Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilecek önemli bir araçtır. Burada, biz geliştirme ve pozlama modelleri ve kornea epitel yaralanma hidrojen florür ve polis indüklenen yüksek aktarım tarama yöntemlerini doğrulama mevcut.

Abstract

Kimyasallar hızla önemli doku hasar potansiyeline sahip çünkü oküler yaralanma toxicant kaynaklı bir gerçek oküler acil durum. Belirli hiçbir tedavi var yaraların tedavisi için kornea yaralanma toxicant kaynaklı tedavisi genellikle destekleyici şunlardır. Tedaviler ve tedavi için poz bakım geliştirmek için çabalarında yaraların moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak önemli olabilir. Önerdiğimiz kullanımı yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA (siRNA) tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilir önemli bir araç olabilir. siRNA Homoloji siRNA için olan 19-25 nükleotit uzun ve mRNA düşmesine yol susturmak çoğu gen kullanmak çift telli RNA molekülleri vardır. Bu gen toxicant hücresel yanıt olarak işlev görmeye yaydıkları maruz kalan hücrelerdeki belirli bir gen ifadesi elde edilen azalma daha sonra çalıştı. Geliştirme ve vitro pozlama modelleri ve yöntemleri (HTS) hidrojen florür-(HF) ve polis indüklenen-(CP) oküler yaralanma eleme yüksek üretilen iş için doğrulama Bu makalede sunulmaktadır. Biz bu iki toxicants seçilmiş olsa da, bizim yöntemleri diğer toxicants çalışma odasına yaydıkları pozlama Protokolü küçük değişiklikler ile geçerlidir. SV40 büyük T antijen SV40-HCEC çalışması için seçilen insan kornea epitel hücre satırı ölümsüzleştirdi. Hücre canlılığı ve Il-8 üretim tarama protokol bitiş noktaları olarak seçildi. Birkaç zorluklar yaydıkları pozlama gelişimi ile ilişkili ve hücre kültür yöntemleri HTS çalışmaları için uygun sunulmaktadır. HTS modelleri için bu toxicants kurulması için potansiyel therapeutics kimyasal oküler yaralanma yaralanma ve ekran mekanizması daha iyi anlamak daha fazla çalışmaları sağlar.

Introduction

Kimyasallar hızla önemli doku hasar potansiyeline sahip çünkü oküler yaralanma toxicant kaynaklı bir gerçek oküler acil durum. Belirli hiçbir tedavi var yaraların tedavisi için ne yazık ki, kornea yaralanma toxicant kaynaklı tedavisi sadece genellikle destekleyici şunlardır. Geçerli tedavi stratejisi belirsiz ve öncelikle yağlama maddeleri, antibiyotik, gibi topikal tedavi tedaviler içerir ve cycloplegics takip antiinflamatuar (Örneğin, steroid) tarafından bir kez kornea1 yeniden epithelialized ,2. En iyi mevcut tedavi seçenekleri rağmen uzun vadeli prognoz genellikle ilerici kornea clouding ile neovaskülarizasyon2,3nedeniyle kötüdür.

Hayvan modelleri geleneksel kimyasal toksisitesi araştırmak ve yaralanma mekanizmaları anlamak için kullanılmaktadır. Ancak, zaman alıcı ve pahalı hayvan çalışmaları vardır. Ayrıca çabaları hayvan test azaltmak için vardır. Örneğin, REACH mevzuatı (EC 1907/2006) Avrupa Birliği'nde hayvan test azaltmak amacıyla hükümler vardır. Hükümler şirketler hayvan test ve Önerilen testleri hayvanlar üzerinde gerçekleştirmeden önce Avrupa Kimyasallar Ajansı onayı önlemek için veri paylaşmak bir gereklilik içerir. REACH hükümleri altında hayvan testleri son çare olmalı. Avrupa kozmetik kozmetik hayvanlarda test dışarı aşamalı yönetmelik (EC 1223/2009) da vardır. Hayvan çalışmaları yürütülen zaman 3Rs ilkeleri tarafından yönlendirilir (arıtma, azaltma ve değiştirme) hangi daha insancıl hayvan araştırma, kullanılan hayvan sayısını azaltarak ve hayvan-alternatifleri kullanma için bir çerçeve sağlamak Mümkünse. Bu nedenlerden dolayı toksikoloji alan toksisite moleküler mekanizmaları içgörü sağlayabilir ve daha yüksek üretilen iş4' te yapılabilir vitro deneyleri benimsemeye araştırmıştır. Bu toxicants onların işlevini yerine yalnızca onların Kimya tarafından tanımlandığı bir işlevsel toksikoloji yaklaşımdır. Bir adım daha ileri, fonksiyonel alınan toxicogenomics aramak toxicants5etkileri belirli genler oynamak rolleri anlamak. SiRNA teknoloji uygulaması ile moleküler ve hücresel yanıt-e doğru toxicants işlevinde gen araştırmak üzere filtreleri yüksek üretilen iş yapılabilir. siRNA 19-25 nükleotit bu yazı transkripsiyon gen silencing yolu tüm memeli hücreleri6' mevcut yararlanmak uzun olan çift iplikçikli RNA molekülleri vardır. Bunlar sentetik yapılır ve belirli bir gen hedeflemek için tasarlanmış. Bir hücreye tanıttığında, siRNA işlenir ve bir iplikçik, Kılavuzu strand, RNA-induced silencing tesisin (RISC) yüklenir. Bir mRNA molekülü tamamlayıcı bir bölgesine RISC siRNA yönlendirir ve RISC mRNA düşer. Bu belirli bir gen ifadesi azalma olur. Bu gen toxicant hücresel yanıt olarak işlev görmeye yaydıkları maruz kalan hücrelerdeki belirli bir gen ifadesi elde edilen azalma daha sonra çalıştı. Böyle bir yaklaşım daha "risin" duyarlılık mekanizmaları ve CYP1A17,8AHR bağımlı indüksiyon anlamak için kullanılmıştır.

Kimyasal terörizm Risk değerlendirmesi (CTRA) listesi ve toksik endüstriyel kimyasalları (TIC) listeleri seçme kimyasal toksisitesi ve potansiyel bir terörist, savaş veya endüstriyel kaza olay9sırasında yayımlanması için bağlı maddeler halinde. Bir siRNA yüksek işlem hacmi (HTS) toxicogenomic yaklaşım terör olayı kullanım yüksek riskli olarak tespit edilmiştir CTRA listesi toxicants incelenmesi için eleme uygulamaktayız. Geleneksel toksikoloji kimyasalları canlı organizmalar üzerinde var olumsuz etkileri anlamak istiyor; Ancak, tedavi ve tedavi yaklaşımları ve büyük olasılıkla, kalkınma bilgilendirmek amacıyla yaralanma mekanizmaları anlamak için daha fazla bir arzusu var terapötik geliştirme için hedeflenen molekülleri keşfedin. Bu çaba bazı yönlerden benzer şekilde yüksek işlem hacmi siRNA tarama ve temel hücre deneyleri ilaç bulma işlemi10kullanımı daha kabul edilebilir. Büyük bir fark bizim yaklaşım bu yaydıkları pozlama tedavisi için yüksek terapötik değeri ile tekil bir hedef olurdu biraz düşüktür, ancak bu ilaç keşif genellikle tekil bir hedef tedavi bulma istiyor olurdu. Biz herhangi bir etkili tedavi paradigma yaydıkları pozlama için yüksek terapötik değeri elde etmek için çok yönlü bir yaklaşım gerektirir ve toxicogenomic veri hayati bir etkili tedavi paradigma bilgilendirebilir tahmin.

Benchtop Otomasyon laboratuvarları dışında ilaç ya da biyoteknoloji sanayi yüksek işlem hacmi metodoloji getiriyor. Vitro çalışmalar bizim Enstitüsü'nde tarihsel iş hızı düşük11,12,13olan geleneksel deneyleri edilmiştir. Son birkaç yıl içinde bizim laboratuvar yüksek işlem hacmi siRNA tarama gerçekleştirmek için benchtop robot kullanımına geçiş. Burada, biz oküler hücre modelleri zerafet ve vitro gelişimi hidrojen florür (HF) ve polis (CP) yüksek işlem hacmi siRNA tarama için uygun pozlama yöntemleri mevcut. Amacımız bu toxicants karşılık olarak hücresel yaralanma düzenleyen molekülleri belirlemektir. Bizim seçtiğimiz siRNA Kütüphane hedefleri G protein birleştiğinde reseptörleri, protein kinaz, proteaz, fosfatazlar, iyon kanalları ve diğer potansiyel olarak druggable hedefleri içerir. HF ve CP için çalışma CTRA liste ajanlar endüstriyel kazaların ToxNet raporlarla çapraz gönderme yapmak en büyük risk buharı pozlama9,14ile oküler yaralanma mevcut bulmak için seçildi. CP (kimyasal formülü Cl3Kao2, CAS numarası 76-06-2) WWI15dakika sonra bir göz yaşartıcı gaz olarak kullanılan özgün. Şu anda tarım bir tütsü ve işlevler bir nematicide, fungisit ve böcek ilacı16kullanılır. Hidrojen florür (HF) petrol rafinerileri ve organik bileşikler17elektrokimyasal fluorination alkillenme dahil süreçlerinde kullanılır. HF (kimyasal formülü HF, CAS numarası 62778-11-4) bir gaz ama sulu haliyle hidroflorik asit (HFA, CAS sayı 7664-39-3). Bu yüzden, HFA içinde bizim hücresini kullanın seçildi pozlama modelleri. SV40 büyük T antijen SV40-HCEC çalışması için seçilen insan kornea epitel hücre satırı ölümsüzleştirdi. Hücresel yaralanma söz konusu hedef hücre ölümü ve inflamatuar yanıt yansıtılması gerekir çünkü hücre canlılığı ve inflamatuar marker Il-8 bitiş noktaları seçildi. Bir hedef olarak yaydıkları pozlama koruyucu bir rol oynamaya olsaydı, ne zaman hedef ifadesi siRNA tarafından inhibe özellikle, hücre ölümü ve/veya inflamatuar sitokin üretim artacaktır. Tam tersi olumsuz rol oynayan hedefler için doğru olurdu. Ayrıca, kronik inflamasyon pozlama ve hücre ölüm yolları müdahale klinik sonuç2,18artırabilir sonra kornea patolojisi bir rol oynamaya görünür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültür bakım

  1. 37 ° C, % 5 CO2ve DMEM F-%12 90 nem ile % 15 fetal Sığır serum (FBS), hücre kültürünü SV40-HCEC büyümek %1 L-glutamine, 10 µg/L epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 5 mg/M insülin.
  2. Hücre (bağlı olarak sağlanan yoğunluk) her 3-4 gün confluency hiç kültür bakım sırasında % 80'i aşan sağlamak için geçiş.
  3. Bir dekolmanı çözüm (her 150 cm2 şişe için 14 mL solüsyon) ve kuluçka en fazla 8 dk. 37 ° C'de kullanarak şişeler hücrelerden bağlantısını kesin.
  4. Hücre kültür ortamının eşit bir birimdeki dekolmanı çözüm nötralize ve 160 x g de 7 dk aralıklarla tarafından 50 mL konik tüpler hücrelerde cips.
  5. Hücre Pelet Orta (her 150 cm2 şişe için 20 mL) yeniden askıya alma.
  6. Bir otomatik el hücre sayaç ve 3-4 gün için % 80 confluency aşmadan büyümek için onlara izin verir bir yoğunluk itibariyle yeni şişeler içinde tohum içeren hücreleri saymak.

2. plaka hücreleri deneme için

  1. SV40-HCECs şişe o confluency emin olmak için faz kontrast ışık mikroskobu ile % 80'den ve genel hücre sağlık değerlendirmek için kontrol edin.
  2. Ayırmak, cips, resuspend ve SV40-HCECs hücre kültür bakım 1.3-1.6 adımlarda açıklandığı gibi şişeler gelen saymak. SV40-HCEC orta 0,5 µg/mL hidrokortizon (HCORT orta) içeren hücreleri resuspend için kullanın.
  3. Tek kullanımlık orta şişede bir süspansiyon SV40-HCECs önceden ısıtılmış HCORT Orta 17,857 hücre/mL, hazır olun.
    1. Hücre süspansiyon yeterli hacmi plaka numaralı seribaşı sayıda için hazırlayın.
    2. 14 x 96-şey plakaları belirlenmesi her siRNA Kütüphane plaka için hücreler en az tohum.
  4. Eşit olarak hücreleri askıya alma, yeterli bir birim hücre süspansiyon, bir otomatik sıvı işleyicisi orbital çalkalayıcı yuva üzerinde bir rezervuar içine dökün ve 37 ° c plaka hücre kaplama sırasında ısınma hücre süspansiyon içeren şişe depolamak için şişe girdap işlem.
  5. Otomatik sıvı işleyicisi içinde orta iyi bir 96-şey plaka başına 70 µL tabak iyi (5000 hücre/cm2) başına 1000 hücre yoğunluğu, hücreleri eklemek için kullanın. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. Orbital çalkalayıcı sürekli tohumlama işlemi sırasında 100 rpm'de çalıştırın.
    2. Hücre süspansiyon üç (140 µL karışımı cilt) mix otomatik sıvı işleyicisi kullanarak.
    3. Hücre süspansiyon 140 µL Aspire edin ve 70 µL iki hücre kültür tabak her kuyuya dağıtmak.
    4. Tüm plakaları hücrelerle seribaşı 2.5.3 ve 2.5.4 tamamlayana dek.
    5. Hücre süspansiyon rezervuar tohumlama işlemi sırasında gerektiği gibi doldurun.
  6. Tabakları seribaşı sonra otomatik sıvı işleyicisinden çıkarıp onları bir hücre kültür kuluçka aktarmadan önce oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya
  7. Her şey her plaka için hücre yoğunluğu aşağıdaki sabah bir hücre kültür kuluçka makinesine ev sahipliği yapmaktadır ve % 15 ve % 22 birleşmesi arasında değildir iç kuyu var çalışmada herhangi bir tabak dışlamak bir otomatik görüntüleme sistemini kullanarak değerlendirmek.

3. transfect hücreleri ile siRNA

  1. SiRNA Kütüphane plakaları 80 siRNA hedefinde de plaka başına için önceden yapılandırılmış satıcıdan elde (bkz. Şekil 4), sütun 1 ve 12 ile sol boş.
  2. 2 pmol/µL siRNA üreticinin yönergeleri19göre her şey için son bir konsantrasyon siRNA arabelleğe siRNA Kütüphane plakalı sulandırmak.
  3. Hücreleri 24 h siRNA 4 pmol/kuyu ve 0.3 µL/iyi transfection reaktif ile tohum sonra transfect. Transfection reaktif üreticisinin protokolüne göre tüm adımları uygulayın (bkz Şekil 4 plaka düzeni için)20.
    1. Tek bir otomatik sıvı işleyicisi kullanarak transfections gerçekleştirmek ve bir 25 kullanmak için tüm adımları µL/s pipetting hız. Sadece transfected kuyuları adresi için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın.
    2. Kütüphane plaka altı Çoğalt plakaları bir dizi transfect yarısı anılacaktır "üst plaka grubu olarak" üst kullanın (altı çoğaltır siRNA, n = 6).
    3. Kütüphane plaka altı Çoğalt plakaları farklı bir kümesi transfect yarısı anılacaktır "alt plaka grubu olarak" alt kullanın (altı çoğaltır siRNA, n = 6).
    4. "Tam plaka ayarla" terimi ile Kütüphane siRNA transfected 12 hücre plakaları açıklamak için kullanın.
    5. Tüm üst ve alt plaka setleri Kütüphane siRNA ile transfected sonra kuyu B2-B6 plaka tam kümesi ile negatif havuzu siRNA içindeki tüm plakaları yapımı transfect.
    6. Ayrıca kuyu B2-B6 Kütüphane siRNA almazsınız ve yıkamaya denetimleriyle (bir üst plaka kümesi için) ve bir alt plaka seti için negatif havuzu siRNA işlevi görecek başka bir iki tabak transfect.
  4. Tüm hücre plakaları bir hücre kültür kuluçka 4 saat sonra bütün transfection karışımları eklendi ve karıştırmak için her saat dokunarak hafif tarafından kuluçkaya.
  5. Kullanım önceden ısıtılmış HCORT orta ile iki kez plakaların bütün wells yıkamak için otomatik sıvı işleyicisi 1:5 PBS içinde seyreltilmiş. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. Her kuyudan 100 µL Aspire edin ve atık bir rezervuar atın.
    2. Her şey 100 µL/iyi için eklemek önceden ısıtılmış HCORT orta plakaları sayısı için yeterli hacmi itibariyle farklı bir rezervuar bulunan 1:5 içinde PBS seyreltilmiş.
    3. Adım 3.5.1 ve 3.5.2 her plaka için yineleyin.
      1. Atık haznesi gerektiği gibi boş.
      2. Yedek su deposu HCORT orta ile 1:5 gerektiği gibi PBS içinde seyreltilmiş.
    4. Her kuyudan 100 µL Aspire edin ve bu atık göle atın.
  6. Bütün wells ile farklı bir rezervuar orta plakaları sayısı için yeterli bir ses seviyesinde bulunan 100 µL/iyi önceden ısıtılmış HCORT orta, plakaların refeed.
    1. Havzanın orta ile gerektiği gibi doldurun.
  7. Kuyu C2-C6 tüm plakaları yapımı sigara transfected denetimleri kullanın.
  8. Wells B7-B11 ve C7-C11 tüm levhaların sigara-ilaç ve araç denetimleri yaydıkları pozlama için kullanılmak üzere transfected devam et.

4. refeed hücreleri aşağıdaki gün

  1. Bir otomatik sıvı işleyicisi plakaların bütün wells refeed için kullanın. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. Her kuyudan 100 µL Aspire edin ve atık bir rezervuar atın.
    2. Her farklı bir rezervuar olarak bulunur ve orta refed için tabak sayısı için yeterli bir hacmi vardır de 100 µL/iyi önceden ısıtılmış HCORT orta ile refeed.
    3. 4.1.1 ve tüm hücre plakaları refeed için gerektiği kadar 4.1.2 adımları yineleyin.
      1. Atık haznesi gerektiği gibi boş.
      2. Havzanın orta ile gerektiği gibi doldurun.

5. olumlu denetim ekleme

  1. İki gün sonra transfection ve pozlama önce iki saat HFA pozlama için kullanılan ve bir 8-satır seyreltme rezervuar B satır eklemek için HCORT ortamda pozitif kontrol cardamonin 62.5 µM çözeltisi hazırlamak.
    1. CP maruz kalma, hazırlamak ve SKF 86002 bir 25 µM çözümü kullanın.
    2. Pozitif kontrol test plakaları sayısı için yeterli hacmi hazırlayın.
  2. %0.625 çözeltilerine DMSO HCORT Orta (araç kontrol) hazırlamak ve aynı rezervuar C satırına ekleyin.
    1. CP maruz kalma, hazırlamak ve DMSO, % 0.5 çözüm kullanın.
    2. Araç kontrol test plakaları sayısı için yeterli hacmi hazırlayın.
  3. Wells B7-B11 ve C7-C11 her hücre plaka pozitif ve araç denetimleri eklemek ve bir 50 µL/s pipetting kullanmak için otomatik sıvı işleyicisi hız için tüm adımları kullanın. Yalnızca pozitif ve araç denetimleri alacaksınız kuyuları adresi için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın.
    1. Orta 10 µL kuyulardan B7-B11 ve C7-C11 her hücre plaka kaldırmak ve G ve H 8 satırlık seyreltme baraj gölünün satır atın.
    2. Bu wells için olumlu ve araç kontrolleri 10 µL aktarım ve 3 kez karıştırın.
  4. Bu hücre tabakları da kuluçka için dönmek.
  5. Adımları tüm hücre plakaları olumlu almış kadar 5.4 5.3 ve araç kontrolleri tekrarlayın.

6. HF pozlama kültürlü hücre

Dikkat: HFA aşındırıcı ve akut toksik.

  1. Çift Kişilik nitril eldiven, bir laboratuvar ceket, tek kullanımlık polietilen kol koruyucular ve koruyucu gözlük takan bir kimyasal duman mahallede tüm kimyasal maruziyet işlemleri.
    1. HFA % 48 çözüm olarak elde.
    2. HFA Ultrasaf Su ile % 1 oranında seyreltin ve 5 mL aliquots güvenliğini artırmak için 10 mL kalın duvar Polietilen şişeler içinde saklayın.
    3. Pipet ipuçları ve HFA ve artık herhangi bir sıvı HFA % 2.5 Kalsiyum glukonat tehlikeli atık akışı konusunda önce ile temas rezervuarlar dezenfekte etmek.
  2. 288 µL % 1 ekleyerek bir %0.0036 HFA orta çözüm soruşturma altında her siRNA Kütüphane plaka için hazırlamak HFA 80 ml 150 mL şişe önceden ısıtılmış HCORT orta.
    1. Şişe girdap ve 10 min için kimyasal duman başlıklı bir 37 ° C kuluçka seyreltik HFA kuluçkaya.
  3. HFA orta çözüm yine şişe dönen tarafından mix ve daha sıcak bir tabakta bir reaktif rezervuar HFA orta çözüm ekleyin.
  4. İki teknisyen tandem çalışma ile pozlama gerçekleştirin.
    1. Her bir hücre tabak 12 Kanal pipettor kullanarak iç Wells doğru aspiratı 100 µL teknisyen var ve sonra plaka teknisyen için sol tarafta.
    2. HFA orta çözüm kuyu başına 100 µL eklemek teknisyen soldaki var.
    3. Toxicant için maruz olan tüm hücre plakaları için 6.4.1 ve 6.4.2 adımları yineleyin.
    4. Ayrıca adım 6.4.1 ve 6.4.2 yıkamaya kontrol levha, taze HCORT orta HFA orta çözüm yerine kullanmak için yineleyin.
  5. Kimyasal duman hood kuluçka 20 dk için tabak yerleştirin ve sonra da hücre kültür kuluçka getirin.
  6. Tüm plakaları maruz ve hücre kültür kuluçka için döndürülen bir kez daha önce gösterildiği olumlu denetim ek (adım 5.1-5,5) arasındaki adımları yineleyin.

7. CP pozlama kültürlü hücre

Dikkat: CP akut toksik ve tahriş edici olduğunu.

  1. Çift Kişilik nitril eldiven, bir laboratuvar ceket, tek kullanımlık polietilen kol koruyucular ve koruyucu gözlük takan bir kimyasal duman mahallede tüm kimyasal maruziyet işlemleri.
    1. CP elde etmek.
    2. CP DMSO % 5 oranında seyreltin ve 10 mL aliquots güvenliğini artırmak için 10 mL mercek şişeleri içinde saklayın.
    3. Pipet ipuçları ve CP ve artık herhangi bir sıvı CP % 2.5 Sodyum bisülfit tehlikeli atık akışı konusunda önce ile temas rezervuarlar dezenfekte etmek.
  2. 1 x kalem/Strep ve önceden ısıtılmış PBS için tabak sayısını maruz içeren önceden ısıtılmış HCORT orta yeterli hacim hazırlayın.
  3. Her takım üst plaka veya alt plaka kümesi için % 5'lik 8,04 µL eklemek CP DMSO 50 mL aliquot önceden ısıtılmış HCORT orta ve %0.0008 son CP konsantrasyon için de karışımı için. Tüp sıkıca kap ve çözüm için 1 h kimyasal duman başlıklı bir 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
    1. CP ek olarak orta 50 mL aliquots böylece her takım üst plaka maruz ve CP orta 50 mL aliquot eklendikten sonra alt plaka ayarla toxicant tam olarak 1 h alır zaman.
  4. Bir takım üst plaka ve 1 yıkamaya kontrol plaka hücre kültür kuluçka kaldır ve kimyasal duman başlıklı kuluçka dönemi sonuna yakın koyun.
  5. Tüp ters çevirme tarafından CP çözüm mix ve bir reaktif rezervuar 1s kuluçka dönemi sonunda o zaman dikkatle boşaltmak.
  6. İki teknisyen tandem çalışma ile pozlama gerçekleştirin.
    1. Her bir hücre tabak 12 Kanal pipettor kullanarak iç Wells doğru aspiratı 100 µL teknisyen var ve sonra plaka teknisyen için sol tarafta.
    2. CP orta çözüm kuyu başına 100 µL eklemek teknisyen soldaki var.
    3. 7.6.1 7.6.2 için toxicant maruz takım üst plaka tüm hücre plakaları için aygıtlarından.
    4. Ayrıca adım 7.6.1 ve 7.6.2 yıkamaya kontrol levha, taze HCORT orta CP orta çözüm yerine kullanmak için yineleyin.
  7. Tabakları bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi kimyasal duman başlıklı 10 dakika yerleştirin.
  8. 1 içeren PBS ve HCORT orta yeterli bir birim eklemek kalem/Strep 10 dk kuluçka dönemi sonuna yakın reaktif rezervuarlar için x.
  9. CP çözüm hücre plakalar 12 Kanal pipettor kullanarak kaldırın ve 10 dk kuluçka dönemi sonunda PBS kuyu başına 100 µL ile değiştirin.
  10. Hemen PBS hücre plakalar kaldır ve 1 içeren HCORT orta kuyu başına 100 µL onun yerine kalem/Strep x.
  11. Ayrıca adımları 7.9 ve 7.10 yıkamaya denetim plakalar için yineleyin.
  12. Hücre plakaları standart hücre kültür kuluçka dönün.
  13. 7.3-7.12 alt plaka ayarlamak için yineleyin.
  14. Tüm plakaları maruz ve hücre kültür kuluçka için döndürülen bir kez daha önce açıklandığı gibi olumlu denetim ek (adım 5.1-5,5) arasındaki adımları yineleyin.

8. örnek toplama ve hücre canlılığı tahlil

  1. Yirmi dört saat sonra pozlama, glikoz içeren 10 g/M PBS 0,5 mg/mL MTT substrat çözeltisi hazırlamak ve 37 ° C21' e sıcak. 10 mL substrat denetlesinler her plaka için hazırlayın.
  2. Denetlesinler plakaların numarası için bir rezervuar bir otomatik sıvı işleyicisi üzerinde yeterli hacmi MTT substrat çözeltisi ekleyin.
  3. Örnek toplamak ve MTT substrat 50 µL/s pipetting kullanarak eklemek için otomatik sıvı işleyicisi hızlandırmak için tüm adımları kullanın. Denetlesinler için sadece bu kuyu adrese ucu kutuları önceden yapılandırın.
    1. Hücre plaka ve mevduat 42.5 µL her iki 384-iyi depolama tabak içine iç 60 kuyulardan aspiratı 95 µL of orta.
    2. Hemen 100 µL MTT substrat çözeltisi kuyu başına hücre tabak eklemek ve onları bir hücre kültür kuluçka 1,5 saat için 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Havzanın gerektiği gibi MTT substrat çözeltisi ile tekrar doldur.
  4. Hücre plakaları bir hücre kültür kuluçka için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  5. 384-iyi depolama plakalarının ve daha sonraki analiz için-80 ° C'de depolayabilirsiniz.
  6. 8.3-8,5 tüm üst ve alt plaka kümeleri ve ilişkili yıkamaya denetimler için yineleyin.
    1. İpuçları çoğaltır arasında istenen, ancak onları yıkamak MTT substrat çözeltisi ve ne zaman plaka arasında geçiş ayarlar eklerken yeniden.
  7. 1 h kuluçka sonra DMSO yeterli hacmi bir rezervuar üzerinde bir otomatik sıvı işleyicisi ekleyin.
  8. DMSO eklemek ve bir 50 µL/s pipetting kullanmak için otomatik sıvı işleyicisi hızlandırmak için tüm adımları kullanın.
    1. Her hücre plakaların iç Wells 100 µL Aspire edin ve MTT substrat çözeltisi atık bir rezervuar atın.
      1. Atık haznesi gerektiği gibi boş.
    2. Her şey 100 µL DMSO ile yerleşimi.
      1. DMSO rezervuar gerektiği gibi doldurun.
  9. Plakaları 3 min için bir plaka shaker sallamayın.
  10. Bir plaka spektrofotometre kullanarak 570 ve 690 nm absorbans ölçmek.
  11. Arka plan çıkarmak ve yıkamaya denetimler tarafından maruz absorbans değerleri bölerek % hücre canlılığı hesaplayın. Ortalama yıkamaya negatif havuzu siRNA kontrol % hücre canlılığı tüm hedefler için hesaplamak için kullanın.

9. ölçü Il-8 konsantrasyon hücre kültür Supernatants

  1. Ölçü Il-8 konsantrasyon Hayır kullanarak hücre kültür supernatants boncuk tabanlı tahlil üreticinin yönergeleri22göre yıkayın. Örnekleri ve standart eğri karşılamak için bir tahlil plaka düzeni oluşturun.
  2. 384-iyi depolama plakaları-80 ° C dondurucudan kaldırmak, oda sıcaklığında erimek ve kuyu dibinde örnek toplamak için tabak kısaca santrifüj kapasitesi.
  3. Çalışmasına tahlil plaka numarası için yeterli hacmi anti-IL-8 alıcısı boncuk ve biotinylated anti-IL-8 antikor tahlil arabelleği kit ile birlikte olun. Anti-IL8 alıcısı boncuk 50 µL ve biotinylated anti-IL8 antikor tahlil arabelleği 9.9 ml 50 µL oranı kullanın.
    1. Çok kanallı bir pipettor kullanarak, bir siyah 384-iyi depolama plakasına boncuk/antikor karışımı ekleyin.
      1. Kullanım örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri için belirlenmiş wells alıcısı boncuk/antikor ekleyin.
      2. İyi çalışmasına tahlil tabak sayısı için yeterli bir ses ekleyin.
  4. Il-8 Standart 1000 pg/ml hücre kültür 354 µM içeren orta kullanarak sulandırmak NaCl. Çalıştırılacak tahlil tabak sayısı için yeterli hacim yapmak.
  5. Sekiz iki kat seri dilutions standart eğrinin olun.
  6. Standart eğri bir siyah 384-iyi depolama tabak tahlil plaka düzen göre uygun kuyu nüsha ekleyin. İyi çalışmasına tahlil tabak sayısı için yeterli bir ses ekleyin.
    1. Benzer şekilde, hücre kültürü 354 µM içeren orta eklemek NaCl ile arka plan ölçüm için hiçbir Il-8.
  7. Bir otomatik sıvı işleyicisi tahlil gerçekleştirmek için kullanın. Sadece tahlil plaka düzeni tarafından belirlenmiş wells adresi için önceden yapılandırılmış uç kutularını kullanın. Bir 50 µL/s kullanmak için tüm adımları pipetting hız.
    1. 8 µL alıcısı boncuk-antikor karışımı beyaz 384-şey sığ iyi tahlil plakaları wells için transfer.
      1. Sadece örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri için belirlenmiş wells ekleyin.
    2. Standart eğrinin 2 µL tahlil plaka düzen göre sığ iyi tahlil plakaların uygun kuyu aktarın.
    3. 3.54 M NaCl çözüm hazırlamak ve plakaları için otomatik sıvı işleyicisi üzerine sığ bir rezervuar denetlesinler sayısı için yeterli birim ekleme.
    4. Standart eğri NaCl çözüm 4,5 µL siyah 384-iyi depolama plakaları örneklerinde aktararak eşleşmesi için örnekleri tuz konsantrasyonu ayarlayın.
    5. Üç kez 30 µL karıştırma hacmi kullanarak örnekleri mix ve transfer 2 µL sığ beyaza örneklerin de tahlil plakaları tahlil plaka düzen göre.
      1. İpuçları örnek plakalar arasında değiştirin.
    6. İçinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    7. Çalışmasına tahlil plaka numarası için yeterli hacim alıcısı boncuk tahlil arabellekte olun. İkincil alıcısı boncuk tahlil arabelleği 12.3 ml 200 µL oranını kullanın.
    8. Çok kanallı bir pipettor kullanarak, ikincil boncuk siyah 384-iyi depolama plakasına ekleyin.
      1. Kullanım örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri için belirlenmiş wells için ikincil boncuk ekleyin.
      2. İyi çalışmasına tahlil tabak sayısı için yeterli bir ses ekleyin.
    9. Otomatik sıvı işleyicisi kullanarak, ikincil boncuk 10 µL beyaz 384-şey sığ iyi tahlil plakaları wells için transfer.
      1. Sadece örnekleri ve tahlil plaka düzen göre standart eğri alınan kuyu ekleyin ve her plaka arasında ipuçları yıkayın.
    10. Bir saat içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında için kuluçkaya.
  8. Tabak tabak mühürler temizleyin ve tahlil ile uyumlu bir plaka okuyucu kullanarak tarama tahlil kapatın. 0.2 mm mesafe plaka ve dedektör, 180 ms uyarma süresi ve 550 ms ölçüm süresi arasında tarama için kullanın.
  9. Ham verileri bir elektronik tabloya Il-8 deneyleri alın.
  10. Il-8 deneyleri standart eğri için uygun otomatik eğri'yi kullanın ve ardından pg/ml her örnek için ham veri dönüştürebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pozlama Yöntem geliştirme

Biz rafine ve HTS çalışmalarda kullanılmak insan kornea epitel hücre satırı SV40-HCEC uygunluğu değerlendirilir. SV40-HCEC SV-40 büyük T antijen kullanarak ölümsüzleştirdi ve Dhanajay Pal23hediyeydi. Çok fazla değişken kısaca burada sunmak için pozlama metodoloji geliştirme keşfedilmeyi vardı ve bu yüzden, biz inanıyoruz bulgular bazı örnekleri daha geniş olabilir sadece için birden çok toxicants sunulmaktadır.

Spike veya medyası takası yaydıkları pozlama

Başlangıçta orta son istenen pozlama konsantrasyonu elde etmek için bir 96-şey tabak zaten mevcut hücreleri her kuyuya 95 µL içine su, tuz veya orta seyreltilmiş toxicant bir çalışma konsantrasyonu spiking 5 µL tarafından hücreleri göstermek istedi. SV40-HCEC maruz bu spike maruz refeed/1 X LD-50 HFA 24 h için metodoloji kullanarak (1 X LD50 = %0.02 HFA HFA spike ortamda düşürülmüştü bu yöntem tarafından), ve kuyu daha sonra taze orta 10 dk ile refed. 24 saat sonra hücreleri hücre canlılığı tahlil için yukarıda açıklandığı gibi MTT substrat ile overlaid. Görüntüleri DMSO ile formazan kristallerinin solubilization için photomicroscopy baş rahip tarafından ele geçirildi. Wells yakın muayene gösterdi hücre ölümü büyük ölçüde bir yerde lokalize ve plaka için 15 sarsıldı aslında rağmen bu s hemen sonra iğnenin tüm plaka (Şekil 1a) eklendi. Bu olay ne zaman sivri ucu ne zaman ve de eklendi, menisküs altına eklendi gözlendi. Hücreleri faz kontrast gösterildiği kullanarak bu alanı bir daha yüksek büyütme görüntüsünü MTT (Şekil 1b) tarafından günahı alan hala mevcut. Biz de açığa refeed/metodoloji nerede orta ile hücre kültür HFA 1 X LD50 içeren orta yerine kuyulardan çıkarılmış bir medyası takası test (1 X LD50 = %0.035 HFA bu yöntem tarafından) ve kuyu ile taze orta 10 dk refed daha sonra. 24 saat sonra hücreleri MTT substrat ile yukarıda açıklandığı gibi overlaid. Bu yöntem bir görünüşe göre daha fazla bile hücre ölüm yanıt her şey (Şekil 1 c ve 1 d) içindeki hücreleri elde. Yıkamaya denetimleri başvuruları için sağlanmıştır ve hücre ölümü (Şekil 1e ve 1f) yerelleştirilmiş yok alanlarını göstermek. CP pozlama için büyük ölçüde her şey içinde bir nokta için yerelleştirilmiş hücre ölümü spike yöntemi sonuçlanmamıştır; Ancak, hücre ölüm yanıt daha tutarlı bir yinelemeden diğerine medyası takası pozlama yöntemi (veri gösterilmez) kullanarak.

Figure 1
Resim 1 : Hücre spike ve medyası takası maruz kalma yöntemleri tarafından indüklenen ölüm. Tüm görüntüleri MTT substrat eklenmesinden sonra yakalanan 1,5 saat vardı. (A) SV40-HCEC maruz refeed/metodoloji HFA spike maruz bir parlak alan görüntüsünü paneldir. (B) paneldir paneli (a) aynı kuyuda bir daha yüksek büyütme faz kontrast kullanarak. (C) SV40-HCEC maruz refeed/metodoloji orta exchange tarafından maruz bir parlak alan görüntüsünü paneldir. (D) paneli (c) aynı kuyuda faz kontrast kullanarak daha yüksek bir büyütme paneldir. Paneller (e) ve (f) bir de buluşuyor, parlak bir alan ve faz kontrast yüksek büyütme, sırasıyla vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Orta yaydıkları istikrar

Ortamda seyreltilmiş kez HF ve CP belirgin sitotoksisite değiştirir ve sonra stabilize gözlendi. HFA %0.0036 orta seyreltilmiş ve 1-60 dk SV40-HCECs yukarıda açıklandığı gibi açığa önce 37 ° C'de kuluçkaya için izin. HFA için ilk 5 HFA ortamda seyreltilmiş ve o zaman için en az bir saat (Şekil 2a) istikrarlı bir dk içinde sitotoksisite artırır. Tek yönlü ANOVA Dunnett'ın çoklu karşılaştırma testi ile takip o % hücre canlılığı gösterdi her zaman puan 1 dk zaman noktadan itibaren önemli ölçüde farklı. Zaman puan 2.5 ile 60 dk arasında hiçbir önemli farklılıklar vardı. CP organik ve ilk DMSO % 5 oranında sulandırılmış. O zaman %0.0008 orta seyreltilmiş ve yukarıda açıklandığı gibi SV40-HCECs açığa önce 5-120 dk 37 ° C'de kuluçkaya için izin. Ortamda seyreltilmiş CP sitotoksisite 60 dk azalır ve en az bir sonraki h için (Şekil 2b) stabilize. Tek yönlü ANOVA Dunnett'ın çoklu karşılaştırma testi ile takip o % hücre canlılığı gösterdi her zaman puan 5 dk zaman noktadan itibaren önemli ölçüde farklı. Zaman puan 60-120 dakika arasında önemli bir fark yoktur vardı.

Figure 2
Resim 2 : Orta dilutions sitotoksisite yaydıkları kaybı. Verileri yüzde canlılığı ± SD ortalama ifade edilir (n = 6). Paneli (a) ortamda seyreltilmiş ve 1-60 dakika önce yukarıda açıklandığı gibi SV40-HCECs teşhir için oda sıcaklığında inkübe %0.0036 HFA sitotoksisite kararlılığını gösterir. Paneli (b) orta seyreltilmiş ve yukarıda açıklandığı gibi SV40-HCECs açığa önce 5-120 dk 37 ° C'de kuluçkaya için izin %0.0008 CP sitotoksisite kararlılığını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Açmak/Refeed veya sadece maruz

Maruz kalma yöntemleri soruşturma başka bir etkendi kullanılıp kullanılmayacağını: A) kimyasal duman hood plakaları 10 dk, yıkama, refeed, kaldırmak için toxicant Ekle ve kuluçkaya 24 h standart hücre kültür kuluçka (yöntemi) açmak/refeed; ya da B) toxicant eklemek, açık bırak, plakalar kimyasal duman hood kaldırmak ve bir standart hücre kültür kuluçka (maruz tek yöntem) 24 saat kuluçkaya. Plakalar üzerinden kimyasal duman hood seyreltilmiş toxicant çünkü toxicant gaz kapalı ve personel açığa içeren hücreleri kaldırmak için izin verilen olmayabilir olarak emanet önemli bir faktördür. Tabak tabak daha vardır beri herhangi bir anda maruz sayısını ilgili dikkat etmeniz gereken, bir büyük cilt kapalı-gaz olacak. Bizim HTS yöntemlerinde, biz verilen çalışma günde 48 x 96-şey plakaları ortaya. Biz maruz kalan hücre kültür plakaları mühürlü bir torbaya yerleştirilir ve CP ve HF kapalı-gazla maruz plakalar üzerinden değerlendirmek için Renkölçer gaz dedektörü borular kullanılır. 1 LD50 HFA / x 48 tabak açığa herhangi bir tespit HF kapalı-gaz içinde (veri gösterilmez) sonuçlanmamıştır olduğunu bulduk. CP pozlama için yeterli CP kapalı-gazla 48 tabak 1 en azından bazı emniyet endişe (veri gösterilmez) sunmak için LD50 x maruz üzerinden olduğunu öğrendim. Açmak/refeed ve maruz sadece yöntemleri HFA pozlama için değerlendirilmiştir. SV40-HCEC hücreleri HFA için maruz kaldılar ve canlılığı maruz kaldıktan sonra MTT tahlil 24 h tarafından değerlendirildi. Doz yanıt yineleme farklı günlerde yapıldı. Açmak/refeed yöntemi (Şekil 3a) karşılaştırıldığında, biz maruz tek yöntem daha tutarlı hücre canlılığı tahlil sonuçları (Şekil 3b) üretilen bulundu. Bu nedenle, bu yöntem son pozlama metodoloji parçası olarak seçilmiştir. Güvenlik endişeleri kimyasal duman mahalle 24 h kuluçka için maruz CP plakaları kaldırılıyor durdurulmasını emretti CP için hücre canlılığı tahlil sonuçları tutarlılığını tüm farklılıkları iki farklı pozlama metodolojileri arasında değerlendirilen değil bir Standart hücre kültür kuluçka makinesi.

Figure 3
Şekil 3 : Açmak/refeed ile pozlama tutarlılık ve sadece yöntemleri duyurmak. Verileri yüzde canlılığı ± SD ortalama ifade edilir (n = 6). (a) HFA ortamda seyreltilmiş 10 dakika oda sıcaklığında inkübe ve sonra hücreleri göstermek için açmak/refeed yöntemi tarafından kullanılan. (b) HFA ortamda seyreltilmiş 10 dakika oda sıcaklığında inkübe ve sonra SV40-HCEC duyurmak için maruz tek yöntemi tarafından kullanılan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre modeli iyileştirme

Orta bileşenlerinin

Biz geçiş ve bu hücrenin satır için kaynak müfettişler tarafından kurulan Kültür koşulları yapıştırılır; Ancak, onları için deneme hücrelerde değişiklik. Hücre kültür SV40-HCEC hücreler için kaynak müfettişler tarafından öngörülen orta hidrokortizon içermez, ancak ara sıra ani sitokin üretim artış bastırmak için pozlama çalışmaları sırasında hidrokortizon (0,5 µg/mL) düşük düzeyde kullanılan saf SV40-HCEC (veri gösterilmez) görülen hangi olumsuz etkilenen veri analizi bir yineleme sonraki iyileştirme çalışmaları sırasında.

Fenotipik istikrar

Bizim hücre modeli iyileştirme çalışmaları sırasında SV40 HCEC bulduk sitokin üretim başlangıç geçişi numarası 60 (veri gösterilmez) yaydıkları maruz kalma yanıt olarak düştü başlar. Bu nedenle, biz düşük geçiş hücre cryostocks tutulan, hücreleri geçiş numarası 60 altında kullanarak tüm çalışmaları yürütülen ve sitokin üretim tarama işlemi sırasında izlenen.

Plaka düzeni

Bir önemli yüksek işlem hacmi çalışmalar deneysel değişkenlik kenar efektleri çok iyi plakaların kaynağıdır. Hücre kenar Wells sitokin yanıtları ile tutarlı değildi veya eşdeğer, hem de iç wells HFA ve CP çalışmalar (veri gösterilmez) bulduk. Veri, veri kümesi üzerinde kenar etkileri en aza indirmek için kullanılan bir istatistiksel egzersiz medyan Lehçe yeterince (veri gösterilmez) sorunu çözmek değil. Bu nedenle, hiçbir hücre plaka kenar wells deneme veya denetimleri (Şekil 4) için kullanılmıştır.

Figure 4
Şekil 4 : Kütüphane ve hücre plaka düzenleri. Kütüphane plaka düzen gri gölgeli alanda siRNA içeren wells temsil eder. Beyaz kuyu bomboş. Satır A-D Kütüphane plaka 40 hedeflerden "üst plaka kümesinde" kullanılır ve satır E-H Kütüphane plaka 40 hedeflerden "alt plaka kümesinde" kullanılır. Wells B2-B6 negatif havuzu siRNA denetimler için kullanılır. Wells C2-C6 sigara transfected. Wells B7-B11 ya cardamonin ya da SKF 86002 olumlu denetim ilaç olarak tarif için kullanılır ve kuyu C7-C11 DMSO araç kontrolü için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Vitro modeli doğrulamasını HTS

Z kullanılan ' faktör bu istatistiksel test HTS24için tahlil kalitesini belirlemek için kullanıldığı gibi SV40-HCEC uygunluğu HTS çalışmalarda kullanılmak belirlemek için analizi. HF Z için ' faktör analizi, hücreleri, 1,25 x 103 hücreleri/iyi, negatif havuzu siRNA ile (yukarıda açıklandığı gibi) transfected numaralı seribaşı tohum sonra 24 h ve maruz kalan 48 h transfection %0.0036 sonra HFA (LD50x 1), n = 3. CP Z için ' faktör analizi, hücreleri tohumlari ve yukarıda açıklandığı gibi transfected ve sonra transfection %0.0008 48 h maruz CP (LD50x 1), n = 5. Daha büyük bir n sayesinde büyük değişkenlik bu pozlama modelde CP etütler kullanıldı. Z' faktörü maruz vs Il-8 ifade maruz yıkamaya vs hücreleri ve transfected negatif havuzu siRNA harfi veri hücreleri için CP ve HFA Etkilenmeler hesaplanmıştır. Ayrıca sigara transfected hücreleri siRNA transfection nedeniyle tahlil kalitesi üzerinde bir etkisi olup olmadığını belirlemek için analiz ettik. Doğrulama çalışmaları fazla yineleme bir çaba Z en üst düzeye çıkarmak için pozlama ve kültür koşulları arıtma sırasında gerçekleştirilen ' faktör sonuçları. SV40-HCEC doğrulama geçti ve çoğu yineleme Z vardı ' faktörü 0,50 HF Etkilenmeler (Tablo 1) ve CP Etkilenmeler (Tablo 2) için daha büyük değerler. Bu tablolardaki her çoğaltma hücrelerden farklı günlerde kaplama yapıldı.

Pozlama grupları Z'-faktör analizi
Rep #1 Rep #2 Rep #3
HF maruz negatif kontrol yıkamaya negatif kontrol vs 0,68 0,5 0.56
HF-maruz saf vs 0,4 0,68 0.56

Tablo 1: SV40-HCEC HFA pozlama Z' faktör analizi Il-8

Pozlama grupları Z'-faktör analizi
Rep #1 Rep #2 Rep #3
CP maruz negatif kontrol yıkamaya negatif kontrol vs 0,6 0.18 0,46
CP günese maruz kalan saf vs 0,42 0,29 0,42

Tablo 2: SV40-HCEC CP pozlama Z' faktör analizi Il-8

Birincil siRNA eleme sonuçları HFA yaralı hücre

Transfection optimizasyon çalışmaları tarama öncesinde gerçekleştirilen ve cyclophilin b hedefleme siRNA bu çalışmalar için kullanıldı. Situ RNA algılama tahlil cyclophilin b mRNA düzeylerini ölçmek için kullanılan ve yüksek bir içerik analiz sonuçları ölçmek için kullanılan. Cyclophilin b devirme ve genellikle daha fazla % 5-10 hücre kaybı siRNA/iyi ve 0.3 µL/iyi transfection reaktifi (veri gösterilmez) 4 pmol ile % 90 yakın elde. SiRNA daha yüksek miktarda aslında yoksul cyclophilin b nakavt (veri gösterilmez) sonuçlandı. Nakavt benzer düzeyde 1.2 pmol/iyi ile siRNA ve 0.09 µL/iyi transfection reaktif elde edildi, ama 4 pmol iyi siRNA etkili nakavt elde etmek için daha fazla miktarda gerektiren herhangi bir hedef adres için kullanmak seçildi. Hedef devirme kinetik da değerlendirildi ve bu iki gün sonrası transfection (veri gösterilmez) Bu hedef nakavt maksimal gözlendi. Hedef devirme tutarlılık plaka arasında da (doğrulanmış veri gösterilmez) oldu. Anti-inflamatuar ilaçlar cardamonin ve SKF 86002 olumlu denetimleri sırasıyla HFA ve CP maruz kalma, sitokin üretiminin inhibisyonu için kullanılır. Bunlar bileşikler bilinen anti-enflamatuar özellikleri ile çeşitli maruz kalan hücrelerde test ederek seçildi. Çalışmalar eleme içinde kullanılan doz doz yanıt optimizasyon çalışmaları tarafından seçildi.

Biz kullanılan strateji eleme yüksek işlem hacmi siRNA endüstri standardı ve üç büyük adım içerir: 1) birincil gösterimin ardından, 2) kütüphane deconvolution ve 3) hedef doğrulama. Birincil tarama her bir hedefe fenotip farklı siRNA dizileri karışımı kullanan her gen hedeflemek için tek bir reaktif değerlendirilir. Hedefleri o zaman aşağı Kütüphane deconvolution için seçilir. Bu adımda, her birincil tarama her gen hedeflemek için birikmiş farklı siRNA sıralarının test ayrı ayrı. Hedefler hedef doğrulama içinde uyuşturucu, fenotip restorasyon ve/veya başka bir satıcıdan siRNA hedef fenotip onaylandıktan içine başka bir aşağı-seçim tabi. Bizim birincil ekran için bir genom geniş ekran yerine bir odaklı alt genomik ekran ekonomi nedenlerle gerçekleştirmek seçildi. HF ve CP Mikroarray veri fare kornealar yaralı ve marifet yolu Analizi (IPA) bizim hedef kitaplık için birincil ekran (el yazmaları hazırlık) odaklanmak için kullanılmıştır. Kısaca, fare kornealar yaydıkları buharı buharı Kupası için önceden açıklanan yöntemleri25benzer kullanarak sinin. Pozlama puan sonrası çeşitli zaman maruz kalan kornea düğmeleri ve kontroller hasat edildi. RNA miktarı ve kalitesini izlenen ve RNA izole edildi. Tüm microarray deneyleri üreticinin iletişim kuralı26göre yapıldı. Ham sinyal yoğunluklarda normalleştirilmiş ve asıl bileşen analizi (PCA) verileri değişkenlik önemli kaynakları belirlemek için analiz edildi. Genler sırası istatistiksel anlamlılık tarafından sipariş edildi. Verileri veri madenciliği ve önceden yapılandırılmış siRNA kitaplıkları gen listelerine karşılaştırıldığında. Bu gen listelerinden, biz 3120 hedefleri tarama için seçildi. SiRNA Kütüphane SV40-HCEC hücrelerinde (bkz Şekil 5 HTS Protokolü birincil ekran için bir akış şeması için) gösterildi. Bitiş noktası değerlendirmeler Il-8 seviyeleri hücre kültürü ortamında no-yıkama boncuk tabanlı tahlil hücre canlılığı MTT tahlil tarafından dahil. Hücreleri daha önce açıklandığı gibi 0.0036%HFA için yaklaşık 1 LD50x olan maruz bırakıldı. Hücre canlılığı maruz kaldıktan sonra MTT tahlil 24 h tarafından değerlendirildi. Hücre canlılığı her siRNA havuzu etkisi kesinlikle standart ortalama fark (SSMD)27kullanarak her plaka maruz negatif havuzu ortalama göre istatistiksel anlamlılık için analiz edildi. Bir çift-el feneri Arsa SSMD ve hücre canlılık kat-değişikliği Şekil 6' da gösterilmiştir. Hücre ölümü şiddetlenir veya hücre canlılığı geliştirilmiş hedefleri için seçilen isabet seçim eşikleri SSMD ≤-1.28 ve SSMD ≥ 1,28, sırasıyla idi.

Figure 5
Şekil 5 : Birincil ekran HTS protokol akış şeması. Bu akış şeması HTS protokolü için her gün gerçekleştirilen temel adımları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Çift-el feneri Arsa siRNA Cell Viability of HFA-Exposed SV40-HCEC hücreleri üzerinde etkisi. Her hedef için gösterilen sonuç çoğu altı çoğaltır ortalaması (n = 6). Hücre canlılığı veri kat-değişiklik maruz negatif havuzu kontrol siRNA göreli olarak ifade edilir ve istatistiksel anlamlılık SSMD tarafından analiz edildi. Olan bir SSMD ≤-1.28 veya ≥ 1,28 hedeflerin sayısı seçildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Her siRNA havuzu etkisi HFA kaynaklı Il-8 üretim her plaka maruz negatif havuzu ortalama göre istatistiksel anlamlılık için analiz edildi. Il-8 hücre kültüründe süpernatant biçilen tahlil 24 h maruz kaldıktan sonra yapıldı. Bir çift-el feneri Arsa SSMD ve Il-8 kat değişim Şekil 7' de gösterilmiştir. Il-8 üretim azalma hedefler için seçilen isabet seçim eşikleri % 40 azalma ve SSMD ≤ -1,0... Il-8 üretim artış hedefi bir kat artış ve SSMD oldu için seçilen isabet seçim eşikleri > 1,28.

Figure 7
Şekil 7 : Çift-el feneri Arsa HFA-Exposed SV40-HCEC hücreleri tarafından Il-8 üretim siRNA etkisi. Sonuçlar vardır altı çoğaltır ortalaması (n = 6). Il-8 ifade düzeyinde veri kat-değişiklik maruz negatif havuzu siRNA göreli olarak ifade edilir ve istatistiksel anlamlılık SSMD tarafından analiz edildi. Sayısı tanımlanan Il-8 düzeyleri ve SSMD ≤ -1.0 veya Il-8 düzeyleri ve SSMD kat artış % 40 olan hedefler azalma gibi > 1,28. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada biz bizim yöntemleri ve sonuçları bir yüksek işlem hacmi kornea epitel hücre modeli HF ve CP yaralanmaları incelenmesi için eleme gelişimi tanımlamak. HF yaralanma için birincil siRNA ekran sonuçlarından da mevcut. HTS modelleri TIC yaralanmaları incelenmesi için geliştirilmesi için pek çok sorun vardı. HF, HFA veya CP çalışmada hücre kültür modelleri ile ilgili literatürde bulabileceğimizi yöntemleri küçük yardımcı oldun. Florür Ion çoğu vitro çalışmalar sözlü hücreleri içerir ve sodyum florür değil, HF veya HFA (bazı örnekler için bkz:28,29) kullanılmaktadır. CP vitro maruz bronş epitel hücresi bazı metodoloji Pesonen vd tarafından yayınlandı 30. belirli yöntemlerin HTS çalışma HF, HFA veya CP ve zorluklar ve bu toxicants gerekli HTS geliştirme çalışması ile ilgili değişkenler büyük çoğunluğu ile ilgili literatürde sonuçta, bulduk. Özellikle dikkat zaman ve çok sayıda tarama plakaları bir başarılı HTS çalışma için gerekli arasında pozlama tutarlılık yüksek düzeyde ulaşmak için ödeme yapıldı.

Bir tür meydan okuma karşılaştı toxicant uygulamaya hücre kültür sistemleri ile ilgili. Bazı toxicants ile reaktif ya da sulu çözümler kararsız. Biz eğitim için seçilmiş toxicants Bu istikrarsızlık konuları sahip olarak kabul edilmez. Bir tarım çalışma CP photohydrolysis araştıran CP suda 0,001 M çözümünün bir half-life 31,1 bir 1100 lux xenon ışık kaynağına (bulutlu bir gün güneş ışığı yoğunluğu) 10 gün, 12 saat-de gün31için maruz kaldığında h olduğunu göstermiştir. Ne zaman çözüm karanlıkta saklanan aynı 10 günlük süre içinde hiçbir ölçülebilir hidroliz yapıldı. HFA proton ve florür iyon suda açıkça kararlı. Ancak, hücre kültürü ortamında yapılan yaydıkları dilutions ile ilgili olarak ek istikrar dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Biz ne zaman toxicants ilk hücre kültürü ortamında, kısa bir süre sonra stabilize seyreltilmiş bir dereceye sitotoksisite ilk bir değişiklik olduğunu fark etti. Biz bu yaydıkları bağlama veya kompleks bileşenlerinin orta ile bağlı olduğuna inanıyoruz. Hücre ortam içeren kalsiyum, magnezyum, protein, vb ile florür iyon32,33etkileşim bilinmektedir. CP biyolojik thiols oksidatif reaksiyon sahip olduğu bilinmektedir, ama onu da DNA, protein ve diğer nucleophiles34,35ilişkilendirmek. Bu reaksiyonlar ve etkileşimleri tamamlandı veya denge ulaştı sonra mevcut toxicant miktarı stabilize ve böylece belirgin sitotoksisite stabilize. Biz başlangıçta toxicants tuz ve su dilutions kullanımı ile çalışma dilutions orta bileşenlerinin yaydıkları etkileşimleri önlemek için poz için kullanılan çalışma hisse senetleri için araştırdı. Tuz kullanımı da HFA yaralanma orta exchange tarafından gerçekleştirilen pozlama için asit bileşeni korumak. Biz hücre ölüm yanıt toxicants su ve tuz dilutions için daha fazla değişken hücre kültür orta dilutions orta değişimi (veri gösterilmez) ile kullanılan yöntem daha bulundu. Spike pozlama yöntemi ile ilgili HFA ile değişkenlik de hücresel hedeflerine orta bileşenlerinin kullanılabilir florür iyon için rekabet lider Dispergatör spike tutarsızlık nedeniyle olabilir. HFA Etkilenmeler HFA tuzlu dilutions ile medyası takası tarafından değişkenlik nedenlerle tamamen pek açık değildir. Her durumda, tuzlu dilutions HFA için kullanarak maruz kalma yöntemleri terk edilmiş ve CP için keşfedilmeyi değil. Bizim HFA dilutions ortamda toksisite muhtemelen yakından hücre orta ücretsiz proton bizim HFA dilutions arabelleğe alır çünkü sodyum florür kullanarak çalışmaları taklit eder.

Karşılaştığımız diğer sorunlar HTS. kullanmak için hücre kültür modellerinin arıtma ile ilgili Biz özellikle hidrokortizon ve antibiyotik deneme, hücrelerine hücre kültür orta bileşenleri değiştirmek gerekli bulundu. Ara sıra ani saf SV40-HCEC görülen sitokin üretim artış bastırmak için pozlama çalışmaları sırasında hidrokortizon (0,5 µg/mL) düşük düzeyde kullanılmaktadır. Bu alçak miktar-in hidrokortizon hücreleri yanıtlarını toxicant olumsuz yönde etkilemedi ve genellikle sitokin üretim bastırmak için uyarıcı36,37yanıt olarak kültürlü hücreleri tarafından kullanılan seviyenin altında yapıldı. Neden saf SV40-HCEC hücreleri üretmek bazen aşırı sitokinler kesin nedeni bilinmemektedir, ancak hücreleri degisken passaging ve kaplama hücre sırasında oluşan küçük gerilim duyarlı mümkündür. Birçok labs rutin olarak hücre kültür bakım orta, ancak bazı antibiyotikler antibiyotikler içermiyor, tetrasiklinler özellikle, kültürlü hücrelerde kornea epitel hücreleri38dahil anti-inflamatuar etkileri sergilemek gösterilmiştir. Genel olarak, bunlar potansiyel olarak çalışmalar yıkmak beri bizim laboratuvar kullanma-in antibiyotik mümkün olduğunda önler. Biz de bizim hücre kültüründe birden çok pasajlar üzerinde fenotipik drift araştırdık. Bu genetik ve/veya fenotipik drift üzerinde birden çok pasajlar geçmesi ölümsüzleştirdi hücreler için ortak değilse veya üssel faz confluency ulaşmasına izin yoksa belirli çevresel stres39için,40 maruz tutulan ,41. Bu nedenle, bu hücre satırları düzgün tutulan ve belgili tanımlık perde bilinen fenotipik yanıt korumak hücre geçit sayıları kullanarak tamamlanmış bir yüksek üretilen iş ekran sırasında önemlidir. Çok iyi plaka kenar efektleri çok iyi plakaları dış çevresindeki wells kez yetiştirilen hücrelerin aynı yanıt vermeyen veya iç yetişkin hücreler olarak aynı tutarlılık ile42kuyuları olgu olduğunu. Bir veri kümesi43üzerinde kenar etkileri en aza indirmek için kullanılabilir medyan Lehçe gibi istatistiksel egzersizler vardır. Ancak, kenar efektleri bir belirli hedef veya denetim her zaman bir kenar kuyuda sınanır ve plaka düzen arasında değişen hedefleri taşımak için çoğaltır veya denetimlerin kenar wells kapalı değildir lojistik ortadan kaldırabilirsiniz hiçbir istatistik egzersiz olduğunu pratik veya maliyet etkin. Hücre tabanlı HTS deneyleri içinde kenar wells kullanımını içerecek şekilde dikkatli karar verilmesi bize göre öyle. Biz kenar Wells denetimleri ve hedefler için yetiştirilen hücrelerin kullanımı ortadan kaldırmak gerekli bulundu.

HTS hücre modeli ve pozlama metodolojimiz vitro HF yaralanma için birincil siRNA ekran 3120 hedeflerin başarıyla tamamlamak için kullanıldı. Çünkü bu özellikle bir denetim ve bir siRNA27arasındaki fark büyüklüğü ölçmek için önerilen SSMD isabet seçim için kullanıldı. Sonuçlarımız hücre canlılık için çift-el feneri Arsa SSMD ve kat-değişiklik için hemen hemen tüm hedefler arasında doğrusal bir ilişki olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu bitiş noktası için isabet seçimi için SSMD tek kriteri kullanılan. Il-8 veri diğerleri güçlü ama tutarsız etkileri gösterdi zayıf ama tutarlı etkileri bazı hedefler vardı o farklıydı. Bu nedenle, biz kat-değişim ve SSMD isabet seçim ölçütü bu son nokta için kullandık. SSMD değerleri her iki hücre canlılık için isabet seçimi için kullanılan ve düşük yanlış bulma ve sigara bulma oranları44cutoffs 1 ve 1.645 (veya -1 ile-1.65) arasında elde çünkü Il-8 veri seçilmiştir. Il-8 veri ve hücre canlılığı hits vardı bazı hedefler vardı. Bu gibi durumlarda tercih deconvolution Kütüphane eklenmesi için genel sağlık (geliştirilmiş canlılığı ve azalmış IL-8) iyileştirilmesi veya yaralanma exacerbating aynı yönde etkileri sarf Bu hedeflerden verildi (artan hücre ölümü ve artan Il-8). Genel olarak, biz 250 hedefler arasında hücre canlılığı ve Il-8 bitiş noktaları deconvolution Kütüphane HF yaralanma için makyaj için toplam seçildi. Vitro CP yaralanma için birincil ekran devam ediyor.

Özetle, pozlama ve kültür koşulları HF ve CP oküler yaralanma HTS incelenmesi için uygun geliştirdik. Pozlama ve kültür koşullarda birçok değişken rafine ve en iyi duruma getirilmiş ve modelleri doğrulanmış HTS çalışmaları için uygun olmak Z tarafından ' faktör analizi. Biz daha fazla yardımcı programı bu modellerin HF modeli bir siRNA kitaplıkta birincil ekran tamamlayarak kanıtlanmıştır. Birçok yaralanma ve hayır-in eden hastalıkların veya ilaç ya da biyoteknoloji sanayi, CP ve HF dahil yaydıkları yaralanma için sınırlı ilgi ve benchtop robotik gelişiyle kolaylaştırır yaralanma ve hastalıklar hemen her laboratuvar HTS incelenmesi . Yüksek işlem hacmi genomik veri kümeleri yaralanma veya hastalık daha verimli bir şekilde odaklanmasını sağlayabilecek belirli genler oynamak rolleri anlayış büyük ölçüde katkıda bulunabileceği vitro veya in vivo çalışmalar izleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yasal uyarı: Bu makalede görüşler yazar(lar) aittir ve ordu bölümü, Savunma Bakanlığı veya ABD hükümeti resmi politikasının yansıtmamaktadır. Bu araştırma NIH/NIAID ve USAMRICD arasında bir kurumlararası anlaşma tarafından desteklenen ve kısmen meşe tarafından randevu lisansüstü araştırma katılım programı, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Enstitüsü kimyasal savunma için tarafından yönetilen Ridge Enstitüsü bilim ve eğitim ABD Enerji Bakanlığı ve USAMRMC arasında bir kurumlararası anlaşma yoluyla.

Acknowledgments

Bu araştırma ulusal kurumları, sağlık karşı koymak Program kurumlararası anlaşma # AOD13015-001 tarafından desteklenmiştir. Stephanie Froberg ve Peter Hurst çabaları ve video üretimi uzmanlık için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

Biyoloji sayı: 136 polis hidrojen florür kornea epitel hücreleri kornea yaralanma siRNA yüksek aktarım tarama
Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter