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Biology

Chloropicrin और हाइड्रोजन फ्लोराइड प्रेरित कॉर्निया उपकला कोशिका चोट के लिए उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीनिंग

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

उच्च प्रवाह छोटा निरोधात्मक आरएनए स्क्रीनिंग एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो रासायनिक कॉर्निया उपकला चोट के आणविक तंत्र को और अधिक तेजी से स्पष्ट करने में मदद कर सकता है । साथ ही, हम और जोखिम मॉडल और हाइड्रोजन फ्लोराइड और chloropicrin-प्रेरित कॉर्निया उपकला चोट के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए तरीकों के सत्यापन के विकास के लिए उपस्थित ।

Abstract

विषैले नेत्र चोट प्रेरित एक सच है नेत्र आपात स्थिति है क्योंकि रसायनों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण ऊतक क्षति दण्ड की क्षमता है । विषैले प्रेरित corneal चोट के लिए उपचार आम तौर पर सहायक के रूप में कोई विशिष्ट चिकित्सकीय इन चोटों के इलाज के लिए मौजूद हैं । उपचार और चिकित्सकीय जोखिम के लिए देखभाल करने के लिए विकसित करने के प्रयासों में, यह इन चोटों के आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है । हम उच्च प्रवाह छोटे निरोधात्मक आरएनए (सिरना) स्क्रीनिंग के उपयोग का प्रस्ताव है कि रासायनिक कॉर्निया उपकला चोट के आणविक तंत्र को और अधिक तेजी से स्पष्ट करने के लिए मदद कर सकता है कि एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है । सिरना डबल फंसे आरएनए अणु कि 19-25 न्यूक्लियोटाइड लंबे होते है और mRNA के लिए समरूपता है जो नीचा सिरना के बाद transcriptional जीन मुंह बंद करने मार्ग का उपयोग कर रहे हैं । विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप कमी तो विषाक्त उजागर कोशिकाओं में अध्ययन किया जा सकता है के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में है कि जीन के समारोह का पता लगाने के लिए विषाक्त । के विकास और मांयता इन विट्रो जोखिम मॉडल और विधियों के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) हाइड्रोजन फ्लोराइड के लिए-(HF) और chloropicrin-(सीपी) प्रेरित नेत्र चोट इस लेख में प्रस्तुत कर रहे हैं । हालांकि हम इन दो विषालु का चयन किया है, हमारे तरीके विषैले जोखिम प्रोटोकॉल को मामूली संशोधनों के साथ अंय विषालु के अध्ययन के लिए लागू होते हैं । अध्ययन के लिए SV40 बड़ी टी antigen अमरताल ह्यूमन corneal की उपकला कोशिका रेखा SV40-HCEC का चयन किया गया । कोशिका व्यवहार्यता और IL-8 उत्पादन स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में अंतिमबिंदु के रूप में चुना गया था । कई विषाक्त जोखिम और सेल संस्कृति HTS अध्ययन के लिए उपयुक्त तरीकों के विकास के साथ जुड़े चुनौतियों प्रस्तुत कर रहे हैं । इन विषालु के लिए HTS मॉडलों की स्थापना के लिए आगे की पढ़ाई के लिए अनुमति देता है बेहतर चोट के तंत्र को समझने के लिए और रासायनिक नेत्र चोट के लिए संभावित चिकित्सकीय के लिए स्क्रीन ।

Introduction

विषैले नेत्र चोट प्रेरित एक सच है नेत्र आपात स्थिति है क्योंकि रसायनों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण ऊतक क्षति दण्ड की क्षमता है । दुर्भाग्य से, विषाक्त प्रेरित corneal चोट के लिए उपचार केवल आम तौर पर समर्थन कर रहे है के रूप में कोई विशिष्ट चिकित्सीय इन चोटों के इलाज के लिए मौजूद हैं । वर्तमान उपचार रणनीति गैर विशिष्ट है और मुख्य रूप से ऐसी स्नेहक, एंटीबायोटिक दवाओं के रूप में सामयिक चिकित्सीय उपचार भी शामिल है, और cycloplegics द्वारा पीछा किया विरोधी inflammatories (जैसे, स्टेरॉयड) एक बार कॉर्निया फिर से है-epithelialized1 ,2. सबसे अच्छा वर्तमान चिकित्सीय उपचार के विकल्प उपलब्ध होने के बावजूद, दीर्घकालिक पूर्वानुमान आमतौर पर प्रगतिशील corneal झाई और neovascularization2,3के कारण गरीब है ।

पशु मॉडल परंपरागत रूप से रासायनिक विषाक्तता की जांच और चोट के तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, पशु अध्ययन समय लगता है और महंगा है । पशु परीक्षण को कम करने के भी प्रयास हो रहे हैं । उदाहरण के लिए, यूरोपीय संघ में पहुंच कानून (ईसी 1907/2006) ने पशु परीक्षण को कम करने का इरादा किया है । प्रावधानों में शामिल है एक आवश्यकता है कि कंपनियों के डेटा का हिस्सा जानवरों के परीक्षण से बचने के लिए और यूरोपीय रसायनों एजेंसी से अनुमोदन प्राप्त करने से पहले पशुओं पर प्रस्तावित परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए । पहुंच के प्रावधानों के तहत, पशु परीक्षण एक अंतिम उपाय होना चाहिए । वहां भी यूरोपीय सौंदर्य प्रसाधन विनियमन (चुनाव आयोग 1223/2009) है कि बाहर पशुओं में सौंदर्य प्रसाधनों के परीक्षण चरणबद्ध । जब पशु अध्ययन आयोजित कर रहे हैं, वे 3Rs के सिद्धांतों (शोधन, कमी, और प्रतिस्थापन), जो और अधिक मानवीय पशु अनुसंधान प्रदर्शन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं, इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम करने, और गैर पशु विकल्प का उपयोग करके निर्देशित कर रहे है जहां संभव हो । इन कारणों के लिए, विषविज्ञान के क्षेत्र में इन विट्रो परख कि विषाक्तता के आणविक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है और उच्च प्रवाह4में किया जा सकता है अपनाने की मांग की है । यह एक कार्यात्मक विषविज्ञान दृष्टिकोण है जहां विषालु उनके समारोह के बजाय केवल उनके रसायन विज्ञान द्वारा परिभाषित कर रहे हैं । एक कदम आगे ले लिया, कार्यात्मक पॉलीमार्फिज्म भूमिका (ओं) को समझने की तलाश है कि विशिष्ट जीन विषालु5के प्रभाव में खेलते हैं । सिरना प्रौद्योगिकी के आवेदन के साथ, विषालु को आणविक और सेलुलर प्रतिक्रियाओं में जीन समारोह की जांच के लिए स्क्रीन उच्च प्रवाह में किया जा सकता है । सिरना डबल असहाय आरएनए अणु है कि 19-25 न्यूक्लियोटाइड लंबे होते है कि पोस्ट transcriptional जीन मुंह बंद करने मार्ग का लाभ लेने के सभी स्तनधारी6कोशिकाओं में मौजूद हैं । ये कृत्रिम रूप से बना रहे है और एक विशिष्ट जीन लक्ष्य डिजाइन किए हैं । जब एक सेल में पेश किया, सिरना संसाधित है और एक किनारा, गाइड किनारा, आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने परिसर (RISC) में भरी हुई है । सिरना एक mRNA अणु में एक पूरक क्षेत्र के लिए RISC निर्देशन, और RISC mRNA नीचा । यह विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की कमी में परिणाम है । विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप कमी तो विषाक्त उजागर कोशिकाओं में अध्ययन किया जा सकता है के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में है कि जीन के समारोह का पता लगाने के लिए विषाक्त । इस तरह के एक दृष्टिकोण को आगे ricin संवेदनशीलता और CYP1A17,8के AHR निर्भर प्रेरण के तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

रासायनिक आतंकवाद जोखिम मूल्यांकन (CTRA) सूची और विषाक्त औद्योगिक रसायनों (टिक) लिस्टिंग उनकी विषाक्तता और संभावित एक आतंकवादी, युद्ध, या औद्योगिक दुर्घटना घटना9के दौरान जारी होने के आधार पर चुनिंदा रसायनों का चयन किया है । हम CTRA सूची विषालु के अध्ययन के लिए एक सिरना उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) toxicogenomic दृष्टिकोण लागू कर रहे हैं, जो किसी आतंकवादी घटना में उपयोग के उच्च जोखिम पर होने की पहचान की गई है । पारंपरिक विषविज्ञान के प्रतिकूल प्रभाव है कि रसायनों रहने वाले जीवों पर समझ चाहता है; हालांकि, हम एक और चिकित्सकीय और चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास को सूचित करने के प्रयोजन के लिए चोट के तंत्र को समझने की इच्छा है, और संभवतः, अणुओं जो चिकित्सीय विकास के लिए लक्षित किया जा सकता है की खोज करने के लिए । कुछ मायनों में यह प्रयास उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीनिंग और सेल दवा खोज प्रक्रिया10में आधारित परख के उपयोग के अनुरूप माना जा सकता है । एक प्रमुख अंतर यह है कि दवा की खोज आमतौर पर चिकित्सकीय खोज के लिए एक विलक्षण लक्ष्य चाहते हैं, जबकि हमारे दृष्टिकोण में यह कुछ हद तक संभावना नहीं है कि विषाक्त जोखिम के उपचार के लिए उच्च चिकित्सीय मूल्य के साथ एक विलक्षण लक्ष्य होगा । हमें आशा है कि विषैले जोखिम के लिए किसी भी प्रभावी उपचार प्रतिमान एक बहुआयामी उच्च चिकित्सकीय मूल्य प्राप्त दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी, और toxicogenomic डेटा महत्वपूर्ण रूप से एक प्रभावी उपचार प्रतिमान को सूचित कर सकते हैं ।

Benchtop स्वचालन दवा या जैव प्रौद्योगिकी उद्योगों के बाहर प्रयोगशालाओं के लिए उच्च प्रवाह पद्धति लाता है । हमारे संस्थान में इन विट्रो अध्ययनों में ऐतिहासिक रूप से पारंपरिक परख जो कम प्रवाह कर रहे है11,12,13। पिछले कुछ वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला benchtop रोबोटिक्स के उपयोग के लिए उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीनिंग प्रदर्शन करने के लिए संक्रमण हो गया है । इस के साथ साथ, हम नेत्र कोशिका मॉडल के शोधन और हाइड्रोजन फ्लोराइड (HF) और chloropicrin (सीपी) उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त के लिए इन विट्रो एक्सपोजर तरीकों के विकास के वर्तमान । हमारा लक्ष्य अणुओं है कि इन विषालु के जवाब में सेलुलर चोट को विनियमित की पहचान है । सिरना पुस्तकालय हम चयनित के लक्ष्य शामिल है जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स, प्रोटीन kinases, phosphatases, आयन चैनल, और अंय संभावित druggable लक्ष्य । HF और वाणिज्यिक पत्र के अध्ययन के लिए चुना गया था पार से संदर्भित CTRA औद्योगिक दुर्घटनाओं के ToxNet रिपोर्टों के साथ सूची एजेंटों उन है कि वर्तमान भाप जोखिम9,14के माध्यम से आंख की चोट का सबसे बड़ा जोखिम मिल । सीपी (केमिकल फार्मूला सीएल3CNO2, कैस नंबर 76-06-2) मूल रूप से WWI15में एक आंसू गैस के रूप में इस्तेमाल किया गया था । यह वर्तमान में एक कृषि fumigant और एक nematicide, फंजीसाइड, और कीटनाशक16के रूप में कार्य के रूप में प्रयोग किया जाता है । हाइड्रोजन फ्लोराइड (HF) तेल रिफाइनरियों और कार्बनिक यौगिकों17के विद्युत fluorination में alkylation सहित प्रक्रियाओं में प्रयोग किया जाता है । HF (रासायनिक फार्मूला HF, कैस संख्या 62778-11-4) एक गैस है, लेकिन इसके जलीय रूप में hydrofluoric एसिड (HFA, कैस संख्या 7664-39-3) है । इसलिए, हम सेल एक्सपोजर मॉडल में हमारे में HFA का उपयोग करने के लिए चुने गए । अध्ययन के लिए SV40 बड़ी टी antigen अमरताल ह्यूमन corneal की उपकला कोशिका रेखा SV40-HCEC का चयन किया गया । सेल व्यवहार्यता और भड़काऊ मार्कर IL-8 समापन के रूप में चुना गया था क्योंकि सेलुलर चोट में शामिल लक्ष्य कोशिका मृत्यु और भड़काऊ प्रतिक्रिया में प्रतिबिंबित किया जाना चाहिए । विशेष रूप से, अगर एक लक्ष्य को विषाक्त जोखिम में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभा रहे थे, कोशिका मृत्यु और/या भड़काऊ cytokine उत्पादन बढ़ाने चाहिए जब लक्ष्य अभिव्यक्ति सिरना द्वारा बाधित है । विपरीत लक्ष्य है कि एक नकारात्मक भूमिका निभाने के लिए सही होगा । इसके अलावा, जीर्ण सूजन जोखिम के बाद कॉर्निया विकृति में एक भूमिका निभाने के लिए प्रकट होता है, और कोशिका मृत्यु रास्ते में हस्तक्षेप नैदानिक परिणाम2,18में सुधार हो सकता है ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति रखरखाव

  1. बढ़ती सेल लाइन SV40-HCEC पर ३७ ° c, 5% CO2, और ९०% आर्द्रता DMEM F-12 में 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% L-glutamine, 10 µ g/l एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF), और 5 mg/l इंसुलिन के साथ ।
  2. सेल लाइन हर 3 से 4 दिन बीतने (घनत्व बीज पर निर्भर करता है) को सुनिश्चित करने के लिए कि प्रवाह कभी नहीं ८०% से अधिक संस्कृति के रखरखाव के दौरान ।
  3. एक टुकड़ी समाधान (हर १५० सेमी2 कुप्पी के लिए 14 मिलीलीटर समाधान) और कोई अधिक से अधिक 8 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन का उपयोग कर बोतल से अलग कोशिकाओं ।
  4. सेल संस्कृति के मध्यम के एक समान मात्रा के साथ टुकड़ी समाधान बेअसर और ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में 7 मिनट के लिए १६० x g. में कोशिकाओं गोली
  5. पुनः निलंबित मध्यम में सेल गोली (हर १५० सेमी2 कुप्पी के लिए 20 मिलीलीटर) ।
  6. एक घनत्व है कि उंहें 3 से 4 दिनों के लिए विकसित करने की अनुमति देगा पर एक स्वचालित handheld सेल काउंटर और बीज के साथ कोशिकाओं को गिनती ८०% से अधिक के बिना प्रवाह ।

2. प्रयोग के लिए प्लेट कोशिकाओं

  1. चरण कंट्रास्ट हल्की माइक्रोस्कोपी द्वारा SV40-HCECs की कुप्पी की जांच करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रभावित ८०% से कम है और सामांय सेल स्वास्थ्य का आकलन करें ।
  2. अलग, गोली, reसस्पेंड, और गिनती SV40-HCECs कदम में वर्णित के रूप में सेल संस्कृति के रखरखाव के १.६ से १.३ । कोशिकाओं को पुनः निलंबित करने के लिए ०.५ µ जी/एमएल hydrocortisone (HCORT मीडियम) युक्त SV40-HCEC माध्यम का प्रयोग करें ।
  3. एक डिस्पोजेबल मध्यम बोतल में, पूर्व गर्म HCORT माध्यम में १७,८५७ कोशिकाओं/एमएल पर SV40-HCECs के एक निलंबन तैयार करते हैं ।
    1. प्लेटों की संख्या वरीयता प्राप्त करने के लिए कक्ष निलंबन की एक पर्याप्त मात्रा तैयार करें ।
    2. बीज की एक ंयूनतम 14 x ९६-हर सिरना पुस्तकालय प्लेट के लिए कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से प्लेटों का अध्ययन किया जाना है ।
  4. भंवर बोतल समान रूप से कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए, एक स्वचालित तरल हेंडलर के कक्षीय शेखर घोंसले पर एक जलाशय में सेल निलंबन की पर्याप्त मात्रा डालना, और सेल चढ़ाना के दौरान एक ३७ डिग्री सेल्सियस वार्मिंग थाली पर सेल निलंबन युक्त बोतल की दुकान प्रक्रिया.
  5. १००० कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेटों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने के लिए स्वचालित तरल हेंडलर का प्रयोग करें (५००० कोशिकाओं/सेमी2) ७० µ एल में एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट के माध्यम से प्रति कुआं । सभी चरणों के लिए एक ५० µ l/s pipetting गति का उपयोग करें ।
    1. बोने की प्रक्रिया के दौरान लगातार १०० rpm पर कक्षीय शेखर भागो ।
    2. सेल सस्पेंशन तीन बार (१४० µ एल मिक्स मात्रा) स्वचालित तरल हेंडलर का उपयोग कर मिक्स ।
    3. महाप्राण १४० सेल निलंबन के µ एल और दो सेल संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक कुआं में ७० µ एल बांटना ।
    4. दोहराएँ चरण 2.5.3 और 2.5.4 जब तक सभी प्लेटों कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया गया है.
    5. सीडिंग प्रक्रिया के दौरान आवश्यकतानुसार सेल सस्पेंशन जलाशय को फिर से भरना ।
  6. के बाद प्लेटें वरीयता प्राप्त किया गया है, उंहें स्वचालित तरल हेंडलर से निकालें और उंहें एक सेल संस्कृति मशीन को स्थानांतरित करने से पहले कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
  7. प्रत्येक थाली के लिए हर तरह के सेल घनत्व का मूल्यांकन निंनलिखित सुबह एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली है जो एक सेल संस्कृति मशीन में स्थित है और अध्ययन है जो आंतरिक कुओं है कि 15% और 22% के बीच नहीं है से किसी भी प्लेट को बाहर नहीं का उपयोग कर धाराप्रवाह ।

3. सिरना के साथ Transfect कोशिकाओं

  1. ८० सिरना लक्ष्य प्रति प्लेट (देखें चित्र 4), स्तंभ 1 और 12 के साथ खाली छोड़ दिया करने के लिए विक्रेता पूर्व-कॉन्फ़िगर से सिरना लाइब्रेरी प्लेट्स प्राप्त करें ।
  2. निर्माता के निर्देश के अनुसार सिरना के प्रत्येक कुआं के लिए 2 pmol/µ l का अंतिम एकाग्रता के लिए सिरना बफर के साथ सिरना लाइब्रेरी प्लेट का पुनर्गठन19.
  3. Transfect 4 pmol/well of सिरना और ०.३ µ के साथ सीडिंग करने के बाद कोशिकाओं को 24 ज/अभिकर्मक रिएजेंट की अच्छी तरह से । अभिकर्मक रिएजेंट निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सभी चरणों का पालन करें (थाली लेआउट के लिए आरेख 4 देखें)20.
    1. एक स्वचालित तरल हेंडलर का उपयोग कर सभी transfections प्रदर्शन, और सभी चरणों के लिए एक 25 µ एल/एस pipetting गति का उपयोग करें । पूर्व विन्यस्त टिप बक्से का उपयोग केवल कुओं है कि transfected जाएगा पता करने के लिए ।
    2. पुस्तकालय की थाली के ऊपर आधा का उपयोग करें छह का एक सेट transfect प्लेटों दोहराने के रूप में संदर्भित करने के लिए "शीर्ष प्लेट सेट" (छह सिरना प्रति प्रतिकृति, n = 6) ।
    3. पुस्तकालय की थाली के नीचे आधे का उपयोग करें छह के एक अलग सेट transfect प्लेट दोहराने के रूप में निर्दिष्ट "नीचे प्लेट सेट" (छह सिरना प्रति प्रतिकृतियां, n = 6) ।
    4. पुस्तकालय सिरना के साथ transfected गया है कि 12 सेल प्लेटों का वर्णन करने के लिए शब्द "पूर्ण प्लेट सेट" का प्रयोग करें ।
    5. सभी शीर्ष और नीचे प्लेट सेट के बाद नकारात्मक पूल सिरना के साथ सेट पूर्ण थाली में सभी प्लेटों के Transfect वेल्स B2-B6 लायब्रेरी सिरना के साथ transfected किया गया है ।
    6. इसके अलावा transfect वेल्स बी 2-एक और दो प्लेटों के बी-6, कि पुस्तकालय सिरना प्राप्त नहीं है और unexposed नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे (एक शीर्ष प्लेट सेट के लिए और एक नीचे प्लेट सेट के लिए), नकारात्मक पूल सिरना के साथ ।
  4. सभी अभिकर्मक घोला जा सकता है जोड़ा गया है और हर घंटे कोमल दोहन से मिश्रण के बाद 4 घंटे के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में सभी सेल प्लेटें ।
  5. एक स्वचालित तरल हेंडलर का प्रयोग करें प्लेटों के सभी कुओं को धोने के लिए पूर्व गर्म HCORT मध्यम के साथ दो बार पंजाब में 1:5 पतला । सभी चरणों के लिए एक ५० µ l/s pipetting गति का उपयोग करें ।
    1. महाप्राण १०० µ एल एक अच्छी तरह से और त्यागें कि एक अपशिष्ट जलाशय में ।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें १०० µ एल/अच्छी तरह से पूर्व गर्म HCORT मध्यम पंजाब में 1:5 पतला जो एक अलग जलाशय में प्लेटों की संख्या के लिए पर्याप्त मात्रा में समाहित है ।
    3. प्रत्येक प्लेट के लिए चरण 3.5.1 और 3.5.2 दोहराएं ।
      1. आवश्यकतानुसार अपशिष्ट जलाशय को खाली कराएं ।
      2. जरूरत के रूप में पंजाब में 1:5 पतला HCORT मध्यम के साथ जलाशय फिर से भरना ।
    4. महाप्राण १०० µ एल एक अच्छी तरह से और त्यागें कि अपशिष्ट जलाशय में ।
  6. १०० µ एल के साथ प्लेटों के सभी कुओं को पुनः फ़ीड/अच्छी तरह से पूर्व गर्म HCORT माध्यम है, जो एक अलग जलाशय में प्लेटों की संख्या के लिए मध्यम के एक पर्याप्त मात्रा में निहित है ।
    1. जरूरत के रूप में मध्यम के साथ जलाशय फिर से भरना ।
  7. गैर transfected नियंत्रण के रूप में सभी प्लेटों के वेल्स C2-सी 6 का उपयोग करें ।
  8. कुओं B7-B11 और C7-C11 सभी प्लेटें गैर transfected के लिए दवा और वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा विषाक्त जोखिम के लिए रखें ।

4. अगले दिन कोशिकाओं को फिर से खिलाएं

  1. प्लेटों के सभी कुओं को फिर से खिलाने के लिए एक स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग करें । सभी चरणों के लिए एक ५० µ l/s pipetting गति का उपयोग करें ।
    1. महाप्राण १०० µ एल एक अच्छी तरह से और त्यागें कि एक अपशिष्ट जलाशय में ।
    2. एक अलग जलाशय में निहित है कि १०० µ एल/अच्छी तरह से पूर्व गर्म HCORT माध्यम के साथ एक अच्छी तरह से फ़ीड और रेफ र होने के लिए प्लेटों की संख्या के लिए मध्यम के एक पर्याप्त मात्रा में है ।
    3. सभी सेल प्लेट को फिर से फीड करने के लिए आवश्यकतानुसार कदम शुू और 4.1.2 दोहराएं ।
      1. आवश्यकतानुसार अपशिष्ट जलाशय को खाली कराएं ।
      2. जरूरत के रूप में मध्यम के साथ जलाशय फिर से भरना ।

5. सकारात्मक नियंत्रण के अलावा

  1. दो दिन के बाद अभिकर्मक और दो घंटे के प्रदर्शन से पहले, HCORT माध्यम में सकारात्मक नियंत्रण cardamonin के एक ६२.५ µ मीटर समाधान के लिए HFA एक्सपोजर के लिए इस्तेमाल किया और एक 8 पंक्ति कमजोर पड़ने जलाशय के पंक्ति B जोड़ने के लिए तैयार करते हैं ।
    1. वाणिज्यिक पत्र जोखिम के लिए तैयार है और SKF ८६००२ के एक 25 µ m समाधान का उपयोग करें ।
    2. परीक्षण किया जा करने के लिए प्लेटों की संख्या के लिए पर्याप्त सकारात्मक नियंत्रण की एक मात्रा तैयार करें ।
  2. HCORT मध्यम (वाहन नियंत्रण) में DMSO का ०.६२५% समाधान तैयार करें और उसी जलाशय की पंक्ति C में जोड़ें ।
    1. वाणिज्यिक पत्र जोखिम के लिए तैयार है और DMSO के ०.५% समाधान का उपयोग करें ।
    2. परीक्षण किया जा करने के लिए प्लेटों की संख्या के लिए पर्याप्त वाहन नियंत्रण की एक मात्रा तैयार करें ।
  3. स्वचालित तरल हेंडलर का प्रयोग करें कुओं B7-B11 और C7-C11 के लिए सकारात्मक और वाहन नियंत्रण जोड़ने के लिए प्रत्येक कोशिका प्लेट के और एक ५० µ एल/एस pipetting गति का उपयोग सभी चरणों के लिए । केवल कुओं है कि सकारात्मक और वाहन नियंत्रण प्राप्त होगा पता करने के लिए पूर्व विन्यस्त टिप बक्से का उपयोग करें ।
    1. कुओं से मध्यम के 10 µ एल निकालें B7-B11 और प्रत्येक कोशिका प्लेट के C7-C11 और यह पंक्तियां जी और 8 पंक्ति कमजोर पड़ने वाले जलाशय के एच में त्यागें ।
    2. उन कुओं के लिए सकारात्मक और वाहन नियंत्रण के 10 µ एल हस्तांतरण और मिश्रण 3 बार ।
  4. मशीन के लिए इन सेल प्लेटें लौटें ।
  5. सभी सेल प्लेटों सकारात्मक और वाहन नियंत्रण प्राप्त हुआ है जब तक ५.४ करने के लिए ५.३ चरणों को दोहराएँ ।

6. HF प्रसंस्कृत कोशिकाओं का एक्सपोजर

चेतावनी: HFA संक्षारक और तीव्रता से विषाक्त है ।

  1. डबल nitrile दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, डिस्पोजेबल पॉलीथीन आस्तीन संरक्षक और सुरक्षा चश्मे पहने हुए एक रासायनिक धुएं हुड में सभी रासायनिक जोखिम आपरेशनों प्रदर्शन करते हैं ।
    1. एक ४८% समाधान के रूप में HFA मोल ।
    2. पतला HFA को ultrapure पानी के साथ 1% और स्टोर में 5 एमएल aliquots में 10 मिलीलीटर मोटी दीवार पॉलीथीन की शीशियों में डालकर सुरक्षा में सुधार करना ।
    3. पिपेट युक्तियां और जलाशयों कि HFA और किसी भी बचे हुए तरल HFA के साथ संपर्क में आ गए हैं, २.५% कैल्शियम gluconate के साथ खतरनाक अपशिष्ट प्रवाह में निपटान करने से पहले दूषित ।
  2. जांच के तहत प्रत्येक सिरना पुस्तकालय प्लेट के लिए एक १५० मिलीलीटर की बोतल में 1% HFA के ८० मिलीलीटर पूर्व-उष्ण HCORT मध्यम से २८८ µ l को जोड़कर ०.००३६% HFA मीडियम सॉल्यूशन तैयार करें ।
    1. भंवर बोतल और एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में HFA पतला 10 मिनट के लिए रासायनिक धुएं हुड में मशीन ।
  3. HFA मध्यम समाधान फिर बोतल घूमता और एक थाली गर्म पर एक रिएजेंट जलाशय में HFA माध्यम समाधान जोड़ने से मिश्रण ।
  4. दो मिलकर में काम कर रहे तकनीशियनों के साथ जोखिम प्रदर्शन ।
    1. एक सेल प्लेट के भीतरी कुओं में से प्रत्येक से सही महाप्राण १०० µ एल पर तकनीशियन एक 12 चैनल pipettor का उपयोग कर और फिर बाईं तरफ तकनीशियन को थाली पास ।
    2. बाईं ओर तकनीशियन है HFA मध्यम समाधान के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल जोड़ें ।
    3. दोहराएं चरणों 6.4.1 और सभी सेल प्लेटों है कि विषाक्त को उजागर कर रहे है के लिए 6.4.2 ।
    4. इसके अलावा, unexposed नियंत्रण प्लेटों के लिए कदम 6.4.1 और 6.4.2 दोहराएं, HFA माध्यम समाधान के बजाय ताजा HCORT माध्यम का उपयोग ।
  5. 20 मिनट के लिए रासायनिक धुएं हूड मशीन में प्लेट प्लेस और फिर उंहें सेल संस्कृति मशीन को वापस ।
  6. दोहराएं सकारात्मक नियंत्रण इसके अलावा कदम (५.१ के लिए कदम ५.५) के रूप में पहले एक बार सभी प्लेटों उजागर किया गया है दिखाया और सेल संस्कृति मशीन को लौट आए ।

7. प्रसंस्कृत कोशिकाओं के वाणिज्यिक पत्र एक्सपोजर

चेतावनी: सीपी तीव्र विषाक्त और एक अड़चन है ।

  1. डबल nitrile दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, डिस्पोजेबल पॉलीथीन आस्तीन संरक्षक और सुरक्षा चश्मे पहने हुए एक रासायनिक धुएं हुड में सभी रासायनिक जोखिम आपरेशनों प्रदर्शन करते हैं ।
    1. मोल धय.
    2. DMSO में 5% के लिए वाणिज्यिक पत्र पतला और 10 मिलीलीटर aliquots में 10 एमएल जुटाना शीशियों में स्टोर में सुरक्षा में सुधार ।
    3. पिपेट युक्तियां और जलाशयों कि वाणिज्यिक पत्र और २.५% सोडियम bisulfite के साथ किसी भी बचे तरल सीपी के संपर्क में आ गए है खतरनाक अपशिष्ट प्रवाह में निपटान करने से पहले दूषित ।
  2. प्लेटों की संख्या को उजागर करने के लिए पूर्व-उष्ण HCORT माध्यम का पर्याप्त मात्रा में 1x पेन/Strep और पूर्व गर्म पंजाबियों को तैयार करें ।
  3. प्रत्येक शीर्ष प्लेट सेट या नीचे प्लेट सेट के लिए, DMSO में 5% सीपी के ८.०४ µ एल जोड़ने के लिए पूर्व के एक ५० मिलीलीटर aliquot को गर्म HCORT माध्यम और अच्छी तरह से ०.०००८% की एक अंतिम सीपी एकाग्रता के लिए मिश्रण. टोपी ट्यूब कसकर और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में समाधान के लिए 1 एच के लिए रासायनिक धुएं हुड में मशीन ।
    1. समय के अलावा सीपी के ५० एमएल aliquots के लिए इतना है कि प्रत्येक उजागर शीर्ष प्लेट सेट और नीचे प्लेट सेट प्राप्त विषैले बिल्कुल 1 ज के बाद सीपी को ५० एमएल aliquot मीडियम के हिसाब से जोड़ा गया ।
  4. सेल संस्कृति मशीन से एक शीर्ष प्लेट सेट और 1 उजागर नियंत्रण प्लेट निकालें और उन्हें मशीन अवधि के अंत के पास रासायनिक धुएं हुड में जगह है ।
  5. मिश्रण ट्यूब औंधा द्वारा सीपी समाधान और फिर यह 1 एच मशीन अवधि के अंत में एक रिएजेंट जलाशय के लिए खिचड़ी भाषा ।
  6. दो मिलकर में काम कर रहे तकनीशियनों के साथ जोखिम प्रदर्शन ।
    1. एक सेल प्लेट के भीतरी कुओं में से प्रत्येक से सही महाप्राण १०० µ एल पर तकनीशियन एक 12 चैनल pipettor का उपयोग कर और फिर बाईं तरफ तकनीशियन को थाली पास ।
    2. बाईं ओर तकनीशियन है १०० µ एल सीपी मध्यम समाधान के प्रति अच्छी तरह से जोड़ें.
    3. दोहराएं चरणों 7.6.1 और शीर्ष प्लेट सेट के सभी सेल प्लेटों के लिए 7.6.2 को विषाक्त उजागर किया जाएगा ।
    4. इसके अलावा, unexposed नियंत्रण प्लेटों के लिए कदम 7.6.1 और 7.6.2 दोहराएं, वाणिज्यिक पत्र मध्यम समाधान के बजाय ताजा HCORT माध्यम का उपयोग ।
  7. 10 मिनट के लिए रासायनिक धुएं हुड में एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्लेट रखें ।
  8. 10 मिनट की मशीन अवधि के अंत के निकट Strep जलाशयों के लिए पंजाब और HCORT 1x युक्त माध्यम का पर्याप्त मात्रा में जोड़ें ।
  9. एक 12 चैनल pipettor का उपयोग कर सेल प्लेटों से सीपी समाधान निकालें और 10 मिनट की मशीन अवधि के अंत में पंजाब के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल के साथ प्रतिस्थापित.
  10. तुरंत सेल प्लेटों से पंजाबियों को हटा दें और यह HCORT के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल के साथ प्रतिस्थापित 1x कलम/Strep युक्त मध्यम ।
  11. भी unexposed नियंत्रण प्लेटों के लिए ७.९ और ७.१० चरणों को दोहराएँ ।
  12. एक मानक सेल संस्कृति मशीन के लिए सेल प्लेटें लौटें ।
  13. दोहराएँ चरण ७.३ के लिए ७.१२ नीचे प्लेट सेट के लिए.
  14. एक बार सभी प्लेटों उजागर किया गया है और सेल संस्कृति मशीन को लौट के रूप में पहले वर्णित के रूप में सकारात्मक नियंत्रण इसके अलावा कदम (५.१ कदम ५.५) दोहराएँ ।

8. नमूना संग्रह और सेल व्यवहार्यता परख

  1. चौबीस घंटे के जोखिम के बाद, ०.५ मिलीग्राम/एमएल MTT सब्सट्रेट के 10 ग्राम/L ग्लूकोज और गर्म करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस युक्त21. प्रत्येक थाली के लिए सब्सट्रेट के 10 मिलीलीटर परख करने के लिए तैयार करें ।
  2. प्लेटों की संख्या के लिए परख करने के लिए, एक स्वचालित तरल हेंडलर पर एक जलाशय के लिए MTT सब्सट्रेट समाधान की एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ें ।
  3. नमूना इकट्ठा करने और सभी चरणों के लिए एक ५० µ एल/एस pipetting गति का उपयोग MTT सब्सट्रेट जोड़ने के लिए स्वचालित तरल हेंडलर का प्रयोग करें । केवल उन कुओं को परख कर पता करने के लिए कॉंफ़िगर टिप बक्से ।
    1. महाप्राण ९५ सेल प्लेट के भीतरी ६० कुओं से मध्यम के µ एल, और २ ३८४ के प्रत्येक में जमा ४२.५ µ एल-अच्छी तरह से भंडारण प्लेटें ।
    2. तुरंत सेल प्लेट को MTT सब्सट्रेट समाधान के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल जोड़ने के लिए, और उंहें ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ एच के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में मशीन ।
    3. जरूरत के रूप में MTT सब्सट्रेट समाधान के साथ जलाशय फिर से भरना ।
  4. 1 एच के लिए एक सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c पर सेल प्लेटें मशीन ।
  5. ३८४-अच्छी तरह से भंडारण प्लेटें सील और बाद में विश्लेषण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर उंहें स्टोर ।
  6. सभी शीर्ष और निचली प्लेट सेट और संबद्ध unexposed नियंत्रण के लिए ८.५ करने के लिए ८.३ चरणों को दोहराएँ ।
    1. पुन: उपयोग के बीच युक्तियां दोहराने यदि वांछित है, लेकिन उंहें धोने जब MTT सब्सट्रेट समाधान जोड़ने और जब प्लेट सेट के बीच स्विचन ।
  7. 1 एच की मशीन के बाद, एक स्वचालित तरल हेंडलर पर एक जलाशय के लिए DMSO के एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ें ।
  8. DMSO जोड़ने और सभी चरणों के लिए एक ५० µ l/s pipetting गति का उपयोग करने के लिए स्वचालित लिक्विड हैंडलर का उपयोग करें ।
    1. महाप्राण १०० µ एल सेल प्लेटों के भीतरी कुओं में से प्रत्येक से और एक अपशिष्ट जलाशय में MTT सब्सट्रेट समाधान त्यागें ।
      1. आवश्यकतानुसार अपशिष्ट जलाशय को खाली कराएं ।
    2. १०० µ l DMSO के साथ प्रत्येक कुआं ओवरले ।
      1. आवश्यकतानुसार DMSO जलाशय से रिफिल कराएं ।
  9. 3 मिनट के लिए एक प्लेट शेखर पर प्लेटों शेक ।
  10. ५७० और ६९० एनएम एक थाली spectrophotometer का उपयोग करने पर उपाय अवशोषक ।
  11. पृष्ठभूमि घटाना और उजागर अवशोषक मूल्यों को उजागर नियंत्रण द्वारा विभाजित करके% सेल व्यवहार्यता की गणना । सभी लक्ष्यों के लिए% सेल व्यवहार्यता की गणना करने के लिए औसत unexposed ऋणात्मक पूल सिरना नियंत्रण का उपयोग करें ।

9. उपाय IL-8 कोशिका संस्कृति Supernatants में एकाग्रता

  1. सेल संस्कृति supernatants में IL-8 की एकाग्रता उपाय एक नहीं धो मनका आधारित परख का उपयोग कर निर्माता के निर्देश के अनुसार22। नमूने और मानक वक्र समायोजित करने के लिए एक परख प्लेट लेआउट बनाएं ।
  2. -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, कमरे के तापमान पर गल से ३८४-अच्छी तरह से भंडारण प्लेटें निकालें, और संक्षेप में कुओं के तल में नमूना इकट्ठा करने के लिए प्लेटें केंद्रापसारक ।
  3. परख प्लेटों की संख्या के लिए चलाने के लिए, विरोधी के एक पर्याप्त मात्रा il-8 स्वीकार करता है मोती और biotinylated विरोधी-il-8 परख में एंटीबॉडी किट में शामिल बफर बनाओ । विरोधी के ५० µ एल के अनुपात का उपयोग करें-IL8 स्वीकारकर्ता मोती और ५० µ एल के biotinylated विरोधी IL8 एंटीबॉडी के ९.९ मिलीलीटर के लिए परख बफर ।
    1. एक मल्टीचैनल pipettor का प्रयोग, एक काले ३८४-अच्छी तरह से भंडारण प्लेट के लिए मनका/एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें ।
      1. परख प्लेट लेआउट के अनुसार नमूनों और मानक वक्र के लिए उपयोग के लिए नामित कुओं के लिए स्वीकारकर्ता मनका/एंटीबॉडी जोड़ें ।
      2. परख प्लेटों की संख्या के लिए अच्छी तरह से प्रति एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ें चलाने के लिए ।
  4. १००० स्नातकोत्तर/एमएल के लिए आईएल-8 मानक का पुनर्गठन ३५४ µ एम NaCl युक्त सेल कल्चर माध्यम का उपयोग कर । परख प्लेटों की संख्या के लिए एक पर्याप्त मात्रा में चलाने के लिए बनाओ ।
  5. मानक वक्र के आठ दोहरा धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ ।
  6. तपसिल में मानक वक्र एक काले ३८४-अच्छी तरह से भंडारण प्लेट के उपयुक्त कुओं को परख प्लेट लेआउट के अनुसार जोड़ें । परख प्लेटों की संख्या के लिए अच्छी तरह से प्रति एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ें चलाने के लिए ।
    1. इसी प्रकार, कक्ष संस्कृति मध्यम से युक्त ३५४ µ एम NaCl पृष्ठभूमि माप के लिए कोई IL-8 के साथ जोड़ें ।
  7. एक स्वचालित तरल हेंडलर का प्रयोग करने परख प्रदर्शन । का प्रयोग करें पूर्व विंयस्त टिप बक्से केवल परख प्लेट लेआउट द्वारा नामित कुओं का पता । सभी चरणों के लिए एक ५० µ l/s pipetting गति का उपयोग करें ।
    1. स्थानांतरण 8 µ एल के स्वीकारकर्ता मनका-एंटीबॉडी मिश्रण के कुओं को सफेद ३८४-अच्छी तरह से उथले अच्छी तरह से परख प्लेटें ।
      1. केवल नमूनों और मानक वक्र परख प्लेट लेआउट के अनुसार के लिए नामित कुओं को जोड़ें ।
    2. स्थानांतरण 2 µ मानक वक्र के उपयुक्त कुओं के लिए अच्छी तरह से परख प्लेट लेआउट के अनुसार के लिए उचित कुंए प्लेटों l ।
    3. एक ३.५४ मीटर NaCl समाधान तैयार करने और प्लेटों की संख्या के लिए एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ने के लिए स्वचालित तरल हेंडलर पर एक उथले जलाशय को परख सकता है ।
    4. नमूनों की नमक एकाग्रता को समायोजित करने के लिए कि मानक वक्र के ४.५ µ एल स्थानांतरित द्वारा काले ३८४-अच्छी तरह से भंडारण प्लेटों में नमूनों के लिए NaCl समाधान ।
    5. मिश्रण तीन बार 30 µ एल का एक मिश्रण मात्रा का उपयोग कर, और नमूने के 2 µ l स्थानांतरण परख प्लेट लेआउट के अनुसार सफेद उथले अच्छी तरह से परख प्लेटों ।
      1. नमूना प्लेटों के बीच में युक्तियां बदलें ।
    6. कमरे के तापमान पर अंधेरे में 1 ज के लिए मशीन ।
    7. परख प्लेटों की संख्या के लिए चलाने के लिए, परख बफर में स्वीकार्य मोतियों की एक पर्याप्त मात्रा में बनाते हैं । माध्यमिक स्वीकारकर्ता मोतियों की २०० µ एल के अनुपात परख बफर के १२.३ मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    8. एक मल्टीचैनल pipettor का प्रयोग, एक काले ३८४-अच्छी तरह से भंडारण प्लेट माध्यमिक मोतियों जोड़ें ।
      1. परख प्लेट लेआउट के अनुसार नमूनों और मानक वक्र के लिए उपयोग के लिए नामित कुओं के लिए माध्यमिक मोतियों जोड़ें ।
      2. परख प्लेटों की संख्या के लिए अच्छी तरह से प्रति एक पर्याप्त मात्रा में जोड़ें चलाने के लिए ।
    9. स्वचालित तरल हैंडलर का उपयोग कर, सफेद ३८४ के कुओं के लिए माध्यमिक मोतियों की 10 µ एल हस्तांतरण-अच्छी तरह से उथले अच्छी तरह से परख प्लेटें ।
      1. केवल कुओं कि नमूने और मानक वक्र परख प्लेट लेआउट के अनुसार प्राप्त करने के लिए जोड़ें और प्रत्येक थाली के बीच सुझावों को धो लें ।
    10. कमरे के तापमान पर अंधेरे में एक घंटे के लिए मशीन ।
  8. स्पष्ट प्लेट जवानों और एक प्लेट परख के साथ संगत पाठक का उपयोग कर स्कैन के साथ परख प्लेटें सील । प्लेट और डिटेक्टर, १८० एमएस उत्तेजना समय के बीच ०.२ mm दूरी का उपयोग करें, और स्कैन के लिए ५५० ms माप समय ।
  9. एक स्प्रेडशीट में IL-8 परख से रॉ डेटा आयात करें ।
  10. IL-8 परख के मानक वक्र के लिए स्वचालित वक्र फिटिंग का प्रयोग करें, और फिर प्रत्येक नमूने के लिए स्नातकोत्तर/

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Representative Results

एक्सपोजर मेथड डेवलपमेंट

हम परिष्कृत और HTS अध्ययन में उपयोग के लिए मानव corneal उपकला कोशिका लाइन SV40-HCEC की उपयुक्तता का मूल्यांकन किया. SV40-HCEC एसवी-४० बड़े टी प्रतिजन का उपयोग कर अमर थे और Dhanajay पाल23से एक उपहार थे । वहां भी कई जोखिम पद्धति विकास में पता लगाया चर रहे थे संक्षिप्त के साथ साथ मौजूद है, और इसलिए, केवल निष्कर्षों के कुछ नमूने हमें विश्वास है और अधिक मोटे तौर पर कई विषालु के लिए लागू हो सकता है प्रस्तुत कर रहे हैं ।

कील या मध्यम मुद्रा से विषाक्त जोखिम

हम शुरू में spiking द्वारा कोशिकाओं को बेनकाब करने की मांग 5 पानी में पतला विषैले, खारा, या माध्यम के ९५ µ एल में मध्यम पहले से ही एक ९६ में कोशिकाओं के एक अच्छी तरह से वर्तमान थाली में मौजूद करने के लिए अंतिम वांछित जोखिम एकाग्रता को प्राप्त करने की एकाग्रता के एल । SV40-HCEC इस कील का उपयोग कर उजागर कर रहे थे बेनकाब/1 x ld५० के लिए HFA के 24 घंटे के लिए (1 x ld५० = ०.०२% HFA इस विधि से जब HFA स्पाइक माध्यम में पतला था), और कुओं ताजा माध्यम से रेफ र थे 10 मिनट बाद में । 24 एच के बाद, कोशिकाओं MTT सब्सट्रेट के साथ मढ़ा के रूप में सेल व्यवहार्यता परख के लिए ऊपर वर्णित थे । छवियों DMSO के साथ formazan क्रिस्टल के solubilization करने से पहले photomicroscopy द्वारा कब्जा कर लिया गया । कुओं की बंद परीक्षा से पता चला कि कोशिका मृत्यु की एक बड़ी डिग्री एक स्थान में स्थानीयकृत किया गया था, और इस तथ्य यह है कि प्लेट 15 एस के लिए हिल गया था तुरंत बाद स्पाइक पूरी थाली में जोड़ा गया था के बावजूद है (आंकड़ा 1a) । इस घटना को देखा था जब स्पाइक अच्छी तरह से या जब meniscus में जोड़ा के नीचे करने के लिए जोड़ा गया था । इस चरण के विपरीत का उपयोग कर इस क्षेत्र की एक उच्च आवर्धन छवि से पता चलता है कि कोशिकाओं को अभी भी MTT द्वारा दाग क्षेत्र में मौजूद है (आंकड़ा 1b) । हम भी एक मध्यम विनिमय का परीक्षण किया बेनकाब/जहां मध्यम कुओं से हटा दिया गया था, कोशिका संस्कृति मध्यम से युक्त HFA के 1 x ld५० (1 x ld५० = ०.०३५% HFA इस विधि से) और कुओं ताजा मध्यम 10 मिनट के साथ रेफ र थे बाद. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं MTT सब्सट्रेट के साथ मढ़ा के रूप में ऊपर वर्णित किया गया । इस विधि एक अच्छी तरह से (चित्रा 1c और 1 डी) के भीतर कोशिकाओं की एक जाहिरा तौर पर और भी सेल मौत प्रतिक्रिया हासिल की । उजागर नियंत्रण संदर्भ के लिए प्रदान की जाती है और सेल मौत का कोई स्थानीयकृत क्षेत्रों (चित्रा 1e और 1f) दिखा रहे हैं । वाणिज्यिक पत्र जोखिम के लिए, स्पाइक विधि एक अच्छी तरह से प्रत्येक के भीतर एक स्थान के लिए स्थानीयकृत कोशिका मौत की एक बड़ी डिग्री में परिणाम नहीं था; हालांकि, सेल मौत प्रतिक्रिया मध्यम विनिमय जोखिम विधि का उपयोग कर अगले करने के लिए एक पुनरावृत्ति से अधिक सुसंगत था (नहीं दिखाया गया डेटा) ।

Figure 1
चित्रा 1 : स्पाइक और मध्यम विनिमय जोखिम तरीकों से प्रेरित सेल मौत । सभी छवियों MTT सब्सट्रेट के अलावा के बाद १.५ ज पर कब्जा कर लिया गया । पैनल (क) SV40 के एक चमकदार क्षेत्र छवि-HCEC HFA कील बेनकाब करने के लिए उजागर/ पैनल (बी) पैनल में एक ही अच्छी तरह से एक उच्च इज़ाफ़ा (एक) चरण कंट्रास्ट का उपयोग कर रहा है । पैनल (सी) SV40 के एक चमकदार क्षेत्र छवि है-HCEC माध्यम से उजागर विनिमय/ पैनल (डी) पैनल में एक ही अच्छी तरह से उच्च इज़ाफ़ा (सी) चरण कंट्रास्ट का उपयोग कर रहा है । पैनलों (ङ) और (च) एक उजागर अच्छी तरह से कर रहे हैं, उज्ज्वल क्षेत्र और चरण इसके विपरीत उच्च इज़ाफ़ा, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मध्यम में विषैला स्थिरता

यह देखा गया है कि एक बार मध्यम में पतला, HF और सीपी के स्पष्ट cytotoxicity परिवर्तन और फिर स्थिर । HFA मध्यम में ०.००३६% से पतला था और 1-60 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन को SV40-HCECs के रूप में ऊपर वर्णित उजागर करने से पहले की अनुमति दी । HFA के लिए, cytotoxicity पहले 5 मिनट के भीतर बढ़ जाता है कि HFA मध्यम में पतला है और फिर कम एक घंटे (चित्रा 2a) के लिए स्थिर है । एक ही रास्ता है Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद ANOVA से पता चला कि सभी समय अंक में% सेल व्यवहार्यता 1 मिनट समय बिंदु से काफी अलग थे । २.५ ६० मिनट के समय अंक के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे । सीपी कार्बनिक है और पहले DMSO में 5% करने के लिए पतला है । यह तो मध्यम में ०.०००८% के लिए पतला था और 5-120 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर SV40-HCECs के रूप में ऊपर वर्णित उजागर करने से पहले मशीन की अनुमति दी । एक बार मध्यम में पतला, वाणिज्यिक पत्र के cytotoxicity ६० मिनट से कम हो जाती है और फिर के लिए स्थिर के लिए ंयूनतम अगले एच (चित्रा बी) । एक ही रास्ता है Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद ANOVA से पता चला कि सभी समय अंक में% सेल व्यवहार्यता 5 मिनट समय बिंदु से काफी अलग थे । ६० १२० मिनट के समय अंक के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे ।

Figure 2
चित्रा 2 : मध्यम कमजोर पड़ने में cytotoxicity का विषैला नुकसान । डेटा प्रतिशत व्यवहार्यता ± एसडी (n = 6) के औसत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । पैनल (क) ०.००३६% HFA cytotoxicity की स्थिरता से पता चलता है जब मध्यम में पतला और 1-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन SV40-HCECs के रूप में ऊपर वर्णित उजागर करने से पहले । पैनल (ख) ०.०००८% सीपी cytotoxicity की स्थिरता से पता चलता है जब मध्यम में पतला और 5-120 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के रूप में ऊपर वर्णित SV40-HCECs उजागर करने से पहले की अनुमति दी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

केवल बेनकाब/

एक अंय जोखिम पद्धति में जांच की कारक था: एक) 10 मिनट के लिए विषाक्त जोड़ने के लिए, धोने, फिर से खिलाने, रासायनिक धुएं हूड से प्लेटें हटाने, और एक मानक सेल संस्कृति मशीन में 24 घंटे की मशीन (बेनकाब/ या बी) विषैले जोड़ें, यह पर छोड़ दो, रासायनिक धुएं हूड से प्लेटों को हटाने, और एक मानक सेल संस्कृति मशीन में 24 घंटे की मशीन (केवल विधि का पर्दाफाश) । सुरक्षा एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में यह कोशिकाओं है कि रासायनिक धुएं हुड से पतला विषैले होते हैं, क्योंकि विषैले दूर होगा गैस और कर्मियों को बेनकाब की प्लेटों को दूर करने की अनुमति नहीं हो सकती है । एक संबंधित विचार प्लेटों की संख्या के लिए एक निश्चित समय पर उजागर होने के बाद से अधिक प्लेटें हैं, वहां एक बड़ी मात्रा में बंद-बक होगा । हमारे HTS तरीकों में, हम एक दिया अध्ययन दिन में ४८ x ९६-अच्छी तरह से प्लेटों का पर्दाफाश । हम एक सील बैग में सेल संस्कृति प्लेटों उजागर रखा और फिर वर्णमिति गैस डिटेक्टर ट्यूब इस्तेमाल के लिए वाणिज्यिक पत्र का आकलन और HF बंद-उजागर प्लेटों से बक । हमने पाया है कि HFA के 1 एक्स LD५० को ४८ प्लेटों को उजागर किसी भी detectable HF बंद-बक में परिणाम नहीं था (डेटा नहीं दिखाया) । वाणिज्यिक पत्र जोखिम के लिए, हमने पाया है कि वहां पर्याप्त वाणिज्यिक बंद बक से ४८ प्लेटों को उजागर किया गया था 1 एक्स LD५० को कम से उपस्थित कुछ सुरक्षा चिंता प्रदर्शित (डेटा) नहीं है । दोनों को बेनकाब/पुनर्फ़ीड और बेनकाब केवल विधियों HFA एक्सपोजर के लिए मूल्यांकन किया गया । SV40-HCEC कोशिकाओं को उजागर किया गया HFA और व्यवहार्यता MTT परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था 24 प्रदर्शन के बाद एच । खुराक प्रतिक्रिया पुनरावृत्ति अलग दिनों पर प्रदर्शन किया गया । बेनकाब/पुनर्फ़ीड विधि (3ए) की तुलना में, हमने पाया है कि बेनकाब ही विधि और अधिक सुसंगत सेल व्यवहार्यता परख परिणाम का उत्पादन (चित्र बी) । इसलिए, इस पद्धति का अंतिम एक्सपोज़र पद्धति के भाग के रूप में चयन किया गया था । वाणिज्यिक पत्र के लिए, दो अलग जोखिम के तरीके के बीच सेल व्यवहार्यता परख परिणामों की निरंतरता में किसी भी मतभेद का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता सुरक्षा चिंताओं के बाद से precluded को हटाने के लिए रासायनिक धुआं हूड से एक में 24 एच की मशीन के लिए सीपी उजागर प्लेटों मानक सेल संस्कृति मशीन ।

Figure 3
चित्रा 3 : बेनकाब/पुनर्फ़ीड और केवल विधियों का पर्दाफाश के साथ एक्सपोज़र संगतता । डेटा प्रतिशत व्यवहार्यता ± एसडी (n = 6) के औसत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । (क) HFA मध्यम में पतला था, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन, और फिर पर्दाफाश द्वारा कोशिकाओं का पर्दाफाश करने के लिए इस्तेमाल/ (ख) HFA मध्यम में पतला था, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन, और फिर बेनकाब केवल विधि द्वारा SV40-HCEC का इस्तेमाल किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सेल मॉडल काे

मध्यम घटक

हम इन सेल लाइनों के पारित होने और रखरखाव के लिए प्रारंभिक जांचकर्ताओं द्वारा स्थापित संस्कृति शर्तों का पालन किया; हालांकि, हमने उंहें प्रयोग में कक्षों के लिए संशोधित किया है । कोशिका संस्कृति मध्यम SV40-HCEC कोशिकाओं के लिए प्रारंभिक जांचकर्ताओं द्वारा निर्धारित hydrocortisone शामिल नहीं है, लेकिन हम hydrocortisone के एक निंन स्तर (०.५ µ जी/एमएल) जोखिम अध्ययन के दौरान cytokine उत्पादन में सामयिक स्पाइक को दबाने का उपयोग भोली SV40 में देखा-HCEC (डेटा नहीं दिखाया गया है) जो प्रतिकूल रूप से प्रभावित डेटा विश्लेषण से एक चलना परिशोधन अध्ययन के दौरान अगले करने के लिए ।

Phenotypic स्थिरता

हमारे सेल मॉडल शोधन अध्ययन के दौरान, हमने पाया है कि SV40-HCEC शुरू बीतने संख्या ६० के आसपास शुरू करने के लिए विषाक्त जोखिम के जवाब में cytokine उत्पादन में कमी आई है (नहीं दिखाया डेटा) । इस कारण से, हम कम यात्रा कोशिकाओं के cryostocks बनाए रखा, सभी अध्ययन पारित संख्या ६० के तहत कोशिकाओं का उपयोग कर मार डाला, और स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान cytokine उत्पादन पर नजर रखी ।

प्लेट लेआउट

उच्च प्रवाह अध्ययन में प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता का एक महत्वपूर्ण स्रोत बहु की बढ़त प्रभाव अच्छी तरह से प्लेटें है । हमने पाया है कि एज वेल्स में कोशिकाओं के cytokine प्रतिक्रियाओं के साथ संगत नहीं थे, या समकक्ष, दोनों HFA और सीपी अध्ययन में भीतरी कुओं (डेटा नहीं दिखाया गया है) । डेटा की औसत पॉलिश, एक सांख्यिकीय एक डेटा सेट पर बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, पर्याप्त नहीं समस्या का समाधान (डेटा दिखाया गया है) । इसलिए, कोई सेल प्लेट एज वेल्स प्रयोग या नियंत्रण (चित्रा 4) के लिए इस्तेमाल किया गया ।

Figure 4
चित्र 4 : लाइब्रेरी और सेल प्लेट लेआउट । लाइब्रेरी प्लेट लेआउट में धूसर छायांकित क्षेत्र उन कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनमें सिरना होते हैं. सफेद कुएं खाली पड़े हैं । पंक्तियों से ४० लक्ष्य लाइब्रेरी प्लेट के ए-डी "टॉप प्लेट सेट" में उपयोग किया जाता है, और पुस्तकालय की थाली के ई-एच पंक्तियों से ४० लक्ष्यों "नीचे प्लेट सेट" में उपयोग किया जाता है । वेल्स B2-B6 का उपयोग ऋणात्मक पूल सिरना नियंत्रणों के लिए किया जाता है । वेल्स C2-सी 6 गैर transfected हैं । वेल्स B7-B11 या तो cardamonin या SKF ८६००२ सकारात्मक नियंत्रण दवाओं के रूप में वर्णित के लिए उपयोग किया जाता है, और वेल्स C7-C11 वाहन नियंत्रण DMSO के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इन विट्रो मॉडल सत्यापन के लिए HTS

हम Z ' कारक विश्लेषण का इस्तेमाल किया SV40 की उपयुक्तता निर्धारित करने के लिए-HCEC HTS अध्ययन में उपयोग के लिए इस सांख्यिकीय परीक्षण के रूप में24HTS के लिए परख गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । HF Z ' कारक विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं १.२५ x 103 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त किया गया/खैर, transfected के साथ नकारात्मक पूल सिरना (ऊपर वर्णित के रूप में) 24 ज सीडिंग के बाद, और ४८ एच ०.००३६% HFA (1 एक्स LD५०), n = 3 के बाद अभिकर्मक के बाद उजागर । सीपी जेड ' फैक्टर विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को वरीयता दी गई और ऊपर वर्णित के रूप में transfected, और ०.०००८% CP (1 x LD५०) के लिए अभिकर्मक के बाद ४८ ज उजागर, n = 5 । एक बड़ा एन सीपी इस जोखिम मॉडल में अधिक परिवर्तनशीलता के कारण अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था । Z ' कारक IL-8 अभिव्यक्ति डेटा unexposed बनाम उजागर कोशिकाओं और नकारात्मक पूल सिरना transfected उजागर बनाम वाणिज्यिक पत्र और HFA एक्सपोजर के लिए उजागर कोशिकाओं के लिए गणना की गई थी । हम भी गैर transfected कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित अगर वहां परख सिरना अभिकर्मक के कारण गुणवत्ता पर एक प्रभाव था । मांयता अध्ययन के कई पुनरावृत्तियां प्रदर्शन किया गया, जबकि एक Z ' कारक परिणाम को अधिकतम करने के प्रयास में जोखिम और संस्कृति की स्थिति परिष्कृत । SV40-HCEC मांयता पारित कर दिया और सबसे पुनरावृत्ति Z कारक था HF जोखिम (तालिका 1) और वाणिज्यिक पत्र जोखिम (तालिका 2) के लिए ०.५० से अधिक है । इन तालिकाओं में प्रत्येक प्रतिकृति अलग दिनों पर चढ़ाया गया कक्ष से था ।

एक्सपोजर ग्रुप्स Z'-फैक्टर विश्लेषण
प्रतिनिधि #1 प्रतिनिधि #2 प्रतिनिधि #3
HF नकारात्मक नियंत्रण बनाम उजागर नकारात्मक नियंत्रण ०.६८ ०.५ ०.५६
HF-उजागर बनाम भोली ०.४ ०.६८ ०.५६

तालिका 1: SV40-HCEC HFA एक्सपोज़र Z ' आईएल-8 के कारक विश्लेषण

एक्सपोजर ग्रुप्स Z'-फैक्टर विश्लेषण
प्रतिनिधि #1 प्रतिनिधि #2 प्रतिनिधि #3
वाणिज्यिक पत्र उजागर नकारात्मक नियंत्रण बनाम नकारात्मक नियंत्रण उजागर ०.६ ०.१८ ०.४६
सीपी उजागर बनाम भोली ०.४२ ०.२९ ०.४२

तालिका 2: SV40-HCEC CP एक्सपोज़र Z ' आईएल के फैक्टर विश्लेषण-8

HFA घायल कोशिकाओं के प्राथमिक सिरना स्क्रीनिंग परिणाम

अभिकर्मक अनुकूलन अध्ययनों से पहले प्रदर्शन किया गया स्क्रीनिंग, और सिरना लक्ष्यीकरण cyclophilin बी इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक में सीटू आरएनए डिटेक्शन परख cyclophilin बी mRNA स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और एक उच्च सामग्री विश्लेषक परिणामों को मात्रात्मक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम cyclophilin बी के ९०% पछाड़ना के पास हासिल की और आम तौर पर नहीं सिरना के 4 pmol के साथ 5-10% सेल नुकसान/अच्छी तरह से और ०.३ µ एल/अच्छी तरह से अभिकर्मक रिएजेंट (दिखाया नहीं डेटा) । सिरना की उच्च मात्रा वास्तव में गरीब cyclophilin बी पछाड़ना में परिणाम (डेटा नहीं दिखाया गया है) । पछाड़ना के समान स्तर १.२ pmol/well of सिरना और ०.०९ µ l/अच्छी तरह से अभिकर्मक रिएजेंट के साथ प्राप्त किए गए थे, लेकिन हम 4 pmol प्रति अच्छी तरह से आदेश में किसी भी लक्ष्य है कि सिरना की अधिक से अधिक मात्रा में प्रभावी पछाड़ना प्राप्त करने की आवश्यकता सकता है पता करने के लिए चुने गए । लक्ष्य पछाड़ना कैनेटीक्स भी मूल्यांकन किया गया है, और यह देखा गया था कि लक्ष्य पछाड़ना दो दिनों के बाद से अधिक से अधिक था अभिकर्मक (डेटा नहीं दिखाया) । थाली भर में लक्ष्य पछाड़ना स्थिरता भी (डेटा नहीं दिखाया गया) मान्य किया गया था । विरोधी भड़काऊ दवाओं cardamonin और SKF ८६००२ HFA और वाणिज्यिक पत्र जोखिम, क्रमशः के लिए cytokine उत्पादन के निषेध के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । ये उजागर कोशिकाओं में ज्ञात विरोधी भड़काऊ गुणों के साथ यौगिकों की एक किस्म का परीक्षण द्वारा चयन किया गया । खुराक स्क्रीनिंग अध्ययन में उपयोग खुराक प्रतिक्रिया अनुकूलन अध्ययन द्वारा चुना गया था.

उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग हम उद्योग मानक है और तीन प्रमुख कदम शामिल हैं: 1) प्राथमिक स्क्रीनिंग, 2) पुस्तकालय deconvolution, और 3) लक्ष्य सत्यापन । प्राथमिक स्क्रीनिंग में, प्रत्येक लक्ष्य के phenotype एक जीन को लक्षित करने के लिए एक एजेंट के रूप में अलग सिरना दृश्यों का एक मिश्रण का उपयोग मूल्यांकन किया है । लक्ष्य तो नीचे-पुस्तकालय deconvolution को चुना जाता है । इस चरण में, प्रत्येक विभिन्न सिरना अनुक्रम प्राथमिक स्क्रीनिंग में प्रत्येक जीन को लक्षित करने के लिए परित हैं कि अलग से परीक्षण कर रहे हैं. लक्ष्य किसी अंय विक्रेता से phenotype, phenotype पुनर्स्थापना, और/या सिरना के साथ लक्षित मांयता में टारगेट सत्यापन में एक और नीचे-चयन से गुज़रना । हमारी प्राथमिक स्क्रीन के लिए, हम अर्थव्यवस्था के कारणों के लिए एक जीनोम चौड़ी स्क्रीन के बजाय एक केंद्रित उप-जीनोमिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए चुने गए । HF और सीपी से Microarray डेटा घायल माउस कॉर्निया और सरलता मार्ग विश्लेषण (आइपीए) प्राथमिक स्क्रीन (तैयारी में पांडुलिपियों) के लिए हमारे लक्ष्य पुस्तकालय ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । संक्षेप में, माउस कॉर्निया विषैले वाष्प को उजागर कर रहे थे एक भाप पहले वर्णित तरीकों25के समान कप का उपयोग कर । उजागर कॉर्निया बटन और नियंत्रण विभिन्न समय अंक पोस्ट एक्सपोजर पर काटा गया था । आरएनए अलग था, और आरएनए की गुणवत्ता और राशि पर नजर रखी । सभी microarray प्रयोगों के निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया26. कच्चे संकेत तीव्रता सामान्यीकृत थे और प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) द्वारा विश्लेषण के लिए डेटा में परिवर्तनशीलता के महत्वपूर्ण स्रोतों का निर्धारण । जीन सांख्यिकीय महत्व के आदेश दिए गए रैंक थे । डेटा खनन और सिरना पुस्तकालयों की जीन सूचियों की तुलना में किया गया । इन जीन सूचियों से, हम स्क्रीनिंग के लिए ३१२० लक्ष्य का चयन किया । सिरना लाइब्रेरी SV40-HCEC कक्षों में दिखलाई गई थी (प्राथमिक स्क्रीन के HTS प्रोटोकॉल के प्रवाह चार्ट के लिए चित्र 5 देखें). समापन बिंदु आकलन सेल संस्कृति माध्यम में IL-8 स्तर शामिल नहीं-धोने मनका-परख और MTT परख द्वारा सेल व्यवहार्यता आधारित । कोशिकाओं 0.0036% HFA, पहले वर्णित है, जो लगभग 1 एक्स LD५०के लिए सामने आ रहे थे । सेल व्यवहार्यता MTT परख 24 एच द्वारा जोखिम के बाद मूल्यांकन किया गया । सेल व्यवहार्यता पर प्रत्येक सिरना पूल के प्रभाव सांख्यिकीय महत्व के लिए एक कड़ाई से मानकीकृत मतलब अंतर (SSMD)27का उपयोग कर प्लेट के लिए उजागर नकारात्मक पूल औसत के सापेक्ष विश्लेषण किया गया था । SSMD और सेल व्यवहार्यता गुना-परिवर्तन के एक दोहरे टॉर्च भूखंड चित्रा 6में दिखाया गया है । हिट चयन सीमा है कि सेल मौत या बेहतर सेल व्यवहार्यता लक्ष्य के लिए चुना SSMD ≤-१.२८ और SSMD ≥ १.२८, क्रमशः थे ।

Figure 5
चित्रा 5 : प्राथमिक स्क्रीन HTS प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट । इस प्रवाह चार्ट HTS प्रोटोकॉल के लिए प्रत्येक दिन पर किया जाता है आवश्यक चरणों को दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : दोहरे टॉर्च HFA की कोशिका व्यवहार्यता पर सिरना प्रभाव की साजिश-उजागर SV40-HCEC कोशिकाओं । प्रत्येक लक्ष्य के लिए दिखाए गए परिणाम छह प्रतिकृति (n = 6) के औसत हैं । सेल व्यवहार्यता डेटा प्रकट नकारात्मक पूल नियंत्रण सिरना के सापेक्ष एक गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और सांख्यिकीय महत्व SSMD द्वारा विश्लेषण किया गया था । लक्ष्य जो एक SSMD ≤-१.२८ या ≥ १.२८ हिट के रूप में चुना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

HFA-प्रेरित IL-8 उत्पादन पर प्रत्येक सिरना पूल के प्रभाव सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रत्येक थाली के लिए उजागर नकारात्मक पूल औसत के सापेक्ष विश्लेषण किया गया था । IL-8 सेल संस्कृति supernatant में प्रदर्शन के बाद परख 24 एच मूल्यांकन किया गया । SSMD और IL-8 के एक दोहरे टॉर्च की साजिश गुना-परिवर्तन चित्रा 7में दिखाया गया है । हिट चयन थ्रेशोल्ड लक्ष्य है कि IL-8 उत्पादन में कमी के लिए चुना एक ४०% कमी और SSMD ≤-१.० थे । हिट चयन थ्रेशोल्ड लक्ष्य के लिए चुना है कि वृद्धि हुई IL-8 उत्पादन एक पांच गुना वृद्धि और SSMD > १.२८ थे ।

Figure 7
चित्र 7 : दोहरे टॉर्च HFA द्वारा IL-8 उत्पादन पर सिरना प्रभाव की साजिश-उजागर SV40-HCEC कोशिकाओं । दिखाए गए परिणाम छह प्रतिकृति (n = 6) के औसत हैं । IL-8 अभिव्यक्ति स्तर डेटा प्रकट नकारात्मक पूल सिरना के सापेक्ष एक गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और सांख्यिकीय महत्व SSMD द्वारा विश्लेषण किया गया था । हिट्स को लक्ष्य के रूप में परिभाषित किया गया था, जो il-8 के स्तर और SSMD ≤-१.० में ४०% की कमी थी, या आईएल-8 के स्तर और SSMD > १.२८ में पांच गुना वृद्धि हुई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

साथ ही हम HF और सीपी चोटों के अध्ययन के लिए एक उच्च प्रवाह कॉर्निया उपकला कोशिका स्क्रीनिंग मॉडल के विकास पर हमारे तरीकों और परिणामों का वर्णन. हम भी HF चोट के लिए प्राथमिक सिरना स्क्रीन से परिणाम प्रस्तुत करते हैं । वहां टिक चोटों के अध्ययन के लिए HTS मॉडलों के विकास के लिए कई चुनौतियां थीं । तरीकों कि हम सेल संस्कृति मॉडल में HF, HFA या सीपी के अध्ययन से संबंधित साहित्य में मिल सकता है थोड़ी मदद की थी । इन विट्रो में सबसे में फ्लोराइड आयन पर अध्ययन मौखिक कोशिकाओं और उपयोग सोडियम फ्लोराइड और नहीं HF या HFA (कुछ उदाहरणों के लिए, देखें28,29). पर कुछ पद्धति इन विट्रो में दमा उपकला कोशिकाओं की सीपी के लिए जोखिम Pesonen एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया है. 30. अंततः, हमें HF, HFA या सीपी के HTS अध्ययन से संबंधित साहित्य में कोई विशिष्ट विधियां नहीं मिलीं और HTS आवश्यक विकास में इन विषालु के अध्ययन से संबंधित चुनौतियों और चरों का विशाल बहुमत प्राप्त हुआ । विशेष रूप से ध्यान समय और कई स्क्रीनिंग एक सफल HTS अध्ययन के लिए आवश्यक प्लेटों में जोखिम स्थिरता के उच्च डिग्री प्राप्त करने के लिए भुगतान किया गया था ।

चुनौती का एक प्रकार का सामना करना पड़ा सेल संस्कृति प्रणालियों के लिए विषाक्त के आवेदन से संबंधित था । कुछ विषालु या तो साथ प्रतिक्रियाशील या जलीय समाधान में अस्थिर कर रहे हैं । विषालु हम अध्ययन के लिए चयनित इन अस्थिरता मुद्दों होने के रूप में नहीं माना जाता है । एक कृषि सीपी की जांच photohydrolysis अध्ययन से पता चला कि पानी में सीपी के ०.००१ मीटर समाधान ३१.१ के एक आधे जीवन था जब एक ११०० लक्स क्सीनन प्रकाश स्रोत के संपर्क में (एक बादल का एक दिन की धूप की तीव्रता) 10 दिनों के लिए, 12 घंटे31दिन प्रति । एक ही 10 दिन की अवधि में कोई औसत दर्जे का hydrolysis था जब समाधान अंधेरे में संग्रहीत किया गया था । HFA का प्रोटॉन और फ्लोराइड आयन पानी में साफ तौर पर स्थिर होते हैं । वहां रहे हैं, तथापि, सेल संस्कृति माध्यम में किए गए जहरीले कमजोर पड़ने के संबंध में अतिरिक्त स्थिरता विचार । हमने पाया है कि वहां कुछ हद तक cytotoxicity के एक प्रारंभिक परिवर्तन था जब विषालु पहले सेल संस्कृति के माध्यम में पतला है कि फिर समय की एक संक्षिप्त अवधि के बाद स्थिर थे । हमें विश्वास है कि इस विषैले बाध्यकारी या माध्यम में घटकों के साथ जटिल के कारण है । सेल मीडियम में कैल्शियम, मैग्नीशियम, प्रोटीन आदि होते हैं जो फ्लोराइड आयन३२,३३के साथ बातचीत करने के लिए जाने जाते हैं । सीपी जैविक thiols के साथ ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं के लिए जाना जाता है, लेकिन यह भी डीएनए, प्रोटीन, और अन्य nucleophiles३४,३५बाँध सकता है. एक बार इन प्रतिक्रियाओं और बातचीत पूरा हो गया है या संतुलन तक पहुंच, उपलब्ध विषाक्त की मात्रा स्थिर और इस प्रकार स्पष्ट cytotoxicity स्थिर । हम शुरू में काम कर रहे कमजोर पड़ने में मध्यम घटकों के साथ जहरीले बातचीत से बचने के लिए जोखिम के लिए इस्तेमाल किया शेयरों के लिए विषालु के खारा और जल कमजोर पड़ने के उपयोग का पता लगाया । खारा का उपयोग भी मध्यम विनिमय द्वारा प्रदर्शन किया जोखिम के लिए HFA चोट के एसिड घटक की रक्षा करेगा । हमने पाया है कि सेल मौत की प्रतिक्रियाएं पानी और खारा कमजोर पड़ने में विषालु के लिए विधि है कि मध्यम मुद्रा (डेटा नहीं दिखाया) के साथ सेल संस्कृति मध्यम कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया से अधिक चर रहे थे । HFA के साथ स्पाइक एक्सपोजर विधि के बारे में, परिवर्तनशीलता को अच्छी तरह से सेलुलर लक्ष्य उपलब्ध फ्लोराइड आयन के लिए मध्यम घटकों के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अग्रणी में फैलाने में विसंगति के कारण हो सकता है । HFA खारा कमजोर पड़ने के साथ मध्यम मुद्रा द्वारा HFA जोखिम में परिवर्तनशीलता के लिए कारण पूरी तरह से अस्पष्ट हैं । किसी भी घटना में, जोखिम HFA के लिए खारा कमजोर पड़ने का उपयोग तरीकों को छोड़ दिया और वाणिज्यिक पत्र के लिए नहीं टटोला गया । हमारे HFA कमजोर पड़ने की विषाक्तता के माध्यम में शायद बारीकी से सोडियम फ्लोराइड का उपयोग अध्ययन की नकल है क्योंकि कोशिका माध्यम हमारे HFA कमजोर पड़ने में मुक्त प्रोटॉन buffers.

अंय चुनौतियों का सामना करना पड़ा हम HTS में उपयोग के लिए सेल संस्कृति मॉडल के शोधन से संबंधित थे । हम यह प्रयोग में कोशिकाओं के लिए सेल संस्कृति मध्यम घटकों को संशोधित करने के लिए आवश्यक पाया, विशेष रूप से hydrocortisone और एंटीबायोटिक दवाओं । हम hydrocortisone के एक निंन स्तर का उपयोग (०.५ µ g/एमएल) जोखिम अध्ययन के दौरान भोली SV40-HCEC में देखा cytokine उत्पादन में कभी स्पाइक को दबाने के लिए । hydrocortisone की यह कम राशि प्रतिकूल कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को प्रभावित नहीं किया था और विषाक्त पदार्थों के नीचे आमतौर पर उत्तेजक३६,३७के जवाब में प्रसंस्कृत कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन को दबाने के लिए इस्तेमाल किया स्तर नीचे था. सही कारणों क्यों भोली SV40-HCEC कोशिकाओं को कभी-कभार अतिरिक्त साइटोकिंस का उत्पादन नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह संभव है कि कोशिकाओं को बदलती मामूली तनाव है कि कोशिका passaging और चढ़ाना के दौरान होने के लिए संवेदनशील हैं । कई प्रयोगशालाओं नियमित रूप से सेल संस्कृति रखरखाव माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं में शामिल हैं, लेकिन कुछ एंटीबायोटिक दवाओं, विशेष रूप से tetracyclines, corneal उपकला कोशिकाओं३८सहित प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर विरोधी भड़काऊ प्रभाव प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है. सामांय में, हमारी प्रयोगशाला एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग से बचा जाता है जब भी संभव हो सकता है इन अध्ययनों से पाया संभावित । हम भी संस्कृति में हमारी कोशिकाओं के कई मार्ग पर phenotypic बहाव की जांच की । यह घातक कोशिकाओं के लिए आम है आनुवंशिक और/या कई मार्ग पर phenotypic बहाव से गुजरना, अगर घातीय चरण में बनाए रखा नहीं है, यदि प्रवाह तक पहुंचने की अनुमति है, या यदि कुछ पर्यावरणीय तनाव को उजागर३९,४० ,४१. इसलिए, यह एक उच्च प्रवाह स्क्रीन के दौरान महत्वपूर्ण है कि कक्ष पंक्तियाँ ठीक से बनाए रखे जाते हैं और स्क्रीन ज्ञात phenotypic प्रतिक्रिया बनाए रखने वाले कक्ष गद्यांश संख्याओं का उपयोग करते हुए पूर्ण है । बहु-अच्छी तरह से प्लेट एज प्रभाव घटना है कि कोशिकाओं को बहु के बाहरी परिधि कुओं में हो अच्छी तरह से प्लेटें अक्सर ही जवाब नहीं है या इंटीरियर वेल्स४२में हो कोशिकाओं के रूप में एक ही निरंतरता के साथ । ऐसे औसत पॉलिश के रूप में सांख्यिकीय अभ्यास, कर रहे हैं, कि एक डेटा सेट४३पर बढ़त प्रभाव को कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, वहां कोई सांख्यिकीय व्यायाम है कि एक विशेष लक्ष्य या नियंत्रण पर बढ़त प्रभाव को समाप्त कर सकते है अगर यह हमेशा एक किनारे में अच्छी तरह से परीक्षण किया है, और दोहराने के बीच प्लेट लेआउट बदलती लक्ष्य या बंद किनारे कुओं से नियंत्रण नहीं है रसद व्यावहारिक या लागत प्रभावी । यह हमारी राय है कि कोशिका-आधारित HTS परख में धार कुओं के उपयोग को शामिल करने के निर्णय को सावधानी से किया जाना चाहिए. हम इसे नियंत्रण और लक्ष्य के लिए धार कुओं में उगाई कोशिकाओं के उपयोग को खत्म करने के लिए आवश्यक पाया ।

हमारे HTS सेल मॉडल और एक्सपोजर पद्धति के लिए इन विट्रो में HF चोट सफलतापूर्वक ३१२० लक्ष्यों की प्राथमिक सिरना स्क्रीन को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । SSMD हिट चयन के लिए प्रयोग किया जाता था क्योंकि यह विशेष रूप से एक नियंत्रण और एक सिरना27के बीच अंतर की भयावहता को मापने के लिए प्रस्तावित किया गया था । सेल व्यवहार्यता के लिए हमारे परिणाम बताते है कि वहां SSMD और गुना के बीच दोहरे टॉर्च की साजिश में एक रैखिक संबंध था-लगभग सभी लक्ष्यों के लिए बदल जाते हैं । इस कारण से, हम इस समापन बिंदु के लिए हिट चयन के लिए SSMD के एकल मापदंड का उपयोग किया । IL-8 डेटा है कि कुछ लक्ष्य कमजोर लेकिन लगातार प्रभाव था, जबकि दूसरों को मजबूत लेकिन असंगत प्रभाव दिखाया में मतभेद । इसलिए, हम दोनों फ़ोल्ड-परिवर्तन और इस समापन बिंदु के लिए हिट चयन मापदंड के लिए SSMD का उपयोग किया । दोनों सेल व्यवहार्यता और IL-8 डेटा के लिए हिट चयन के लिए इस्तेमाल किया SSMD मूल्यों क्योंकि 1 और १.६४५ (या-1 और-१.६५) के बीच कटऑफ कम झूठी खोज और गैर खोज दर४४प्राप्त करने के लिए चुना गया । वहां कुछ लक्ष्य है कि दोनों सेल व्यवहार्यता और IL-8 डेटा में हिट थे । इन मामलों में, deconvolution पुस्तकालय में शामिल करने के लिए वरीयता उन लक्ष्यों है कि समग्र स्वास्थ्य में सुधार लाने की एक ही दिशा में उनके प्रभाव डालती करने के लिए दिया गया था (सुधार व्यवहार्यता और कम IL-8) या गहरा चोट (बढ़ा सेल मौत और वृद्धि हुई IL-8) । कुल मिलाकर, हम HF चोट के लिए deconvolution पुस्तकालय बनाने के लिए सेल व्यवहार्यता और IL-8 अंतिमबिंदु के बीच २५० लक्ष्य की कुल का चयन किया । इन विट्रो CP चोट के लिए प्राथमिक स्क्रीन प्रगति पर है ।

सारांश में, हम जोखिम और संस्कृति HF और सीपी द्वारा नेत्र चोट के HTS अध्ययन के लिए उपयुक्त शर्तों का विकास किया है । जोखिम और संस्कृति की स्थिति में कई चर परिष्कृत और अनुकूलित किया गया है, और मॉडलों के लिए ' जेड कारक विश्लेषण द्वारा HTS अध्ययन के लिए उपयुक्त हो मांय थे । हम आगे HF मॉडल में एक सिरना पुस्तकालय की प्राथमिक स्क्रीन को पूरा करने से इन मॉडलों की उपयोगिता साबित किया है । वहां कई चोटों और रोगों है कि दवा या जैव प्रौद्योगिकी उद्योग के लिए कोई या सीमित ब्याज की हैं, सीपी और HF द्वारा विषाक्त चोट शामिल हैं, और benchtop रोबोटिक्स के आगमन वस्तुतः किसी भी प्रयोगशाला में चोटों और रोगों के HTS अध्ययन की सुविधा . उच्च प्रवाह जीनोमिक डेटा सेट बहुत भूमिकाओं है कि विशिष्ट जीन चोट या रोग जो अधिक कुशलता से ध्यान केंद्रित करने में मदद कर सकते है में खेलने की समझ में योगदान कर सकते है इन विट्रो या vivo अध्ययन में पर का पालन करें ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

अस्वीकरण: इस लेख में व्यक्त विचार लेखक (ओं) के है और सेना, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार के विभाग की आधिकारिक नीति को प्रतिबिंबित नहीं है । इस शोध NIH/NIAID और USAMRICD के बीच एक एजेंसी समझौते द्वारा समर्थित किया गया था, और भाग में स्नातकोत्तर अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम के लिए अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान संस्थान में एक नियुक्ति द्वारा ओक द्वारा प्रशासित रासायनिक रक्षा रिज विज्ञान और शिक्षा के लिए अमेरिका के ऊर्जा विभाग और USAMRMC के बीच एक एजेंसी समझौते के माध्यम से संस्थान ।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थानों प्रभावहीन कार्यक्रम एजेंसी समझौते # AOD13015-001 द्वारा समर्थित किया गया था । हम उनके प्रयासों और वीडियो उत्पादन पर विशेषज्ञता के लिए स्टेफ़नी Froberg और पीटर हर्स्ट शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

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References

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जीव विज्ञान अंक १३६ Chloropicrin हाइड्रोजन फ्लोराइड corneal उपकला कोशिकाओं corneal चोट सिरना उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग
Chloropicrin और हाइड्रोजन फ्लोराइड प्रेरित कॉर्निया उपकला कोशिका चोट के लिए उच्च प्रवाह सिरना स्क्रीनिंग
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Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

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