Summary
شاشة عالية إنتاجية من الجزيئات الصغيرة الاصطناعية أجريت على أنواع النباتات النموذجية، أعطيت التمويل. هذا البروتوكول، وضعت لروبوت مناولة سائل، ويزيد من سرعة الشاشات الوراثة الكيميائية إلى الأمام، والتعجيل باكتشاف رواية الجزيئات الصغيرة التي تؤثر فسيولوجيا النبات.
Abstract
يجري استخدام علم الوراثة الكيميائية متزايد فك شفرة الصفات في النباتات التي قد تكون المعاندة لعلم الوراثة التقليدية بسبب تكرار الجينات أو الفتك. ومع ذلك، احتمال جزيء صغير الاصطناعية يجري النشطة بيولوجيا منخفضة؛ ولذلك، يجب اختبار آلاف جزيئات من أجل العثور على تلك التي تهم. التعامل مع الروبوتات نظم مصممة للتعامل مع إعداد كبيرة من العينات، وزيادة السرعة التي يمكن فرز مكتبة كيميائية بالإضافة إلى التقليل من توحيد خطأ السائل. لتحقيق شاشة الفائق الوراثة كيميائية إلى الأمام لمكتبة 50,000 الجزيئات الصغيرة على التمويل نبات (نبات)، بروتوكولات استخدام سائل الأقنية أعلى هيئة معالجة روبوت وضعت التي تتطلب الحد الأدنى مشاركة فني. تم اكتشاف الجزيئات الصغيرة 3,271 مع هذه البروتوكولات، التي تسببت في التعديلات المظهرية مرئية. مركبات 1,563 الناجمين عن جذور قصيرة والتلون مركبات 1,148 غيرت والمركبات 383 تسبب جذر الشعر والتعديلات الأخرى، غير مصنفة، وإنبات 177 مركبات تحول دون.
Introduction
في السنوات ال 20 الماضية الباحثين في مجال البيولوجيا النباتية خطت باستخدام نهج علم الوراثة الكيميائية، على حد سواء إلى الأمام أو عكس، تحسين فهمنا تخليق جدار الخلية الحيوي، سيتوسكيليتون، وتخليق الهرمون الحيوي وإشارات، جرافيتروبيسم والمرضية والحيوي البيورين واندوميمبراني الاتجار1،2،3،،من45. تستخدم تقنيات علم الوراثة الكيميائية إلى الأمام يمكن تحديد تعمل لمصلحة ويسمح للباحثين لفهم قد أسس عمليات خاصة. على العكس من ذلك، يسعى علم الوراثة الكيميائية عكس المواد الكيميائية التي تتفاعل مع بروتين سلفا هدف6. وقد أعطيت في طليعة هذه الاكتشافات في علم الأحياء النباتية للجينوم قليل، المعينة، والمشروح. أنها فترة قصيرة جيل، وهناك عدة أسطر المسخ/مراسل لتسهيل عملية تحديد إليه سوبسيلولار الشاذة7.
هناك اثنين من الاختناقات التي تبطئ التقدم إلى الأمام شاشات الجينية الكيميائية الأولية عملية الفرز وتحديد هدف مجمع الفائدة8. معونة رئيسية في زيادة سرعة التحديد جزيء صغير هو استخدام التشغيل الآلي للمكاتب والمعدات الآلية9. وكان لها دور أساسي في دفع عجلة التقدم في العلوم البيولوجية10الروبوتات مناولة السائل هي أداة ممتازة للتعامل مع مكتبات كبيرة من الجزيئات الصغيرة. ويهدف البروتوكول المعروضة هنا لتخفيف حدة عنق الزجاجة المرتبطة بعملية الفحص، مما يتيح تحديد النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة بمعدل سريع. هذا الأسلوب يقلل من عبء العمل والوقت باسم المشغل بينما تتناقص أيضا التكلفة الاقتصادية للمحقق المبدأ.
وحتى الآن عقدت المكتبات الكيميائية الأكثر حلل بين 10 آلاف و 20,000 المركبات، مع ما يصل إلى 000 150، وبعضها مع عدد قليل من 709،11،،من1213،14، بعض 15 , 16-تم تنفيذ بروتوكول عرض هذه الوثيقة على مكتبة جزيء صغير من مركبات 50,000 (انظر الجدول للمواد)، وواحدة من الوراثة الكيميائية إلى الأمام أكبر شاشات أجريت على نبات حتى الآن. يناسب هذا البروتوكول مع الاتجاه الحالي نحو زيادة الكفاءة والسرعة فيما يتعلق بعلم الوراثة الكيميائية إلى الأمام، لا سيما فيما يتعلق باكتشاف مبيدات الأعشاب، واكتشاف المبيدات الحشرية، ومبيد للفطريات اكتشاف والمخدرات الاكتشاف، وبيولوجيا السرطان17 ،،من1819،،من2021. لو نفذت هنا مع نبات، هذا البروتوكول، يمكن بسهولة أن تتكيف الثقافات الخلية والجراثيم والحشرات حتى يحتمل أن تكون في المتوسطة السائل داخل 96-384-أو لوحات 1536-جيدا. نظراً لصغر حجمها، نبات قابلة للفرز في لوحات جيدا 96. غير أن توزيع البذور بالتساوي بين الآبار يمثل تحديا. اليد بذر دقيقة لكن العمالة المكثفة، وعلى الرغم من أن هناك أجهزة مصممة للاستغناء عن البذور في لوحات 96، حسنا، أنها مكلفة للشراء. هنا، نحن إظهار كيف هذه الخطوة يمكن التحايل عليها بمجرد خسارة صغيرة بدقة.
وكان الهدف العام لهذا الأسلوب جعل فحص مكتبة كيميائية كبيرة ضد نبات أكثر قابلية للإدارة، دون المساس بدقة، عن طريق استخدام الروبوت مناولة السائل. يحسن استخدام هذا الأسلوب كفاءة الباحث بتقليل الوقت المستغرق لإكمال إدارة سلسلة تمييع الأولية والشاشات المظهرية اللاحقة، مما يسمح التصور السريع للعينات تحت مجهر تشريح، والسريع تعريف الرواية النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة. ويصور الشكل 1 النتائج الرئيسية لهذا البروتوكول في 4 خطوات.
رقم 1: سير العمل عموما من الشاشة إلى الأمام علم الوراثة الكيميائية. نظرة عامة على البروتوكول لوصف بالتفصيل لكل خطوة من الخطوات الرئيسية 4. 1: تلقي "المكتبة الكيميائية"، 2: مما يجعل "المكتبة تمييع"، 3: صنع "لوحات الفحص"، و 4: حضانة، وتصور "لوحات الفحص". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنشاء مكتبة تمييع
- تسمية 625 "مكتبة تمييع" لوحات من جهة، ضمان أنها مطابقة لهذه اللوحة المقابلة من مكتبة المواد الكيميائية. بالإضافة إلى ذلك، الاتصال في تدفق وتدفق خراطيم للقنوات المتعددة تلميح الغسيل الآلي المختبرات الطبية Positioner (حزب العمال الأسترالي) بتمريرها من خلال وحدة تحكم محرك الأقراص للجالون 5 الخزان (انظر الجدول للمواد).
- الوصول إلى الكمبيوتر وقم بتشغيل مضخة المياه والصرف الصحي من خلال الاتصال بوحدة تحكم الجهاز إلى "الب يغسل تلميح متعددة القنوات" بغية تعميم المياه. هذا سيتم إيقاف تشغيل تلقائياً في نهاية البروتوكول.
- تحميل، من جهة، 10 مكدس يعلق على "دائري مكدس"، بالترتيب التالي في الفنادق أ-د (الرقم 4، مكدس)؛ مربع واحد من نصائح ماصة P20 AP96 في الغرفة 1، أربعة آبار 96 الخامس-فارغة أسفل لوحات في غرف 2-5 مع لوحات العلوي هما المحتوية على تركيزات الأسهم من مكتبة مرتبة ولوحات أقل اثنين (الشكل 5، مكدس). بالإضافة إلى ذلك، تحميل مربع واحد من AP96 P20 ماصة نصائح في غرفة الاجتماعات 6، وأربعة آبار 96 الخامس-فارغة أسفل لوحات في غرف 7-9 مع لوحات العلوي هما المحتوية على تركيزات مخزون مكتبة مرتبة ولوحات أقل اثنين (الشكل 5، مكدس).
- تعيين أعلى، من جهة، على سطح السفينة مع خزان مياه 300 مل على P3، حمام 300 مل EtOH 70% في P7، محمل تلميح الب (TL1)، وألب يغسل تلميح متعدد الأقنية (TW1) (الشكل 4وسطح السفينة و الشكل 5، سطح السفينة).
- استخدام برنامج التشغيل، يقدم نصائح ماصة P20 AP96 من 10 مكدس ونقلها إلى "الب محمل تلميح".
ملاحظة: يتم 1.5 من خلال 1.12 جميع مع السائل معالجة برامج التشغيل الروبوت؛ انظر الجدول للمواد. - عرض 2 غرفة من الفندق وفصل كل أربعة الخامس 96-جيدا-أسفل اللوحات على سطح السفينة، وضع الأسفل اثنين P4 و P8 واثنين من كبار P5 و P9 (الشكل 4).
- تحميل AP96 P20 ماصة نصائح مع محمل نصيحة الب إلى رأس ميليلتر 200 96-القناة. نضح ميليلتر 90 من خزان مياه 300 مل والاستغناء عن إلى الخامس 96-جيدا-أسفل لوحة تمييع على P4. كرر هذه الخطوة للوحة على P8.
- مزيج لوحة المكتبة الكيميائية على P5 متكررة يسفط والاستغناء عن 15 ميليلتر ثلاث مرات. بالإضافة إلى ذلك، نضح 10 ميليلتر من لوحة المكتبة الكيميائية على P5 والاستغناء عن 10 ميليلتر في لوحة تمييع على P4.
- مزيج من حلول لوحة على P4 متكررة يسفط والاستغناء عن 50 ميليلتر ما مجموعة ثلاث مرات. مرة واحدة مختلطة، نظيفة نصائح ماصة P20 AP96 يسفط والاستغناء عن ميليلتر 70% 70 EtOH من P7، ثم غسلها في "الب متعدد الأقنية نصيحة أغسل" يسفط والاستغناء عن كمية 110 في المائة من المياه أربع مرات.
- كرر الخطوات من 1.8-1.9 للزوج الثاني من لوحات في P8 و P9. عند إنشاء الخامس 96-البئر الثانية-تمييع أسفل لوحة، لوحات بالترتيب التالي من أسفل إلى أعلى المكدس: P5 و P8، P9 و P4. ثم، ضع المكدس في "الب ثابت" فارغ واحد؛ أما P1، P2، P6، P10، P11, P12 أو P13.
- كرر الخطوات من 1، 6-1، 10 حتى 5 غرفة في الفندق بفارغ. كرر الخطوة 1، 5 عند بلوغ 6 غرفة، والتحرك الجديد AP96 P20 ماصة نصائح إلى "الب محمل تلميح" ووضع نصائح ماصة P20 AP96 المستخدمة في "الب ثابت" فارغ.
- كرر الخطوات من 1، 6-1، 10 حتى 9 غرفة في الفندق بفارغ. بيد من أجل المضي قدما إلى الفندق ب، على لوحات ونصائح على سطح السفينة يجب أن يكون حصرياً في الفندق ألف
- من جهة، إعادة ملء خزان مياه 300 مل. تعد هذه الخطوة الحاسمة، ويمكن إدراج البرنامج الحاسوبي وقفه تفصيل هذه الرسالة، التي تتطلب المستخدم لضرب 'تواصل'، قبل القيام بالخطوة التالية.
- كرر الخطوات من 1.5-1.13 للفنادق المتبقية وتأمين خزان مياه كامل 300 مل كل مرة قبل الشروع في الفندق التالي.
2-إضافة خليط البذور وسائط الإعلام لفحص اللوحات
- جعل ½ Murashige والوسائط سكوغ (مللي ثانية) مع 0.1% أجار بإضافة أملاح MS ز 4.3، 0.50 ز مس، 1.0 ز أجار 1 "ل دي ح"2سين ضبط درجة الحموضة إلى 5.7 على الرغم من إضافة هيدروكسيد البوتاسيوم 5 أمتار أثناء الرصد مع تحقيق درجة حموضة.
- تعقيم البذور بالهز لهم في بليتش 1%، والحزب الديمقراطي الصربي بين 15 و 30 دقيقة، وثم يشطف 4 مرات مع تساوي حجم المياه باستخدام الطرد المركزي. وبمجرد بذور عقيمة، وضعها في 4 درجات مئوية من 24 ساعة لمدة 7 أيام فيرنيليزيشن. مركز الموارد البيولوجية نبات يصف أساليب إضافية للتعقيم، فيرنيليزيشن، ونمو22.
- إضافة البذور إلى وسائل الإعلام باليد في كثافة من 0.1 غ/100 مل. نتائج هذه الكثافة في متوسط من 3-10 بذور كل من صفيحة 96-جيدا جيدا.
- مكان، من جهة، أربعة آبار 96 مسطحة-أسفل لوحات في غرف 1 و 2 من فندق A (الشكل 6، بفندق). ضع مربع AP96 P250 ماصة النصائح على "الب محمل تلميح" وخزان 300 مل مليئة بخليط البذور وسائط الإعلام التي تم إنشاؤها في الخطوات 2.1-2.3 P3 على ملء خزان 300 مل مع 70% EtOH على P7 (الشكل 4والسطح و الشكل 6 سطح السفينة).
ملاحظة: يتم 2.5 من خلال 2.8 مع برنامج التشغيل. - يقدم غرف 1 و 2 في الفندق، وفصل رزمة من أربعة ألواح. وضع لوحة واحدة على كل من جبال الألب ثابت فارغ (P4, P5، P6، P8، P9، P10، P11 و P12). تحميل نصائح ماصة P250 AP96 على رأسه ميليلتر 200 96-القناة.
- نضح ميليلتر 90 من خزان البذور وسائط 300 مل على P3 والاستغناء عن إلى شقة 96-البئر الأولى-أسفل لوحة. كرر هذه العملية حتى كل ثماني لوحات تحتوي على خليط البذور وسائط الإعلام.
- تنظيف نصائح ماصة P250 AP96 يسفط والاستغناء عن 70 ميليلتر من الخزان 300 مل مليئة 70% EtOH على P7. يغسل النصائح في "القنوات المتعددة نصيحة أغسل الب" يسفط والاستغناء عن كمية 110 في المائة من المياه أربع مرات وتفريغ النصائح في TL1، وجمع اللوحات باليد.
3-إضافة جزيئات صغيرة لفحص اللوحات
- تحميل، من جهة، ومربع من نصائح ماصة P250 AP96 في "الغرفة 1 من الفندق"، هما 96-جيدا الخامس-أسفل تمييع مكتبة لوحات في غرف 2، 4، 6، و 8، وهما 96 جيدا مسطحة-أسفل فحص لوحات إلى غرف 3، 5 و 7، و 9 (الشكل 4 ، مكدس و الرقم 7، بفندق). بالإضافة إلى ذلك، توصيل خراطيم من "الب نصيحة أغسل القنوات المتعددة" للجالون 5 خزان.
ملاحظة: يتم 3.2 خلال 3.10 مع برنامج التشغيل. - تكوين سطح السفينة لتحتوي على 300 مل 70% EtOH يغسل خزان في P7؛ يمكن أن يترك الخزان وسائط الإعلام-البذور على سطح السفينة في P3 (الشكل 4وسطح السفينة و الرقم 7, سطح السفينة). بالإضافة إلى ذلك، قم بتشغيل وحدة تحكم محرك الأقراص عن طريق اتصال وحدة تحكم الجهاز لتوزيع المياه عن طريق "الب يغسل تلميح القنوات المتعددة". هذا سيتم إيقاف تشغيل تلقائياً في نهاية البروتوكول.
- AP96 P250 ماصة تلميح مربع من الفندق ونقله إلى "الب محمل تلميح".
- يقدم الخامس 96-جيدا-أسفل المكتبة تمييع لوحات من 2 غرفة في فندق A إلى سطح السفينة ومكان واحد على P4 "الب ثابتة" واحدة على P8. عرض شقة 96-جيدا-لوحات الفحص السفلي من غرفة الاجتماعات 3 من فندق إلى سطح السفينة ومكان واحد على P5 "الب ثابتة" وواحدة في P9.
- تحميل AP96 P250 ماصة نصائح مع محمل نصيحة الب إلى رأس ميليلتر 200 96-القناة.
- مزيج الخامس 96-جيدا-أسفل لوحة تمييع على P4 يسفط والاستغناء عن 50 ميليلتر ثلاث مرات. وبعد ذلك، نضح 10 ميليلتر من هذه اللوحة والاستغناء عن إلى شقة 96-جيدا-أسفل لوحة الفحص على P5.
- مزيج من الحلول في اللوحة في P5 يسفط والاستغناء عن 50 ميليلتر ثلاث مرات. تنظيف نصائح ماصة P250 AP96 مع الإيثانول يسفط والاستغناء عن ميليلتر 70% 70 EtOH من الخزان في P7 والغسيل ثم النصائح في "الب متعدد الأقنية نصيحة أغسل" يسفط والاستغناء عن كمية 110 في المائة من المياه أربع مرات.
- كرر الخطوات من 3.5 و 3.6 الخامس الثاني 96-جيدا-لوحة مكتبة تمييع أسفل (P8) وشقة 96-جيدا-أسفل لوحة الفحص (P9).
- V 96-جيدا المكدس الاثنين-أسفل المكتبة تمييع لوحات معا وهما لوحات فحص أسفل شقة 96-جيدا معا. نقل اللوحات ثابتة الألب P1 أو P2، P6، P10، P11, P12 أو P13.
- كرر الخطوتين 3، 4-3.9 ثلاث مرات، وإضافة مواد كيميائية المخفف لفحص اللوحات ما مجموعة ثماني مرات. وأخيراً، التحقق من عدد البذور في كل بئر من لوحات الفحص من خلال تشكيل البصرية وتكملة تلك الآبار بأقل من ثلاث بذور من بذور معقمة وفيرناليزيد إضافية.
4-الحضانة والتصور لفحص اللوحات
- احتضان "لوحات الفحص" مسطحة القاع 96-جيدا لمدة أربعة أيام في دائرة للبيئة عند 22 درجة مئوية في دائرة الضوء/الظلام 16/8 في حاوية دليل على جفاف. تصور "لوحات الفحص" مسطحة القاع 96-البئر تحت مجهر تشريح. تسجيل جميع تعمل الشاذة لإجراء مزيد من التحقيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
القدرة على تميز بدقة وكفاءة تعمل على أساس إضافة الجزيئات الصغيرة في فحص تركيزات تحت مجهر تشريح هو الهدف النهائي لهذه الطريقة في علم الوراثة الكيميائية إلى الأمام في نبات. تعمل لاحظ عندما قد فحصت جميع مركبات 50,000 المتنوعة ويمكن تقسيم إلى عدة فئات متميزة (الشكل 2). الشكل 3 ألف --و يصور أمثلة تعمل التي لوحظت في تضخم منخفضة تحت مجهر تشريح. وقدمت بعض تعمل نتائج غير حاسمة (الشكل 3، ح). وكان هؤلاء يتم اختبارها في تركيزات أقل لضمان أن المادة الكيميائية لم توفر النمط الظاهري مختلفة بجرعة أقل.
يمكن أن تظهر النتائج السيئة لأسباب عديدة. واحد معدلات الفقراء إنبات البذور. يمكن أن يسبب هذا لوحة فحص غالباً يحمل لا إنبات أو تعمل إنبات ناقصة (الشكل 3، ح)، التي يمكن أن تكون مضللة. للتغلب على هذا، قبل اختبار معدلات الإنبات لجميع البذور المستخدمة. مجرد معدلات الإنبات قد أنشئت، وهي أكبر من 95% لنبات، فيرناليزيشن بذور قبل إضافة المواد الكيميائية خطوة رئيسية ضمان إنبات المتزامنة. يمكن أن يؤدي عدم الإنبات المتزامنة إلى إيجابيات كاذبة في فينوتيبينج. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنشأ النتائج السيئة إذا سمح لوسائل الإعلام أن تتبخر أثناء الحضانة. وهذا الافتقار إلى الماء يمنع البذور من الإنبات ويمكن تجنبها عن طريق استخدام حاويات مقاومة للجفاف. بالإضافة إلى ذلك، الحلول [دمس] ووسائط الإعلام في العمودين الخارجيين لكل لوحة، وتأمين المناخات الصغرى الصحيحة ويتم الحصول على معدلات الإنبات.
وتتحقق النتائج التجريبية مرضية عندما تكون معدلات الإنبات > 95%، يتم فيرناليزيد البذور قبل إضافة إلى لوحات مسطحة 96-جيدا-أسفل، ضمان إنبات المتزامنة، ووسائل الإعلام لا تتبخر أثناء الحضانة. ومن الناحية المثالية، أن يختبر المواد الكيميائية بتركيز تسمح جميع البذور على الإنبات وتعمل أن تقيم بدقة (الشكل 3 ألف-F). غالبية الشتلات علاجات أنتجت مع تعمل التي تم تمييزها بصريا من عناصر صورية مع لا تعمل المورفولوجي (الشكل 3 ألف)، مع الغالبية العظمى من تعمل الشاذة التي تتألف من المبيضة وشدة توقف الجذور (الشكل 2).
رقم 2: تعمل الأكثر شيوعاً لاحظت، ونسبة كل من النمط الظاهري لاحظ. A) مجموعة جزيئات الصغيرة 3,271 تبين أن النشطة بيولوجيا في 100 ميكرومتر بعد أربعة أيام حضانة. اللون تشير إلى شدة النمط الظاهري (السوداء = أكثر شدة، والأبيض = أقل حدة). لاحظ الأكثر شيوعاً تتعلق بالنمط الظاهري مورفولوجيا الجذر، مع مركبات 1,500 أكثر من حمل توقف جذور متفاوتة الخطورة. كما يشيع تأثر التلون المركبات في هذه المكتبة، مع 1,148 الشتلات المسجلة المبيضة كلياً أو جزئيا مشوه. تنتج مركبات تقل 400 تعمل مميزة جذر الشعر – أما توقف أو كليهما التقزم والملونة الزاهية. وأخيراً، تأثر الإنبات بمركبات أقل بقليل من 200. وفي هذه الحالات، بذور أما لم يكتمل الإنبات أو لم تبدأ حتى الإنبات. ب) شتلة العارضة شذوذ في مورفولوجيا الجذر، أما يجري التقزم أو شدة التقزم، تشكل ما يقرب من نصف جميع شتلات phenotypically الشاذة. ثاني أكبر مجموعة هي تلك التي أدت إلى شتلات المبيضة أو مشوه. تعمل التي تتعلق بشذوذ الشعر الجذر أيضا يتألف جزء كبير مع تثبيط الإنبات، لا إنبات أو الإنبات غير مكتملة، حدث إلا في نسبة مئوية صغيرة من جميع المركبات النشطة بيولوجيا. وأخيراً، كان هناك عدد من تعمل التي وقعت في مثل هذا تردد المنخفض، أنها صنفت في فئة 'الأخرى'، مثال الذي كان إنتاج الصمغ الخضراء، ينظر في الشكل 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: لاحظ الصور للممثل تعمل خلال الشاشة الوراثة الكيميائية إلى الأمام. لا تظهر تشوهات مورفولوجية (أ)، بني الشعر الجذر (ب) توقف الجذر (ج) شدة توقف الجذر (د)، اللتان المبيضة (E)، الأخضر الصمغ (F) وإنبات ناقصة (ز) ولا إنبات (ح). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: إعداد نظرة عامة على 10 مكدس وسطح السفينة قبل الشروع في البروتوكول. وتتألف من أربعة مكدس 10 في (الفنادق أ-د) التي تستوعب عشر غرف "دائري مكدس". على سطح يحمل مجموعة متنوعة من جبال الألب: المحمل تلميح والمكوك مكدس والغسيل "تلميح متعددة القنوات" والالب ساكنة 13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: مكدس 10 وسطح السفينة إعداد مطلوب لإنشاء "مكتبة تمييع". 10 مكدس الأربعة ليتم تحميلها مع مربعات AP96 P20 ماصة النصائح في غرف 1 و 6 فنادق أ-د، وأكوام من أربعة آبار 96 الخامس-أسفل لوحات في غرف 9 7 2-5 وغرف الفنادق ألف-دال تخطيط سطح السفينة يتكون من خزانين 300 مل على ساكنة P3 الألب و P7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إعداد مكدس 10 وسطح السفينة "خليط" البذور وسائل الإعلام إضافة إلى "لوحات الفحص". يتم تحميل 10 مكدس مع أربعة آبار 96 مسطحة-أسفل لوحات في غرف 1 و 2 ألف فندق تخطيط سطح السفينة يتكون من خزانين 300 مل ثابت الألب P3 و P7 ومربع من AP96 P250 ماصة نصائح حول TL1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: إنشاء مكدس 10 وسطح السفينة "الجزيئات الصغيرة إضافة" إلى "لوحات الفحص". يتم تحميل 10 مكدس مع مربع AP96 P250 ماصة النصائح في الغرفة 1، كومة من اثنين 96-جيدا الخامس-تمييع أسفل اللوحات في غرف 2 و 4، 6، و 8، وكومه من اثنين 96-جيدا مسطحة-أسفل لوحات مليئة بخليط البذور وسائط الإعلام في 3 غرف ، 5 و 7 و 9. تخطيط سطح السفينة يتكون من خزانين 300 مل على ثابت الألب P3 و P7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم هذا البروتوكول لمساعدة الباحثين في إنجاز شاشة الوراثة كيميائية إلى الأمام على نبات. نحن نقدم نتائج تمثيلية من شاشة مركبات 50,000 (الشكل 2 و الشكل 3)، واحدة من أكبر الشاشات الوراثة الكيميائية إلى الأمام أجريت على نبات حتى9،،من1323. مكن استخدام الروبوت السائلة معالجة أكثر كفاءة تمييع مكتبة وفحص مكتبة الجيل، تحسين سرعة وكفاءة لتحديد هوية المركبات الرواية. ورافق زيادة القدرة على الشاشة في طابع إنتاجية عالية تناقص العمل نيابة عن الباحث. تم تصميم هذه التقنية ليتم استخدامها مع لوحات 96-جيدا، والتي يمكن أن تستوعب البذور الصغيرة أو محطات مرئية تحت مجهر تشريح. استخدام لوحات مع أكبر الآبار لاحتواء بذور أكبر سيتطلب تعديلات على الإنتاجية وتصميم.
وتشمل القيود الإضافية لهذا الأسلوب صعوبة استخدام هذا قطعة من المعدات مع تقنيات العقيم؛ ومع ذلك، ونحن لم يصادف نسب عالية من التلوث بسبب ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الوسائط التي تفتقر إلى السكروز. واحد يمكن التحايل أي قضية التلوث عن طريق وضع الروبوت في غرفة معقمة والسماح لظروف معقمة وزراعة الخلايا، أو باستخدام روبوت مناولة سائل مع24،دائرة عقيمة25. قيد آخر حجم تلميح وتطلع البذور. وسوف تسد تلميح ماصة صغيرة مثل AP96 P20 مع البذور؛ ولذلك، يجب استخدام تلميح ماصة أكبر للاستغناء عن البذور وخلط الحل.
وتشمل الخطوات الحاسمة في إطار هذا البروتوكول وصف دقيق لكل الألواح في مكتبة تمييع ومكتبة الفرز، ضمان هم في الاتجاه السليم جنبا إلى جنب مع الترتيب الصحيح عند تغذية الروبوت. قم بوضع العلامات ومعالجة منهجية واضحة ويمكن التغلب على هذه المشكلة. خطوة حاسمة أخرى هي ضمان المعدات المناسبة في المكان الصحيح قبل البدء بالتجربة، سواء داخل مكدس في 10 أو على سطح السفينة. إذا لم يتم بشكل صحيح وضع المعدات على سطح السفينة، ميليلتر 200 96-قناة رئيس يمكن أن تحطم، إتلاف الصك والتي تحتاج إلى صيانة. خطوة حاسمة أخرى هو ضمان أن المبلغ الصحيح للسائل يوضع داخل الخزانات 300 مل وأن هذا المبلغ هو إدخال بشكل صحيح في البرنامج. إذا لم تتطابق الأرقام، النصائح لن تصل إلى السائل وتطلع لن يحدث.
كما أن من الضروري اتخاذ خطوات لضمان دقة النتائج التي تم الحصول عليها. خطأ واحد أن لاحظنا أثناء تطوير البروتوكول ترتبط بنصيحة الحياة. بعد المتعاقبة التحميل والتفريغ، النصائح تفقد قدرتها على نضح والاستغناء عن دقة. ولذلك لا بد أن يتم استخدام كل مجموعة من النصائح 96 كحد أقصى أربع مرات. كما أن من المهم تغيير مياه الغسيل بانتظام لتجنب احتمال المواد الكيميائية المراد إضافتها دون قصد إلى فحص الصفائح. وأخيراً، بعض المواد الكيميائية لديها ميل إلى يعجل من أصل26من الحل. للتأكد من إضافة كل مادة كيميائية في تركيز الصحيح، إدراج الخطوات خلط في تمييع وبروتوكول الفحص. يمكن أن يؤدي عدم خلط كميات منخفضة من المواد الكيميائية التي يجري تفسير المضافة من مكتبة لمكتبة، تحديا الكيميائية المحتملة التي يسببها تعمل.
استخدام لوحات الصحيح لكل جزء من البروتوكول أيضا مهم جداً. الخامس-أسفل لوحات مصممة للتأكد من أن كميات صغيرة من السائل يمكن أن يستنشق، ويوصي باستخدامها في إنشاء "مكتبة تمييع". ومع ذلك، هذه اللوحات ليست مناسبة لفحص جزء من البروتوكول، نظراً لانعكاسها الضوء يؤدي إلى سوء التصور لتعمل. من أجل مراقبة تعمل يوم 3-4 شتلات القديمة، الشاشة يجب أن تنفذ في لوحات مسطحة القاع.
بعد أن تم إنشاء لوحات الفحص، التصور المطلوب. 96-جيدا مسطحة-أسفل لوحات تسمح سهلة التصور تحت تشريح مجاهر. من المحتم أن اللوحات يتم تخزينها في حاويات مقاومة للجفاف لتقليل التبخر من وسائط الإعلام. هو بديل للتصور مجهرية باستخدام ماسح ضوئي عالي الدقة. تكشف عن أغلبية تعمل في هذه الشاشة الصور المنتجة بدقة عالية وتوفر أرشيفا للنتائج التي يمكن أن يعاد النظر فيها في المستقبل. بمجرد اكتمال التصور، وفحص مكتبة اختيارك، يمكن ثم يمكن تنفيذ هذا الأسلوب على كائنات مختلفة أو مع مكتبة كيميائية مختلفة. تعديلات على المعدات التي يمكن أن تسمح للثقافة العقيمة، والسماح بدخول المشاريع إلى العوالم من الخلايا الجذعية والفطريات والحشرات والنباتات الصغيرة2،18،،من2527.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونحن نشكر جوزيف جو ستورك، ريتشموند ميتشل، جولو مراد اليحصبي، واندريا سانشيز للمناقشة البناءة والهامة. الدكتور بيري شارين للصور الفوتوغرافية المظهرية. ويستند إلى العمل المدعوم من "المؤسسة الوطنية للعلوم" تحت الاتفاق التعاوني رقم 1355438 هذه المواد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
