Summary
Sentetik küçük moleküllerin yüksek üretilen iş ekran modeli bitki türleri, Arabidopsis thalianayapılmıştır. Sıvı işleme robot için geliştirilen bu iletişim kuralı, ileri kimyasal genetik ekranlar, Bitki fizyolojisi etkileyen roman küçük moleküller keşfi hızlanan hızını artırır.
Abstract
Kimyasal genetik giderek gen artıklık veya ölümcül nedeniyle geleneksel genetik inatçı olabilir bitkiler özellikleri kodunu çözmek için istihdam olmak. Ancak, sentetik bağlanabilecek küçük bir moleküldür biyoaktif olma olasılığı düşüktür; Bu nedenle, moleküller binlerce ilgi bulmak için test gerekir. Robot sistemleri çok sayıda örnekleri, hangi ile kimyasal bir kütüphane en aza/hata standartlaştırılması ek olarak taranması hızı artan işlemek için tasarlanmıştır işleme sıvı. Bir tezgah üstü çok kanallı sıvı kullanarak kitaplığa Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), üzerinde 50.000 küçük moleküllerin yüksek üretilen iş ileri kimyasal genetik ekranı ulaşmak için protokolleri robot işleme geliştirilmiş olup, tüm en az gerektiren teknisyen katılımı. Bu protokoller ile 3,271 küçük moleküller görünür fenotipik değişiklikler neden olduğu keşfedildi. 1,563 bileşikleri kısa kök, 1,148 bileşikler değişmiş renklendirme, 383 bileşikler neden kök saç ve diğer, Sigara kategorize, değişiklikler ve 177 bileşikler inhibe çimlenme indüklenen.
Introduction
Son 20 yılda bitki Biyoloji alanındaki araştırmacılar hücre duvarı sentezi, sitoiskeleti, hormon sentezi anlayışımızı geliştirmek ve sinyal kimyasal genetik yaklaşımları, ileriye ve geriye doğru kullanarak büyük atılımlar yapmış, gravitropism, Patogenez, pürin biyosentezi ve1,2,3,4,5kaçakçılığı endomembrane. İleri kimyasal genetik teknikler kullanan fenotipleri ilgi kimliği sağlar ve belirli işlemleri genotypic temellerini anlamak araştırmacılar sağlar. Diğer taraftan, ters kimyasal genetik bir önceden belirlenmiş protein hedef6ile etkileşim kimyasallar arar. Eşlenen ve açıklamalı genomunu küçük olduğu için Arabidopsis bu keşifler bitki Biyoloji ön planda olmuştur. Bu kısa oluşturma süresi ve anormal hücre altı makine7tanımlaması kolaylaştırmak kullanılabilir birden çok mutant/muhabir hatları vardır.
İleri kimyasal genetik ekranlar ilerlemesini, ilk eleme süreci ve bileşik faiz8hedef belirleme yavaş iki önemli performans sorunları vardır. Küçük molekül seçimi hızını artırarak büyük bir yardım otomasyon ve otomatik ekipman9kullanmaktır. Sıvı işleme robotlar büyük kütüphaneler küçük moleküllerin işleme için mükemmel bir araçtır ve biyolojik bilimler10' ilerleme sürüş vesile olmuştur. Burada sunulan Protokolü biyoaktif küçük moleküller hızlı bir hızda. kimliği etkinleştirme tarama süreci ile ilgili performans sorunu hafifletmek için tasarlanmıştır Bu teknik emek ve zaman operatör adına da ilke araştırmacı için ekonomik maliyet azalan süre yükünü azaltır.
Şimdiye kadar en kimyasal kitaplıkları analiz 10.000 ve 20.000 bileşikleri, bazı kadar 150.000 ve bazı az 709,11,12,13,14, ile arasında düzenlenen 15 , 16. burada tanıttı protokolü 50.000 bileşikler (bkz. Tablo reçetesi) küçük molekül Kütüphanesi hayata geçirildi, bir büyük ileri kimyasal genetiğin ekranlar üzerinde yürütülen Arabidopsis bugüne. Özellikle ilgilidir gibi herbisit bulma, böcek ilacı bulma, mantar ilacı doğru artan verimlilik ve hız ile ilgili ileri kimyasal genetik, mevcut trendi ile bu iletişim kuralını uyar keşfetmek, ilaç keşif ve kanser Biyoloji17 ,18,19,20,21. Burada Arabidopsis ile uygulanan rağmen bu iletişim kuralı, kolayca olabilir hücre kültürleri, sporları ve potansiyel olarak bile böcekler için adapte 96, 384 veya 1536-şey tabak içinde sıvı ortamda. Kendi küçük boyutları nedeniyle, Arabidopsis mükellef taraması 96 iyi tabak içinde. Ancak, kuyular arasında eşit şekilde tohumu dağıtma bir mücadeledir. El tohum emek yoğun doğrudur ve tohum 96-şey kalıplara dağıtmak üzere tasarlanan aygıt olsa, onlar satın almak pahalıdır. İşte, nasıl bu adım küçük bir kayıp ile doğruluk atlatılabilmişlerdir göstermektedir.
Bu yöntem genel amacı doğruluğu, üzerinden bir sıvı işleme robot kullanımı ödün vermeden Arabidopsis daha yönetilebilir karşı büyük bir kimyasal Kütüphane eleme yapmaktı. İlk seyreltme serisi yönetimi ve örnekleri bir diseksiyon mikroskop altında ve hızlı hızlı görselleştirme izin sonraki fenotipik ekranlar tamamlamak için geçen süre azaltarak, bu yöntemin kullanılması araştırmacının daha etkili olmasını sağlar kimliği roman biyoaktif küçük moleküller. Şekil 1 4 adımda bu protokolün önemli sonuçlar gösterilmektedir.
Şekil 1: genel iş akışı ileri kimyasal genetik ekranın. Bazı detay ile her 4 önemli adımlar için açıklanan protokol genel bir bakış. 1: kimyasal Kütüphane, 2 alma: seyreltme Kütüphane, 3 yapım: yapım eleme plakaları ve 4: kuluçka ve eleme kaplamalar görselleşebilme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. seyreltme kitaplığı oluşturma
- 625 seyreltme Kütüphane plakaları el ile kimyasal kitaplığından kendi karşılık gelen plakasına eşleştikleri sağlanması etiketleyin. Ayrıca, bağlantı akışı ve akış hortumlar için çok kanallı ipucu yıkama otomatik aygıtlar Pozisyoner (ALP) dışarı 5 galon rezervuar konsol sürücü geçerek ( Tablo malzemelerigörmek).
- Bilgisayara erişmek ve çok kanallı ipucu yıkama ALP için aygıt denetleyicisi bağlantısı üzerinden yıkama pompası su geçirilip yorumlanması için dolaştırmak için açın. Bu protokol sonunda otomatik olarak kapanır.
- Yük, el, Stacker 10'ın Stacker Carousel, otel A - D (şekil 4, Stacker); aşağıdaki sırayla bağlı bir kutu AP96 P20 pipet ipuçları Oda 1, dört 96-şey V-Odalar 2-5 alt levha sipariş edilen Kütüphane ve iki alt plaka hisse senedi konsantrasyonları içeren iki üst plakalı boş (şekil 5, Stacker). Ayrıca, Oda 6 ve dört 96-şey V AP96 P20 pipet ipuçlarında, bir kutu yüklemek-Odalar 7-9 alt levha sipariş edilen Kütüphane ve iki alt plaka hisse senedi konsantrasyonları içeren iki üst plakalı boş (şekil 5, Stacker).
- P3, 300 mL % 70 alkol banyo P7 üzerinde üzerinde 300 mL su haznesi ile güverte, el ile ayarla ipucu yükleyici ALP (TL1) ve çok kanallı ipucu yıkama ALP (TW1) (şekil 4, güverte ve şekil 5, güverte).
- İşletim yazılımı kullanarak, Stacker 10'dan AP96 P20 pipet ipuçları sunmak ve ipucu yükleyici ALP taşıyın.
Not: 1.5 1.12 tüm aracılığıyla robotun çalışma yazılım işleme sıvı ile yapılır; Tablo malzemelerigörmek. - Mevcut Oda 2 otel a ve tüm dört 96-şey V ayrı-alt tabaklar güverte üzerinde alt yerleştirerek iki P4 ve P8 ve ilk iki P5 ve P9 (şekil 4).
- AP96 P20 pipet ipuçları ile uç yüklü ALP 96-kanal 200 µL baş üzerine yükleyin. 300 mL su rezervuar 90 µL Aspire edin ve 96-şey V dağıtmak-alt seyreltme plaka P4 üzerinde. P8 tabağa için bu adımı yineleyin.
- P5 kimyasal Kütüphane tabağa hkr alıyorum ve 15 µL üç kez dağıtımı ile karıştırın. Ayrıca, P5 kimyasal Kütüphane tabağa üzerinden 10 µL Aspire edin ve P4 seyreltme tabağın içine 10 µL dağıtmak.
- P4 tabağa çözümleri sürekli alıyorum ve 50 µL dağıtımı tarafından toplam üç kez karıştırın. Temiz karışınca alıyorum ve % 70 70 µL dağıtımı tarafından AP96 P20 pipet ipuçları sonra onları yıkama çok kanallı ipucu yıkama ALP alıyorum ve su dört bir %110 hacim dağıtımı tarafından alkol P7, üzerinden zaman.
- P8 ve P9 Tabaklarda ikinci çifti için 1,8 1,9 adımları yineleyin. İkinci 96-şey V oluşturma üzerine-alt seyreltme plaka, plaka ile aşağıdaki sırada alt üst yığını: P9, P5, P8 ve P4. Sonra yığının üzerinde bir boş statik ALP yer; P1, P2, P6, P10, P11, P12 veya P13.
- Oda 5 otel a boş 1.6-1,10 tamamlayana dek. Oda 6 ulaşan, yeni AP96 P20 pipet ipuçları için ipucu yükleyici ALP hareketli ve kullanılan AP96 P20 pipet ipuçları üzerinde boş bir statik ALP yerleştirerek üzerine 1.5 adımı yineleyin.
- Oda otel 9 A boş 1.6-1,10 tamamlayana dek. Ancak, otel B için devam etmek için tabakalar ve ipuçları güvertede otel A. yeniden yüklenmesi gerekir
- , El ile 300 mL su haznesi yeniden doldurun. Bu adım çok önemlidir ve bilgisayar programı 'devam, sonraki adımı gerçekleştirmeden önce' vurmak kullanıcı gerektiren bu mesajı ayrıntılı bir duraklama dahil edebilirsiniz.
- Sonraki Hotel'e devam etmeden önce her zaman bir tam 300 mL su haznesi sağlanması kalan otel 1.5-1,13 arasındaki adımları yineleyin.
2. medya-tohum karışımı plakaları eleme için ekleme
- ½ Murashige ve Skoog (MS) medya ile % 0,1 Agar 4.3 g MS Salts, 0.50 g MES, 1.0 g Agar 1 L DI H2O. eklenmesiyle ayarlamak pH 5,7 için yine de 5 M potasyum hidroksit ilavesi ile pH probe izleme sırasında.
- Onları % 1 çamaşır suyu ve SDS 15 ve 30 dk arasında sallayarak tohum sterilize ve sonra 4 kez Santrifüjü tarafından eşit bir su hacmi ile durulayın. Tohum steril olduğunda, onları vernilization için 7 gün 24 saat üzerinden 4 ° C yerleştirin. Arabidopsis biyolojik kaynak merkezi sterilizasyon, vernilization ve büyüme22ek yöntemlerini açıklar.
- Tohum medyaya bir yoğunluk 0,1 g/100 mL el ile ekleyin. Bu yoğunluğu 3-10 tohum iyi bir 96-şey plaka başına ortalama sonuçlanır.
- Yer, elle, dört 96-şey düz-Oda sayısı 1 ve 2 otel a (6 rakam, otel A) alt levha. İpucu yükleyici ALP AP96 P250 pipet ipuçları bir kutu yerleştirin, 2.1-2,3 üzerinde P3 adımlarda oluşturduğunuz medya-tohum karışımı ile 300 mL su deposu dolu ve 300 mL su deposu dolu ile % 70 alkol P7 üzerinde (şekil 4, güverte ve şekil 6 Güverte).
Not: 2,5 ile 2,8 işletim yazılımı ile yapılır. - Oda sayısı 1 ve 2 otel a mevcut ve dört tabak yığınları ayırın. Bir tabak her boş statik Alpler (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 ve P12) üzerinde yerleştirin. AP96 P250 pipet ipuçları 96-kanal 200 µL kafasına yük.
- P3 üzerinde 300 mL medya-tohum rezervuar 90 µL Aspire edin ve ilk 96-şey düz dağıtmak-alt plaka. Tüm sekiz plakaları medya-tohum karışımı içeren kadar bu işlemi yineleyin.
- AP96 P250 pipet keyif alıyorum ve 70 µL % 70 ile dolu 300 mL rezervuar dağıtımı temizleyin alkol P7 üzerinde. İpuçları çok kanallı ipucu yıkama ALP içinde alıyorum ve su bir %110 hacim dört kez dağıtımı tarafından yıkama ipuçları TL1, kaldırma ve tabakları el ile toplamak.
3. küçük moleküller plakaları eleme için ekleme
- Yük, elle, bir kutu AP96 P250 pipet ipuçları Oda 1, otel haline A, iki 96-şey V-2, 4, 6 ve 8 oda ve iki 96 de düz-alt eleme kalıplara Odalar 3, 5, 7 ve 9 (şekil 4 alt seyreltme Kütüphane kalıplara Stacker ve Şekil 7, otel A). Ayrıca, hortumlar ve çok kanallı ipucu yıkama ALP 5 galon su deposu üzerinden bağlayın.
Not: 3.10 üzerinden 3.2 işletim yazılımı ile yapılır. - Güverte P7 bir 300 mL % 70 alkol yıkama rezervuar içeren yapılandırma; medya-tohum rezervuar P3, güvertede yaptı (şekil 4, güverte ve Şekil 7, güverte). Buna ek olarak, çok kanallı ipucu yıkama ALP suda dolaşmaya aygıt denetleyicisi bağlantısı üzerinden konsol sürücü açın. Bu protokol sonunda otomatik olarak kapanır.
- AP96 P250 pipet İpucu kutusunu Hotel A'dan sunmak ve ipucu yükleyici ALP taşıyın.
- 96-şey V mevcut-alt seyreltme Kütüphane plakaları otel Oda 2 A güverte ve statik ALP P4 ve P8 üstünde bir yer. 96-şey düz sunmak-alt tarama plakalar üzerinden Oda 3 otel a güverte ve bir statik ALP P5 ve P9 üstünde bir yer.
- AP96 P250 pipet ipuçları ile uç yüklü ALP 96-kanal 200 µL baş üzerine yükleyin.
- 96-şey V mix-alt seyreltme plaka alıyorum ve üç kez 50 µL dağıtımı P4 üzerinde. Bu, bu plaka 10 µL Aspire edin ve 96-şey düz dağıtmak-alt tarama plaka üzerinde P5.
- P5 plaka çözümlerinde alıyorum ve üç kez 50 µL dağıtımı ile karıştırın. AP96 P250 pipet ipuçları etanol ile temiz alıyorum ve % 70 70 µL dağıtımı tarafından alkol P7 ve sonra yıkama ipuçları çok kanallı ipucu yıkama alıyorum ve % 110 hacmi dağıtımı ALP, dört kez su rezervuar.
- İkinci 96-şey V için 3.5 ve 3.6 adımları yineleyin-alt seyreltme Kütüphane plaka (P8) ve 96-şey düz-alt tarama plaka (P9).
- Yığın iki 96-şey V-alt seyreltme Kütüphane tabak birlikte ve iki 96-şey düz alt tarama tabak birlikte. Tabakları statik ALPs P1, P2, P6, P10, P11, P12 veya P13 taşıyın.
- 3.4-3,9 üç kez adımları yineleyin, tarama için seyreltilmiş kimyasallar ekleyerek toplam sekiz kez tabaklar. Son olarak, her iyi görsel uyum aracılığıyla tarama plakaların tohumların numarayı denetleyin ve bu wells ile ek steril ve vernalized tohum tarafından üçten tohum ek.
4. kuluçka ve görselleştirme plakaları tarama
- 96-şey düz-alt eleme plakaları dört gün boyunca 22 ° c çevre bir odasında bir 16/8 açık/koyu döngüsünde bir kuruma geçirmez konteyner kuluçkaya. 96-şey düz-alt eleme plakaları diseksiyon mikroskop altında görselleştirin. Daha fazla araştırma yapılması için tüm anormal fenotipleri kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Doğru ve verimli bir şekilde fenotipleri konsantrasyonları diseksiyon mikroskop altında eleme, küçük moleküller ilavesi dayalı karakterize bu yöntem Arabidopsis. üzerinde ileri kimyasal genetiğin sonu hedefi yeteneğidir Ne zaman tüm 50.000 bileşikler ekranlı gözlenen fenotipleri farklı ve çeşitli farklı sınıflar (Şekil 2) kırık. Şekil 3A -F diseksiyon mikroskop altında düşük büyütmede gözlendi fenotipleri örnekleri gösterilmektedir. Bazı fenotipleri sağlanan kesin olmayan sonuçlar (şekil 3 g, H). Bunlar kimyasal daha düşük bir dozda, farklı bir fenotip vermedi emin olmak için daha düşük konsantrasyonlarda yeniden test vardı.
Kötü sonuç birçok nedenle ortaya çıkabilir. Zavallı çimlenme oranları tohumların biridir. Bu ağırlıklı olarak hiçbir çimlenme veya eksik çimlenme fenotipleri (şekil 3 g, H), hangi yanıltıcı olabilir sergilemek bir tarama plaka neden olabilir. Bu sorunu gidermek için önceden için kullanılan tüm tohum çimlenme oranları sınayın. Çimlenme oranları kurulmuş olan Arabidopsis için % 95'den büyük, vernalization kimyasal ek önce tohum eşzamanlı çimlenme sağlanması önemli bir adım olarak ayarlanır ve. Eşzamanlı çimlenme eksikliği fenotipleme yanlış pozitif yol açabilir. Medya kuluçka sırasında buharlaşmasına izin veriliyorsa buna ek olarak, kötü sonuçlar ortaya çıkabilir. Hidrasyon bu eksikliği tohum takımıdır üzerinden engeller ve kuruma dayanıklı kapsayıcılar kullanılarak önlenebilir. Ayrıca, DMSO ve medya çözümleri uygun mikro iklimlerde sağlanması her plaka iki dış sütun biçimidir ve çimlenme oranları elde edilir.
Tatmin edici sonuçlar deneysel çimlenmesi oranları olduğunda elde edilir > % 95, tohum ek 96-şey düz-alt levha, eşzamanlı çimlenme, sağlanması içine önce vernalized ve medya kuluçka sırasında buharlaşır değil. İdeal olarak, kimyasal tüm tohum çimlenme ve doğru bir şekilde değerlendirilmesi fenotipleri sağlayan bir konsantrasyonu test edilir (şekil 3A-F). Tedaviler üretilen fidan oluşan anormal fenotipleri büyük çoğunluğu ile morfolojik yok fenotipleri (şekil 3A) ile sahte denetimlerden görsel olarak ayırt edilemez fenotipleri ile çoğunluğu ağartılmış ve ciddi bodur kökleri (Şekil 2).
Şekil 2: gözlenen en yaygın fenotipleri ve gözlenen her fenotip oranı. A) 3,271 küçük moleküller toplam kuluçka dört gün sonra 100 µM biyoaktif olmak bulunmuştur. Rengi fenotip şiddetini gösterir (siyah = daha şiddetli, beyaz daha az şiddetli =). En sık gözlenen fenotip pertained kök Morfoloji için 1.500'den fazla bileşikler ile değişen önem bodur kökleri inducing. Renklendirme de genellikle bu kitaplıktaki bileşikler ağartılmış tamamen veya kısmen renksiz olarak kaydedilen 1,148 fidan ile etkilenen. Hemen altında 400 bileşikler ayırt edici kök saç fenotipleri – ya bodur üretilen veya her ikisi de bodur ve parlak renkli. Son olarak, çimlenme hemen altında 200 bileşikler tarafından etkilendi. Bu gibi durumlarda, tohum çimlenme tamamlanmadı ya da bile çimlenme başlamadı. B) fide kök Morfoloji, anormallikleri de sergilenmesi bodur veya ciddi bodur, tüm phenotypically anormal fidan neredeyse yarısını oluşturmaktadır. Sonraki en büyük grup meçli veya renksiz fidan sonuçlandı bunlardı. Çimlenme, hiçbir çimlenme veya eksik çimlenme, inhibisyonu ise oldukça büyük bir bölümü de uydurdum kök saç anomalileri pertained fenotipleri sadece içinde küçük bir yüzdesi tüm biyoaktif bileşiklerin oluştu. Son olarak, böyle bir düşük frekansta oluştu fenotipleri bir dizi vardı, onlar hangi örneği yeşil zamk, şekil 3' te görülen üretim oldu kategori içine 'diğer', gruplandırılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi fenotipleri görüntülerini gözlenen sırasında ileri kimyasal genetik ekran. Hiçbir görünür morfolojik anormallikler (A), (B) bodur, kök (C) ağır bodur, kahverengi kök tüyleri (D) ağartılmış, kök (E), yeşil zamk (F), eksik çimlenme (G) ve (H) hiçbir çimlenme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yığıcı 10 ve güverte bakış Protokolü başlanmasından önce kurmak. Yığıcı Carousel dört Stacker hangi her on Oda uyum 10 /'ın (otel A - D) oluşur. Güverte ALPs çeşitli tutar: ipucu yükleyici, Stacker Servisi, çok kanallı ipucu yıkama ve 13 statik ALPs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Yığıcı 10 ve seyreltme kütüphane oluşturmak için gerekli kurmak güverte. Dört Stacker 10's AP96 P20 pipet ipuçları Odalar 1 kutu ve oteller A - 6 ile yüklenen D ve yığınlar dört 96-şey v-alt plaka odalarında otel A - ö. 2-5 ve Odalar 7-9 Güverte düzeni iki 300 mL rezervuar statik ALPs P3 ve P7 oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Yığıcı 10 ve güverte kurmak için medya-tohum karışıma ekleyerek eleme plakaları. Yığıcı 10 dört 96-şey düz ile yüklenir-Oda sayısı 1 ve 2 otel a. alt levha Güverte düzeni iki 300 mL rezervuar statik ALPs P3 ve P7 ve bir kutu AP96 P250 pipet ipuçları TL1 oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Yığıcı 10 ve güverte kurmak için ekleyerek küçük moleküller eleme plakaları için. Yığıcı 10 AP96 P250 pipet ipuçları Oda 1, iki 96-şey V yığını bir kutu dolu olan-alt seyreltme tabaklar odalarda 2, 4, 6 ve 8 ve iki 96-şey düz bir yığın-alt plaka dolu Odalar 3 medya-tohum karışımı ile , 5, 7 ve 9. Güverte düzeni iki 300 mL rezervuar statik ALPs P3 ve P7 oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı araştırmacılar Arabidopsis ileri kimyasal genetik ekranda yerine getirmeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Biz temsilcisi sonuçları sağlamak 50.000 bileşikleri (Şekil 2 ve şekil 3) ekranında, en büyük ileri kimyasal genetik ekranlar birini9,13,23bugüne kadar Arabidopsis üzerinde gerçekleştirilen. Sıvı işleme robot kullanımı etkin daha verimli seyreltme Kütüphane ve Kütüphane üretimi eleme, hız ve kimliği roman bileşiklerin verimliliğini artırma. Ekran yüksek üretilen iş doğada kapasitesinin artırılması araştırmacı adına emek azaltarak eşlik etti. Bu teknik küçük tohum veya santral diseksiyon mikroskop altında görünür kalabileceği 96-şey plakalı kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Daha büyük tohum sığdırmak için daha büyük kuyu ile plakalar kullanan işlem hacmi ve tasarım yapılan değişiklikler gerektirir.
Bu tekniğin ek sınırlamaları ekipman bu parça ile aseptik teknikler kullanarak zorluk içerir; Ancak, kirlenme ½ MS medya Sükroz eksik nedeniyle yüksek oranlarda karşılaştınız mı değil. Bir herhangi bir kirlenme sorunu bir steril odada robot yerleştirerek steril koşullar ve hücre kültürü için veya bir sıvı işleme robot ile steril Oda24,25kullanarak izin aşmak. Ucu boyutunu başka bir kısıtlamadır ve tohum aspirasyon. AP96 P20 gibi küçük pipet ucu ile tohum yapışmasına neden; Bu nedenle, daha büyük bir pipet ucu tohum dağıtımı ve çözüm karıştırma için kullanılmalıdır.
Bu protokol içinde kritik adımlar dikkatli robot beslenirken doğru sırada birlikte uygun yönlendirmeyi içinde bulundukları sağlanması tüm plakaları seyreltme Kütüphane ve tarama Kütüphane, etiketleme içerir. Etiketleme temizleyin ve sistematik işlem basittir ve bu sorunun üstesinden gelebilir. Başka bir önemli adım Stacker 10's içinde ve güverte üzerinde deney başlamadan önce doğru ekipman doğru yerde olduğunu garanti etmektedir. Cihazın düzgün güvertede değil koyarsanız, 96-kanal 200 µL kafa, araç zarar ve bakım gerektiren kalabilir. Başka bir önemli adım sıvı doğru miktarda 300 mL su depoları içinde yerleştirilir ve bu miktar yazılım doğru girildiğini garanti etmektedir. Sayıları eşleşmiyorsa, ipuçları sıvı erişemeyecektir ve aspirasyon değil ortaya çıkar.
Elde edilen sonuçların doğru olduğundan emin olmak için adımlar atmaya gereklidir. Biz protokol geliştirirken fark bir hata hayat ipucu bağlıydı. Art arda gelen yükleme ve boşaltma sonra ipuçları Aspire edin ve doğru bir şekilde dağıtmak için yeteneklerini kaybedecekler. Bu nedenle 96 ipuçları her kümesi kullanılır şarttır en fazla dört kez. Düzenli olarak yanlışlıkla plakaları eleme için eklenecek kimyasallar için potansiyel önlemek için yıkama suyu değiştirmek önemlidir. Son olarak, bazı kimyasal maddeler dışarı çözüm26çökelti eğilimi var. Her kimyasal doğru konsantrasyon eklenir emin olmak için karıştırma adımları seyreltme ve tarama Protokolü dahil edilmiştir. Karıştırmak için başarısızlık potansiyel kimyasal indüklenen Kütüphane Kütüphane eklendi, zorlu yorumlanması fenotipleri olmak kimyasal maddelerin düşük miktarlarda neden olabilir.
İletişim kuralı her bölümü için doğru plakaları kullanarak da çok önemlidir. V-alt plaka küçük miktarlarda sıvı Aspire ve seyreltme Kütüphane oluşturma kullanmak için tavsiye edilir sağlamak için tasarlanmıştır. Ancak, ışığın yansıması fenotipleri zavallı görsel öğeye yol açar bu yana bu plakaları Protokolü ' nün tarama bölümü için uygun değildir. 3-4 gün fenotipleri eski fidan gözlemlemek için düz-alt levha ekran yapılmalıdır.
Tarama plakaları oluşturduktan sonra görselleştirme gereklidir. 96-şey düz-alt plaka mikroskoplar dissekan altında kolay görselleştirme sağlar. Bu tabakları medya buharlaşma azaltmak için kuruma dayanıklı kaplarda saklanır zorunludur. Alternatif mikroskobik görselleştirme için yüksek çözünürlüklü bir tarayıcı kullanıyor. Görüntüleri yüksek çözünürlükte üretilen bu ekranda gözlenen fenotipleri çoğunluğu ortaya çıkarmak ve bir arşiv içinde belgili tanımlık gelecek revisited sonuçları sağlar. Görselleştirme tamamlandıktan sonra seçtiğiniz Kütüphane ekranlı, bu yöntem daha sonra farklı organizmalar üzerinde veya farklı bir kimyasal kitaplık ile gerçekleştirilebilir. Ekipman değişiklikleri steril kültür, kök hücre, mantar, böcek ve küçük bitkiler2,18,25,27alemlerine girişimler izin için izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Jozsef leylek, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue ve Andrea Sanchez yapıcı ve eleştirel tartışma için teşekkür ederiz. Dr. Sharyn Perry fenotipik fotoğraflar için. Bu malzeme Kooperatifi anlaşması No 1355438 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
