRNA sekvenser som en enkelt reagens målrette hver genet. Mål er deretter ned valgt til biblioteket deconvolution. I dette trinnet hver av de forskjellige siRNA sekvensene som er gruppert for å målrette hver genet i primære screening testes separat. Mål gjennomgå en ned-utvalg i målet validering der målet fenotypen er bekreftet med narkotika, fenotype restaurering eller siRNA fra en annen leverandør. For vår primære skjermen valgt vi å utføre en fokusert sub-genomisk skjerm i stedet for et genom widescreen på grunn av økonomien. Microarray data fra HF og CP skadet musen hornhinner og oppfinnsomhet sti analyse (IPA) ble brukt til å fokusere vår målbibliotek for primære skjermen (manuskripter forberedelse). Kort, musen hornhinner ble utsatt for toxicant damp ved hjelp av en damp kopp ligner på tidligere beskrevet metoder25. Utsatte hornhinnen knapper og kontroller ble høstet på ulike tid poeng legge eksponering. RNA ble isolert, og kvaliteten og mengden av RNA overvåket. Alle microarray eksperimenter ble utført i henhold til produsentens protokollen26. Rå signal intensiteter var normalisert og analyseres av viktigste komponenten analyse (PCA) for å bestemme de betydelige kildene av variasjon i dataene. Gener var rang organisert etter statistiske betydning. Dataene var minelagt og forhold til gen lister over forhåndskonfigurerte siRNA biblioteker. Fra listene genet valgt vi 3120 mål for screening. SiRNA biblioteket ble vist i SV40-HCEC celler (se figur 5 for et flytskjema for HTS protokollen for primære skjermen). Endepunktet vurderinger inkludert IL-8 nivåer i celle kultur medium av nei-vask perle-baserte analysen og celle levedyktighet av MTT analysen. Cellene ble utsatt for 0.0036%HFA, som tidligere beskrevet, som er ca 1 x LD50. Cellen levedyktighet ble vurdert av MTT analysen 24 timer etter eksponering. Effekten av hver siRNA bassenget på cellen levedyktighet ble analysert for statistisk betydning i forhold til utsatte negative bassenget gjennomsnittet for hver tallerken med strengt standardisert bety forskjellen (SSMD)27. En dobbel-lommelykt tomt SSMD og celle levedyktighet fold-endringen er vist i figur 6. Hit utvalg tersklene valgt for mål som forsterket celledød eller forbedret celle levedyktighet var SSMD ≤-1.28 og SSMD ≥ 1,28, henholdsvis.

Figure 5
Figur 5 : Primære skjermen HTS protokollen flytdiagram. Dette flytdiagrammet viser grunnleggende trinnene som utføres hver dag for HTS-protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Dual-lommelykt tomt siRNA effekt på Cell Viability of HFA-Exposed SV40-HCEC celler. Resultatene vises for hvert mål er gjennomsnittet av seks replikat (n = 6). Levedyktighet celledata uttrykkes som en fold-endring i forhold til utsatte negative bassenget kontroll siRNA, og statistisk betydning ble analysert av SSMD. Mål som hadde en SSMD ≤-1.28 eller ≥ 1,28 ble valgt som treff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Effekten av hver siRNA bassenget på HFA-indusert IL-8 produksjon ble analysert for statistisk betydning i forhold til utsatte negative bassenget gjennomsnittet for hver plate. IL-8 i cellekultur supernatant var vurdert analysen 24 timer etter eksponering. En dobbel-lommelykt tomt SSMD og IL-8 brett-endringen vises i figur 7. Hit utvalg tersklene valgt for mål som redusert IL-8 produksjon var en 40% nedgang og SSMD ≤ -1,0. Hit utvalg tersklene valgt for mål som økt IL-8 produksjon var en fem ganger økning og SSMD > 1,28.

Figure 7
Figur 7 : Dual-lommelykt tomten på IL-8 produksjon av HFA-Exposed SV40-HCEC celler siRNA effekt. Resultatene som vises er gjennomsnittet av seks replikat (n = 6). Data for IL-8 uttrykk uttrykkes som en fold-endring i forhold til utsatte negative basseng-siRNA, og statistisk betydning ble analysert av SSMD. Treff ble definert som mål som hadde en 40% nedgang i IL-8 nivåer og SSMD ≤ -1,0, eller en fem ganger økning i IL-8 nivåer og SSMD > 1,28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi våre metoder og resultater på utviklingen av en høy gjennomstrømning hornhinnen epithelial celle screening modell for studiet av HF og CP skader. Vi har også presentere resultatene fra primær siRNA skjermen for HF skade. Det var mange utfordringer til utviklingen av HTS modeller for studiet av TIC skader. Metoder som vi finner i litteraturen knyttet til studiet av HF, HFA eller CP i celle kultur modeller var av liten hjelp. De fleste i vitro studier på fluor ion involverer oral celler og utnyttet natrium fluor og ikke HF eller HFA (for noen eksempel, se28,29). Noen metoder på i vitro eksponering for bronkial epitelceller CP har blitt publisert av Pesonen et al. 30. til slutt, vi fant ingen bestemte metoder i litteraturen HTS studiet av HF, HFA eller CP og majoriteten av utfordringer og variabler knyttet til studiet av disse giftstoffer i HTS kreves utvikling. Spesiell oppmerksomhet ble betalt til å oppnå høy graden av eksponering konsistens over tid og mange screening-plater som er nødvendig for en vellykket HTS-studie.

Utfordringen som oppdages typer var knyttet til bruk av toxicant til celle kultur systemer. Noen giftstoffer er enten reaktive med eller ustabile i vandige løsninger. Giftstoffer vi valgt for studien anses ikke som å ha disse stabilitetsproblemer. En landbruket studie undersøker photohydrolysis av CP viste at en 0,001 M løsning av CP i vann hadde en halveringstid på 31,1 h når de utsettes for en 1100 lux xenon lyskilde (sollys intensitet av en overskyet dag) for 10 dager, 12 h per dag31. Det var ingen målbar hydrolyse i samme 10 dagers periode da løsningen ble lagret i mørket. Proton og fluor ion av HFA er tydelig stabile i vann. Det er imidlertid mer stabilitet hensyn med hensyn til toxicant fortynninger i celle kultur medium. Vi fant at det var en første endring av cytotoksisitet til en viss grad når giftstoffer ble først utvannet i celle kultur medium som deretter stabiliserer etter en kort periode. Vi tror at dette er på grunn av toxicant bindende eller complexing med bestanddeler i medium. Cellen mediet inneholder kalsium, magnesium, protein, etc. som er kjent for å samhandle med fluor ion32,33. CP er kjent for å ha oksidativt reaksjoner med biologiske thiols, men det kan også binde DNA, proteiner og andre nucleophiles34,35. Når disse reaksjonene og interaksjoner har fullført eller nådd likevekt, mengden tilgjengelig toxicant stabiliserer og dermed den tilsynelatende cytotoksisitet stabiliserer. Vi utforsket utgangspunktet bruk av saltvann og vann fortynninger av giftstoffer for arbeider aksjer brukes for eksponeringer til å unngå toxicant vekselsvirkningene med middels bestanddeler i arbeider fortynninger. Bruk av saltvann vil også bevare den sure komponenten av HFA skade for eksponeringer av middels exchange. Vi fant at celle død svar giftstoffer i vann og saltvann fortynninger var mer variabel enn metoden brukt celle kultur medium fortynninger med middels exchange (data ikke vist). Om metoden spike eksponering med HFA variasjon kan skyldes inkonsistens i innsamlingslageret spre i det også fører til mobilnettet mål konkurrerer med middels bestanddeler for tilgjengelig fluor ion. Årsakene til variasjon i HFA eksponeringer av middels utveksling med HFA saltvann fortynninger er helt uklart. I alle tilfelle, ble eksponering metoder med saltvann fortynninger for HFA forlatt og ikke utforsket for CP. Toksisitet av våre HFA fortynninger i medium etterligner trolig nærmere studier med natrium fluor fordi cellen mediet buffere gratis proton i våre HFA fortynninger.

Andre utfordringer vi var relatert til avgrensningen av celle kultur modeller for bruk i HTS. Vi fant det nødvendig å endre celle kultur medium bestanddeler for cellene i eksperimentering, spesielt hydrocortisone og antibiotika. Vi utnyttet lave hydrocortisone (0,5 µg/mL) under eksponering studier å undertrykke sporadisk topp i cytokiner produksjonen i naiv SV40-HCEC. Dette lav mengde hydrocortisone negativt påvirke ikke svar cellene toxicant og var under vanligvis brukt til å undertrykke cytokiner produksjonen av kultivert celler svar til sentralstimulerende36,37. De nøyaktige årsakene hvorfor naiv SV40-HCEC celler tidvis produsere overflødig cytokiner er ikke kjent, men det er mulig at cellene er ulik følsomme for mindre stressfaktorer som oppstår under passaging og plating. Mange labs omfatter rutinemessig antibiotika i celle kultur vedlikehold medium, men noe antibiotika, tetracykliner spesielt har vist å vise anti-inflammatoriske effekter på kulturperler cellene hornhinnen epitelceller38. Generelt, unngår vårt laboratorium bruken av antibiotika mulig siden dette kan potensielt forvirre studier. Vi har også undersøkt den fenotypiske drift over flere passeringer av våre celler i kultur. Det er vanlig for udødeliggjort celler gjennomgå genetiske og/eller fenotypiske drift over flere passasjer, dersom ikke holdt i den eksponentielle fasen, hvis tillatt å nå confluency, eller hvis de utsettes for visse miljømessige stressfaktorer39,40 ,41. Derfor er det viktig under en høy gjennomstrømning skjerm at cellelinjer vedlikeholdes riktig og at skjermen er fullført celle passasje tall som har kjent fenotypiske svaret. Flere godt plate kanteffekter er fenomenet at celler dyrket i brønnene som ytre omkretsen av flere godt plater ofte ikke svarer det samme eller med samme konsistensen som celler dyrket i indre brønner42. Det finnes statistiske øvelser, som median polsk, som kan benyttes for å minimere kanteffekter på et datasett43. Det er imidlertid ingen statistisk øvelse som kan eliminere kanteffekter på en bestemt målenheten eller kontroll hvis det er alltid testet i en kant godt, og varierende oppsettet plate mellom replikerer du flytter mål eller kontroller av kanten brønner er ikke logistisk praktisk eller kostnadseffektiv. Det er vår oppfatning at beslutningen om å inkludere bruk av kanten brønner i celle-baserte HTS analyser bør gjøres forsiktig. Vi fant det nødvendig å fjerne bruken av celler dyrket i kanten brønner for kontroller og mål.

Vår HTS celle modell og eksponering metode for i vitro HF skade ble brukt til å fullføre primære siRNA skjermen 3120 mål. SSMD ble brukt for hit valg fordi det ble foreslått spesielt for å måle omfanget av forskjellen mellom en kontroll og en siRNA27. Våre resultater for cellen levedyktigheten viser at det var en lineær sammenheng i dual-lommelykt plottet mellom SSMD og brett-endring for nesten alle mål. Av denne grunn brukte vi enkelt nødvendighetskriteriet SSMD for hit utvalg for dette sluttpunktet. IL-8 data skilte seg i at noen mål hadde svak men konsekvent effekter mens andre viste sterkt, men inkonsekvent effekter. Derfor brukte vi både fold-endring og SSMD for hit utvalgskriterier for dette sluttpunktet. SSMD verdiene brukes til hit valg for både celle levedyktighet og IL-8 data ble valgt fordi konsentrasjon mellom 1 og 1.645 (eller -1 og-1.65) oppnår lav false oppdagelsen og ikke-oppdagelsen priser44. Det var noen mål som ble hits i både celle levedyktighet og IL-8 data. I disse tilfellene preferanse for inkludering i deconvolution biblioteket ble gitt til de mål som utøves deres effekter i samme retning for å forbedre helse (forbedret levedyktighet og redusert IL-8) eller forverre skade (økt celledød og økt IL-8). Total, vi valgte totalt 250 mål mellom cellen levedyktighet og IL-8 endepunktene utgjør deconvolution biblioteket for HF skade. Primære skjermen i vitro CP skade pågår.

I sammendraget, har vi utviklet eksponering og kultur betingelser egnet for HTS studiet av okulære skade ved HF og CP. Flere variabler i eksponering og kultur var raffinert og optimalisert og modellene ble godkjent for å være egnet for HTS studier av Z' faktor analyse. Vi har ytterligere bevist nytten av disse modellene ved å fylle ut den primære skjermen siRNA bibliotek i HF modellen. Det er mange skader og sykdommer som ikke eller begrenset interesse til farmasøytisk eller bioteknologiindustrien, toxicant skade ved CP og HF inkludert og ankomsten av Borstemmaskin robotikk muliggjør HTS studiet av skader og sykdommer i nesten alle laboratorium . Høy gjennomstrømning genomic data apparater kan sterkt bidra til forståelsen av rollene som bestemte genene spiller i skade eller sykdom som kan hjelpe til mer effektivt fokus følge i vitro eller vivo studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Ansvarsfraskrivelse: Synspunktene i denne artikkelen er forfatteren/forfatterne, og reflekterer ikke den offisielle politikken avdeling av hæren, Forsvarsdepartementet eller den amerikanske regjeringen. Denne forskningen ble støttet av en tverrfaglig avtale mellom NIH/NIAID og USAMRICD, og delvis av en avtale til høyere forskning deltakelse programmet på amerikanske hæren medisinsk Research Institute av kjemiske forsvar administrert av eiken Ridge Institutt for vitenskap og utdanning gjennom en interagency avtale mellom US Department of Energy og USAMRMC.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av den nasjonale institutter for helse motvirke programmet Interagency avtalen # AOD13015-001. Vi vil gjerne takke Stephanie Fröberg og Peter Hurst for deres innsats og kompetanse på video produksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

Biologi problemet 136 Chloropicrin fluor hornhinnen epitelceller hornhinnen skade siRNA høy gjennomstrømning screening
Høy gjennomstrømning SiRNA Screening for Chloropicrin og fluor-indusert hornhinnen Epithelial celle skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter