Summary
합성 작은 분자의 높은 처리량 화면 모델 식물 종, 애기 thaliana에 실시 됐다. 액체 처리 로봇에 대 한 개발이 프로토콜 앞으로 화학 유전학 스크린, 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자의 발견을 가속의 속도가 증가 합니다.
Abstract
화학 유전학은 점점 해독 식물 유전자 중복 또는 치 전통 유전학에 고집 불통 될 수 있는 특성을 채용 되 고 있습니다. 그러나, 생리 되는 합성 분자의 확률이 낮습니다; 따라서, 분자의 수천은 그 관심을 찾기 위해 테스트 되어야 한다. 액체 처리 로봇 시스템은 샘플, 속도는 화학 라이브러리 오류 최소화/표준화 이외에 상영 될 수 증가의 큰 숫자를 처리 하기 위해 설계 되었습니다. 벤치 탑 멀티 채널 액체를 사용 하 여 프로토콜 애기 thaliana (애기)에 50000 작은 분자의 도서관의 높은 처리량 앞으로 화학 유전학 스크린을 달성 하기 위해 필요한 최소한의 개발 되었다 로봇을 처리 기술 자가 참여. 이러한 프로토콜을 3,271 작은 분자는 그 표시 phenotypic 변경 발생 발견 되었다. 1,563 화합물 짧은 뿌리, 1,148 화합물 변경 채색, 383 화합물 발생 루트 머리와 다른, 비-, 분류 변경 및 177 화합물 저해 발 아를 유도 한다.
Introduction
지난 20 년 동안에서 식물 생물학 분야에서 연구자는 큰 진전을 화학 유전학 방법, 앞으로 및 역방향, 세포 벽 생 합성, 골격, 호르몬 생 합성에 대 한 우리의 이해를 개량 하 고 신호, gravitropism, 병 인, 퓨 린 생 합성, 그리고 endomembrane,12,3,,45를 인신 매매. 앞으로 화학 유전학 기술을 관심의 고기 식별 가능 하며 특정 프로세스의 genotypic 토대를 이해 연구 반대로, 반대로 화학 유전학 미리 결정된 단백질 대상6상호 작용 하는 화학 물질을 찾고 있습니다. 애기 때문에 매핑되고 주석 그것의 게놈은 작은, 식물 생물학에서 이러한 발견의 최전선에 왔다. 그것은 짧은 생성 시간, 그리고 여러 돌연변이/기자 라인 탈 subcellular 기계7의 식별을 용이 하 게 사용할 수 있다.
천천히 앞으로 화학 유전 스크린의 진행, 초기 심사 과정 및 관심8의 화합물의 목표를 결정 하는 두 가지 주요 병목을 확인 하 고 있습니다. 작은 분자 선택의 속도 증가에서 주요 원조 자동화 및 자동화 된 장비9의 사용 이다. 액체 처리 로봇 작은 분자의 큰 도서관을 처리 하기 위한 훌륭한 도구입니다 그리고 생물 과학10에서 진행을 운전에 도움이 되었습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은. 빠른 속도로 생리 활성 작은 분자의 식별 사용 심사 프로세스와 관련 된 병목을 완화 하도록 설계 되었습니다. 이 기술은 노동의 원리 탐정에 경제적 비용 감소 연산자 대신 시간 부담 감소.
지금까지, 대부분의 화학 라이브러리 분석으로 150, 000와 일부 몇 가지 709,,1112,,1314, 로 일부 10000 그리고 20000 화합물 사이 개최 15 , 16. 여기 소개 하는 프로토콜 ( 재료의 표참조) 50000 화합물의 분자 라이브러리에 구현 된, 더 큰 앞으로 화학 유전학 중 화면 날짜에 실시 애기. 이 프로토콜 발견 제 초 제, 살충제의 발견, 살 균 제에 관련 된으로 특히 증가 효율성과 속도 앞으로 화학 유전학에 관한 현재 트렌드에 맞는 발견, 발견, 및 암 생물학17 마약 ,,1819,,2021. 비록 여기 애기와 구현,이 프로토콜을 쉽게 될 수 세포 배양, 포자, 그리고 잠재적으로 심지어 곤충을 96-384 / 1536-잘 접시에서 액체 매체에서. 작은 크기로 인해 애기는 의무가 96 잘 접시에서 심사. 그러나, 우물에 고르게 씨앗 배포는 도전 이다. 손 시드 노동 집약, 하지만 정확한 이며 96 잘 접시에 씨앗을 분배 하도록 하는 장치는, 그들은 저렴 하 게 구입할. 여기, 우리가 어떻게이 단계 피할 수 단지 작은 손실 정확도에 보여줍니다.
이 방법의 전반적인 목표는 애기 더 관리에 대 한 큰 화학 라이브러리 사용을 통해 액체 처리 로봇의 정확도 저하 없이 심사 수 있도록 했다. 이 메서드를 사용 하 여 초기 희석 시리즈 관리 및 후속 phenotypic 화면, 빠른 시각화 해 현미경 그리고 급속 한 샘플의 수를 완료 하는 데 걸린 시간을 감소 하 여 연구원의 효율성 향상 새로운 생리 활성 작은 분자의 id입니다. 그림 1 4 단계에서이 프로토콜의 주요 결과를 보여 줍니다.
그림 1: 앞으로 화학 유전학 스크린의 전체 워크플로. 4 주요 단계의 각각에 대 한 몇 가지 세부 사항에 설명 하는 프로토콜의 개요. 1: 화학 라이브러리, 2 수신: 3 희석 라이브러리 만들기: 심사 접시, 및 4: 잠복기 및 심사 번호판을 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
1. 희석 라이브러리 만들기
- 레이블을 625 희석 도서관 판, 화학 라이브러리에서 해당 그들의 접시에 일치 하는지 확인. 또한, 5 갤런 저수지에 콘솔 드라이브를 통해 그들을 전달 하 여 흐름 및 흐름 호스를 멀티 채널 팁 세척 자동화 기구 포지 셔 너 (ALP)를 연결 ( 재료의 표참조).
- 컴퓨터에 액세스 하 고 물을 회람 하기 위하여 멀티 채널 팁 세척 ALP 장치 컨트롤러의 연결을 통해 세척 펌프를 켭니다. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
- 부하, 손을 스태커 10에 의해에 연결 된 호텔 A-D (그림 4, 스태커);에서 다음 순서로 스태커 회전 목마 객실 1, 96-잘 V 4에서 AP96 P20 피 펫 팁의 한 상자-바닥 접시 객실 2-5에서에서 두 위 접시는 정렬된 라이브러리와 두 낮은 접시 재고 농도 포함 하는 (그림 5, 스태커) 빈. 또한, 객실 6, 및 4 개의 96 잘 V AP96 P20 피 펫 팁의 1 개의 상자를 로드-정렬된 라이브러리와 2 개의 낮은 격판덮개의 재고 농도 포함 하 2 개의 상단 플레이트와 객실 7-9에서에서 하단 플레이트 빈 (그림 5, 스태커).
- 설정, 손으로, P3, P7에 300 mL 70 %EtOH 목욕에 300 mL 물 저수지와 갑판 팁 로더 ALP (TL1), 그리고 멀티 채널 팁 세척 ALP (TW1) (그림 4, 갑판 및 그림 5, 갑판).
- 운영 소프트웨어를 사용 하 여 스태커 10에서 AP96 P20 피 펫 팁을 제시 하 고 팁 로더 ALP에 이동.
참고: 액체 처리 로봇의 운영 소프트웨어; 1.5 1.12 모든 통해 완료 테이블의 자료를 참조 하십시오. - 호텔에서 룸 2를 제시 하 고 모든 4 개의 96 잘 V 분리-하단 플레이트는 갑판에 하단 배치 P4, P8에 2 및 P5 P9에 2 위 (그림 4).
- AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다. 300 mL 물 저수지에서 90 µ L 발음 및 96-잘 V에 분배-P4에 바닥판 희석. P8에 접시에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 반복적으로 발음 및 분배 15 µ L 세 번 P5에 화학 라이브러리 접시를 섞는다. 또한, P5에 화학 라이브러리 접시에서 10 µ L 발음 하 고 P4에 희석 접시에 10 µ L을 분배.
- 총 세 번 반복적으로 발음 하 고 50 µ L를 분배 하 여 P4에 접시의 솔루션을 믹스. 혼합, 일단 깨끗 한 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 AP96 P20 피 펫 팁 EtOH P7에서 발음 및 물 4의 110% 볼륨을 분배 하 여 멀티 채널 팁 세척 ALP에 세척 그들 시간.
- P8, P9에 번호판의 두 번째 쌍에 대 한 1.8-1.9 단계를 반복 합니다. 두 번째 96 잘 V 만들기 시-희석 바닥판, 스택 맨 하단에서 다음 순서로 접시: P9, P5, P8, P4. 다음, 한 빈 정적 ALP;에 스택 장소 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13.
- 1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔 A의 객실 5 비어. 1.5 룸 6 도달, 새로운 AP96 P20 피 펫 팁 팁 로더 ALP 고 빈 정적 ALP에 사용 된 AP96 P20 피 펫 팁을 배치에 따라 단계를 반복 합니다.
- 1.6 1.10 단계를 반복 하 여 호텔의 룸 9 A 비어. 그러나, 호텔 B를 진행 하기 위해서는 접시와 갑판에 팁 해야 합니다 다시 로드 호텔 대답에
- 다시 작성, 손으로, 300 mL 물 저수지. 이 단계는 중요 한, 그리고 컴퓨터 프로그램 일시 중지를 치고 '계속', 다음 단계를 수행 하기 전에 사용자는이 메시지를 자세히를 통합할 수 있습니다.
- 나머지 호텔, 보장 전체 300 mL 물 저수지 다음 호텔에 진행 하기 전에 각 시간에 대 한 1.5-1.13 단계를 반복 합니다.
2. 판 상영을 미디어-씨앗 혼합물 추가
- ½ 重 만들고 Skoog (MS) 미디어 0.1% 조정 5.7에 pH 4.3 g MS 소금, 0.50 g MES, 1.0 g 한 천 1 L 디 H2o.를 추가 하 여 한 천 하지만 pH 프로브를 모니터링 하는 동안 5 M 수산화 칼륨의 추가.
- 15 그리고 30 분 사이 1% 표 백제와 SDS에 그들을 떨고 하 여 종자를 소독 하 고 후 원심 분리에 의해 물의 동등한 양으로 4 번 린스. 씨앗은 불 임, 일단 vernilization에 대 한 일 24 시간에서 4 ° C에서 그들을 놓습니다. 애기 생물 자원 센터의 살 균, vernilization, 및 성장22추가 방법을 설명합니다.
- 미디어 씨앗 추가 손으로 0.1 g/100 mL의 조밀도에. 이 밀도 96 잘 접시 당 3-10 씨앗의 평균 결과입니다.
- 손으로, 96-잘 평면 4 장소-객실 1과 2 (그림 6, 호텔) 호텔 A의 하단 접시. AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 ALP의 상자, 300 mL 저수지 2.1-2.3에 P3, 단계에서 만든 미디어 씨 혼합물으로 가득 그리고 300 mL 저수지 가득 70% EtOH P7에 (그림 4, 갑판 및 그림 6 갑판).
참고: 2.8 통해 2.5 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다. - 객실 1과 2 호텔 A에 제시 하 고 4 개의 격판덮개의 더미를 분리. 빈 정적 알프스 (P4, p5 급, P6, P8, P9, P10, P11, 및 P12)의 각각에 한 접시를 놓습니다. 96 채널 200 µ L 머리에 AP96 P250 피 펫 팁을 로드 합니다.
- P3에 300 mL 미디어 씨 저수지에서 90 µ L 발음 하 고 첫 번째 96 잘 평면으로 분배-하단 접시. 이 프로세스를 반복 하 여 모든 8 접시 포함 미디어 씨 혼합물.
- 발음 하 고 70% 가득 300 mL 저수지에서 70 µ L를 분배 하 여 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7에. 발음 및 분배 물 110% 볼륨 4 번 멀티 채널 팁 세척 ALP에 도움말을 세척 하 고 TL1에서 팁을 언로드 손으로 접시를 수집.
3. 판 검사에 작은 분자를 추가
- 부하, 손으로, 룸 1의 호텔에 A, 2 96-잘 V AP96 P250 피 펫 팁의 상자-하단 희석 라이브러리 접시 객실 2, 4, 6, 및 8, 및 두 96 잘 평면 하단 상영 판 객실 3, 5, 7, 9 (그림 4 에 스태커 및 그림 7, 호텔 A). 또한, 5 갤런 저수지에 멀티 채널 팁 세척 ALP에서 호스를 연결 합니다.
참고: 3.10 통해 3.2 운영 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다. - P7;에서 300 mL 70 %EtOH 세척 저수지 포함 하 갑판을 구성 미디어-씨앗 저수지 P3에 갑판에 남아 있을 수 있습니다 (그림 4, 갑판 및 그림 7, 갑판). 또한, 멀티 채널 팁 세척 ALP 통해 물 순환 장치 컨트롤러의 연결을 통해 콘솔 드라이브를 켜십시오. 이 끌 것 이다 자동으로 프로토콜의 끝에.
- AP96 P250 피 펫 팁 상자의 호텔 A에서 제시 하 고 팁 로더 ALP로 이동.
- 현재 96 잘 V-갑판 및 정적 ALP P4, P8에 하나에 한 장소를 호텔 룸 2 A에서에서 하단 희석 라이브러리 접시. 96-잘 평면 제시-하단 상영 판에서 3 갑판을 호텔 A의 객실 및 하나 정적 ALP P5 및 p 9에.
- AP96 P250 피 펫 팁 팁 로더 96 채널 200 µ L 머리에 ALP와 함께 로드 합니다.
- 96-잘 V 믹스-발음 및 분배 50 µ L 세 번 P4에 바닥판 희석. 그 다음이 플레이트에서 10 µ L 발음 하 고 96 잘 평면으로 분배-P5에 바닥판 심사.
- 발음 및 분배 50 µ L 세 번 P5에 접시에 솔루션을 믹스. 발음 및 70 µ L의 70%를 분배 하 여 에탄올 AP96 P250 피 펫 팁을 청소 EtOH P7와 발음 및 분배의 110% 볼륨으로 멀티 채널 팁 세척 ALP에 팁 물 4 번 다음 세척 저수지에서.
- 3.5와 3.6 단계를 반복 하 여 두 번째 96 잘 v-희석 라이브러리 바닥판 (P8) 및 96-잘 평면-바닥판 심사 (P9).
- 스택 2 96-잘 V-함께 하단 희석 라이브러리 접시와 함께 두 96 잘 플랫 바닥 심사 접시. 정적 알프스 P1, P2, P6, P10, P11, P12, 또는 P13 번호판 이동.
- 반복 단계 3.4-3.9 세 번, 8 번의 총 플레이트 심사에 희석된 화학 제품을 추가. 마지막으로, 시각적 구조를 통해 심사 플레이트의 각 음에 씨앗의 수를 확인 하 고 추가 소독 및 vernalized 씨에 의해 3 씨 그 우물을 보충.
4. 보육 및 판 상영의 시각화
- 품 어 96 잘 평면 하단 상영 판 4 일 동안 22 ° C에서 환경 챔버에 16/8 명암 주기 건조 증거 컨테이너에서. 96-잘-바닥이 빠진 상영 판 해 현미경 시각화. 추가 조사에 대 한 모든 탈 고기를 기록 합니다.
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Representative Results
정확 하 고 효율적으로 특성화 해 현미경 농도 검사에서 작은 분자의 추가에 따라 고기 기능은 애기. 에 앞으로 화학 유전학의이 방법의 최종 목표 모든 50000 화합물 상영 되어 했다 때 관찰 하는 고기 다양 한 되었고 여러 가지 클래스 (그림 2)에 깨진 수 있습니다. 그림 3A -F 해 현미경 저 배율에서 관찰 된 고기의 예를 보여 줍니다. 일부 고기 결정적이 결과 (그림 3G, H) 제공. 이러한 화학 더 낮은 복용량에 다른 표현 형을 제공 하지 않은 되도록 낮은 농도에 필적 했다.
불 쌍 한 결과 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 하나 씨의 불 쌍 한 발 아 속도입니다. 이 주로 발 아 또는 불완전 발 아 고기 (그림 3G, H), 전시 오해의 소지가 될 수 있는 심사 플레이트를 발생할 수 있습니다. 이것을 극복 하기 위해 미리 사용 하는 모든 종자 발 아 속도 테스트. 일단 발 아 속도 설립 되었습니다와 애기에 대 한 95% 보다 큰, 화학 추가 이전 씨앗의 vernalization 동시 발 아를 보장 하는 중요 한 단계 이다. 동시 발 아의 부족 형질에서 false로 되었다면 발생할 수 있습니다. 이것 이외에, 가난한 결과 미디어 부 화 하는 동안 증발 하 허용 되는 경우 발생할 수 있습니다. 수 분의이 부족 출 아에서 씨앗을 방지 하 고 건조-증거 컨테이너를 사용 하 여 피할 수 있습니다. 또한, DMSO와 미디어 솔루션은 적절 한 마이크로 기후 보장 모든 격판덮개의 2 개의 외부 열에 있고 발 아 속도 얻을 수 있습니다.
만족 스러운 실험 결과 발 아 속도 때 달성 된다 > 95%, 씨앗은 바닥이-96-잘 빠진 접시, 동시 발 아 보장에 추가 하기 전에 vernalized와 미디어 인큐베이션 기간 동안 증발 하지 않습니다. 화학 제품 모든 씨앗을 발 아와 고기 정확 하 게 평가 될 수 있는 농도에서 테스트 하는 것이 이상적으로, (그림 3A-F). 대부분 아무 형태학 고기 (그림 3A), 구성 된 탈 선 고기의 대다수와 함께 모의 컨트롤에 시각적으로 구별 되지 않은 고기를 생산 하는 트리 트 먼 트 묘의 표백 및 심각 하 게 저하 뿌리 (그림 2)입니다.
그림 2: 가장 일반적인 고기 관찰과 관찰 각 표현 형의 비율. A) 3,271 작은 분자의 총 외피의 4 일 후 100 µ M에 생리로 발견 했다. 색상 표현 형의 심각도 나타냅니다 (검은 더 심한, 화이트 = = 덜 심각한). 가장 일반적으로 관찰 형 루트 형태학에 냉전 1500 이상의 화합물으로 유도 하는 다양 한 심각도의 저하 뿌리. 채색은 또한 일반적으로 영향을이 라이브러리에서 화합물 1,148 묘 표백 완전히 또는 부분적으로 변색 기록으로. 바로 아래 400 화합물 생산 독특한 루트 머리 고기-저하 중 하나 또는 둘 다 저하 고 밝게 착 색. 마지막으로, 발 아 바로 아래 200 화합물에 의해 영향을 받았다. 이러한 경우에 씨앗 중 발 아 완료 되지 않았습니다 또는 발 아를 시작 하지 않았다. B) 묘도 루트 형태에 이상이 전시 되 고 저하 또는 심각 하 게 저하, 모든 phenotypically 탈 선 묘의 거의 절반을 구성 했다. 다음 가장 큰 그룹 그 또는 변색 묘 목에서 발생 했다. 또한 발 아, 아니 발 아 또는 불완전 발 아 억제 하면서 상당한 부분을 구성 하는 루트 머리 이상 하 냉전 고기만 모든 bioactive 화합물의 작은 백분율에서 발생 했습니다. 마지막으로, 고기 같은 낮은 주파수에서 발생 한 수, 그들은 카테고리 '기타'의 예는 그림 3에서 본 녹색 점액의 생산으로 그룹화 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 앞으로 화학 유전학 화면 중 대표적인 고기의 이미지 관찰. 아니 보이는 형태학 적 이상 (A), 저하 된 (B), 루트 심각 하 게 저하 된 (C), 갈색 루트 머리카락 뿌리 표백 된 (D), (E), 녹색 점액 (F), 불완전 한 발 (G), 아와 아니 발 아 (H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 스태커 10 갑판의 개요 프로토콜의 개시 전에 설정. 스태커 회전 목마 4 스태커 10의 (호텔 A-D)를 각 10 객실 수용의 구성 됩니다. 갑판 알프스의 다양 한 보유: 팁 로더, 스태커 셔틀, 멀티 채널 팁 세척 및 13 정적 알프스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 스태커 10 및 갑판 희석 라이브러리 만드는 필요한 설정. 4 개의 스태커 10 객실 1에서 AP96 P20 피 펫 팁의 상자와 호텔 A-6와 함께 로드 됩니다 D와 4 96 잘 V의-방에서 2-5 및 객실 7-9 호텔 A-D. 하단 플레이트 정적 알프스 P3 및 P7 두 300 mL 저수지 갑판 레이아웃에 의하여 이루어져 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 스태커 10 및 갑판 추가 미디어 씨 혼합물 상영 판에 대 한 설정. 스태커 10 4 96 잘 평면 로드-하단 접시에 객실 1 및 2 호텔 a 정적 알프스 P3 및 P7 TL1에 AP96 P250 피 펫 팁의 상자에 두 개의 300 mL 저수지 갑판 레이아웃에 의하여 이루어져 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 스태커 10 및 갑판 상영 판 추가 작은 분자에 대 한 설정. 스태커 10 룸 1, 96-잘 V 2의 스택 AP96 P250 피 펫 팁의 상자와 함께 로드 됩니다-2, 4, 6, 및 8, 그리고 두 96 잘 플랫의 스택 하단 희석 방에서 플레이트-하단 접시 가득 객실 3에서 미디어 씨 혼합물 5, 7, 9. 정적 알프스 P3 및 P7 두 300 mL 저수지 갑판 레이아웃에 의하여 이루어져 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 애기에 앞으로 화학 유전학 스크린 달성에 연구자를 지원 하도록 설계 되었습니다. 우리가 제공 하는 대표적인 결과 50000 화합물 (그림 2 및 그림 3)의 화면에서 가장 큰 앞으로 화학 유전학 스크린 중의 하나는9,,1323날짜에 애기에 수행. 액체 처리 로봇의 사용에는 더 효율적인 희석 라이브러리 및 라이브러리 생성을 차단, 속도 소설 화합물의 효율성을 향상 사용할 수 있습니다. 높은 처리량 자연에서 화면에 용량을 증가 감소 하는 노동 연구원 대신 동행 했다. 이 기술은 작은 씨앗이 나 해 현미경으로 보이는 식물을 수용할 수 있는 96 잘 접시와 함께 사용 하도록 설계 되었습니다. 큰 씨앗에 맞게 큰 우물 접시를 활용 하 여 처리량과 디자인을 수정 해야 합니다.
이 기술의 추가 제한 포함 무 균 기법; 장비의이 조각을 사용 하 여의 어려움 그러나, 높은 비율의 ½ MS 미디어 자당 부족으로 인해 오염 발생 하지 않았다. 하나 살 균 조건 및 세포 배양, 또는 살 균 챔버24,25액체 처리 로봇을 사용 하 여 무 균 실에서 로봇을 배치 하 여 모든 오염 문제를 우회할 수 있습니다. 또 다른 한계는 팁 크기와 씨앗 열망. 씨; AP96 P20 같은 작은 피 펫 팁 방해할 것 이다 따라서, 더 큰 피 펫 팁 씨앗 분배 및 솔루션 혼합 사용 되어야 한다.
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 모든 접시에 희석 라이브러리 및 라이브러리 심사, 로봇을 공급 하는 때 그들은 올바른 순서에 따라 적절 한 방향에은의 주의 라벨 포함 됩니다. 라벨의 선택을 취소 하 고 체계적인 처리는 간단 하 고이 문제를 극복할 수 있다. 또 다른 중요 한 단계는 오른쪽 장비 스태커 10와 갑판에 실험을 시작 하기 전에 올바른 위치에는 보장 합니다. 장비는 갑판에 제대로 배치 되지 않습니다, 경우 96 채널 200 µ L 머리 수 충돌, 악기를 손상 하 고 유지 보수를 요구. 또 다른 중요 한 단계는 액체의 정확한 금액 300 mL 저수지 내에서 배치 되 고이 금액은 소프트웨어에 올바르게 입력 하도록 이다. 숫자가 일치 하지 않는 경우 도움말 액체를 도달 하지 것 이다 고 포부를 발생 하지 않습니다.
또한 결과 정확한 되도록 조치를 취할 필요가 있다. 우리는 프로토콜을 개발 하는 동안 발견 한 오류는 생활 팁 연결 했다. 연속적으로 로드 및 언로드, 후 팁 발음 하 고 정확 하 게 분배 하는 능력을 잃게됩니다. 그것은 절대적으로 96 팁 각 집합이 사용 됩니다 따라서 최대 4 번까지. 그것은 또한 실수로 상영 판에 추가 될 화학 물질에 대 한 가능성을 피하기 위해 정기적으로 세척 물을 변경 하는 것이 중요입니다. 마지막으로, 일부 화학 솔루션26에서 침전 하는 경향이 있다. 각 화학 정확한 농도에 추가 되도록 믹싱 단계 희석 및 심사 프로토콜에 통합 됩니다. 라이브러리에서 라이브러리 추가, 도전 해석 화학 잠재력의 유도 고기 되 고 화학 물질의 낮은 수량 혼합 실패 될 수 있습니다.
프로토콜의 각 부분에 대 한 올바른 플레이트를 사용 하 여도 매우 중요 하다. V-하단 플레이트는 액체의 작은 볼륨 발음 될 수 있다 고 희석 도서관의 창조에서 사용 하기 위해 권장 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 그들의 반사 빛의 고기의 가난한 시각화를 지도 하기 때문에이 접시는 프로토콜의 심사 부분에 대 한 적합 하지 않습니다. 오래 된 묘 목 3-4 일의 고기를 관찰 하기 위해 화면 평면 하단 플레이트에 실시 해야 합니다.
일단 심사 접시를 만든 시각화가 필요 합니다. 바닥이-96-잘 빠진 접시 해 부 현미경 아래 쉽게 시각화를 수 있습니다. 그것은 번호판을 줄이기 위해 미디어의 증발 건조 방지 컨테이너에 저장 됩니다. 현미경 시각화 대신 고해상도 스캐너를 사용 하는. 이미지를 높은 해상도에서 생산 고기가이 화면에서 관찰의 대부분을 공개 하 고 나중에 재검토 될 수 있는 결과의 아카이브를 제공 합니다. 시각화, 완료 되 고 좋아서 도서관 상영, 또는 다른 화학 라이브러리와 다른 유기 체에이 방법은 수행 다음 수 있습니다. 장비에 대 한 수정 메 마른 문화, 줄기 세포, 균 류, 곤충, 및 작은 식물2,18,,2527의 영역으로 벤처를 수 있도록 허용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리가 건설 하 고 중요 한 토론을 위한 Jozsef 황새, 미첼 리치몬드, Jarrad Gollihue, 그리고 안드레아 산체스 감사합니다. Phenotypic 사진에 대 한 박사 Sharyn 페리입니다. 이 자료는 협력 계약 번호 1355438에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
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