Summary
מסך תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות סינתטי נערך על מודל צמח מינים, תודרנית לבנה. פרוטוקול זה, שפותח עבור רובוט טיפול בנוזלים, מגביר את המהירות של גנטיקה כימי קדמי מסכים, האצת גילוי הרומן מולקולות קטנות המשפיעים על פיזיולוגיה של הצמח.
Abstract
גנטיקה כימי יותר ויותר מתבצעים לפענח את תכונות בצמחים שעשויים להיות עקשניים על גנטיקה מסורתי הגן יתירות או הקטלניות. עם זאת, ההסתברות של מולקולה קטנה סינתטי להיות ביו היא נמוכה; לכן, אלפי מולקולות חייב להיבדק על מנת למצוא עניין. נוזלי טיפול רובוטיקה מערכות נועדו להתמודד עם מספר רב של דוגמאות, הגדלת המהירות שבה ספרייה כימיים יכולים להיות מוקרן בנוסף מזעור/סטנדרטיזציה של שגיאה. כדי להשיג מסך גנטיקה כימי קדימה תפוקה גבוהה של ספריה של 50,000 מולקולות קטנות על תודרנית לבנה (תודרנית), פרוטוקולים באמצעות נוזל רב-ערוצי ספסל-העליון טיפול רובוט פותחו הדורשים מינימלי טכנאי מעורבות. אותם פרוטוקולים, התגלו מולקולות קטנות 3,271 שגרם פנוטיפי שינויים הנראים לעין. תרכובות 1,563 המושרה שורשים קצרים, תרכובות 1,148 שינו צבע, תרכובות 383 גרם שורש השיער שינויים אחרים, שאינם-מחולק לקטגוריות, ואת תרכובות 177 עכבות נביטה.
Introduction
ב- 20 השנים האחרונות החוקרים בתחום ביולוגית הצמח עשו צעדים גדולים באמצעות גישות גנטיקה כימי, ויוצאים, שיפור ההבנה שלנו של דופן התא ביוסינטזה, שלד התא, הורמון ביוסינטזה והאיתות, gravitropism, פתוגנזה, ביוסינטזה פורין ו endomembrane סחר1,2,3,4,5. העסקת גנטיקה כימי קדימה טכניקות מאפשר זיהוי פנוטיפים עניין ומאפשר לחוקרים להבין את היסודות genotypic של תהליכים מסוימים. לעומת זאת, גנטיקה כימית הפוכה מחפש כימיקלים המקיימים אינטראקציה עם היעד שנקבע מראש חלבון6. תודרנית כבר בחוד החנית של תגליות אלה בביולוגיה צמח כי הגנום שלו הוא קטן, מיפוי, מבואר. יש לו זמן דור קצר, ויש מספר שורות חשבונאי/כתב זמין להקל על הזיהוי של חריגה מכונות subcellular7.
ישנם שני צווארי בקבוק גדול כי להאט התקדמות קדימה מסכי גנטי כימי הראשונית סינון, קביעת היעד של המתחם של ריבית8. מכשיר מרכזי להגדיל את המהירות של מולקולה קטנה הבחירה הוא השימוש אוטומציה, ציוד אוטומטי9. טיפול בנוזלים רובוטים היה אינסטרומנטלי שנסע התקדמות מדעי הביולוגיה10הינם כלי מצוין לטיפול ספריות גדולות של מולקולות קטנות. פרוטוקול המובאת כאן נועד להקל על צוואר הבקבוק המשויך תהליך המיון, הפעלת הזיהוי של מולקולות קטנות ביואקטיביות בקצב מהיר. טכניקה זו מקטינה את נטל העבודה ואת זמן מטעם המפעיל תוך כדי גם הפחתת העלות הכלכלית לחוקר עקרון.
עד כה, ספריות כימי רוב ניתח להחזיק בין תרכובות 10,000 ו- 20,000, חלקם עם כמה שיותר 150,000 וחלק עם כמה כמו 709,11,12,13,14, 15 , 16. פרוטוקול הציג במסמך זה יושם על ספריה מולקולה קטנה של תרכובות 50,000 (ראה טבלה של חומרים), אחד של הגנטיקה כימי קדמי גדול יותר מסכי תודרנית מתנהל על תאריך. פרוטוקול זה מתאים עם המגמה הנוכחית לקראת התייעלות ומהירות לגבי גנטיקה כימי קדימה, במיוחד כאשר זה נוגע גם גילוי קוטל עשבים, חרקים גילוי, פטריות לגלות, סמים גילוי, וביולוגיה סרטן17 ,18,19,20,21. למרות מיושמת כאן עם תודרנית, פרוטוקול זה, יכול בקלות להיות מותאם תרביות תאים, נבגים וחרקים שעלולים אפילו בינוני נוזלי בתוך 96, 384- או צלחות 1536-. טוב. בגלל גודלו הקטן, תודרנית הוא נוטה הקרנה ב- 96 צלחות היטב. עם זאת, הפצת זרעים באופן שווה בין וולס הוא אתגר. יד זריעה מדויקת אבל עבודה אינטנסיבית, למרות קיימים התקנים שנועדו לוותר על זרעים לוחות 96-ובכן, הם יקרים לרכוש. כאן, אנו מראים איך שלב זה אוכל מצויין עם רק הפסד קטן ברמת הדיוק.
המטרה הכוללת של שיטה זו היתה ההקרנה ספריה גדולה כימי נגד תודרנית יותר לניהול, מבלי להתפשר על דיוק, באמצעות השימוש של רובוט טיפול בנוזלים. השימוש בשיטה זו משפרת את היעילות של החוקר על ידי הפחתת לוקחים את הזמן כדי להשלים את סדרת דילול ראשוני וניהול במסכים הבאים פנוטיפי, המאפשר ויזואליזציה מהירה של דגימות תחת מיקרוסקופ ויבתר, ומהירה זיהוי של הרומן ביואקטיביות מולקולות קטנות. איור 1 מציג התוצאות של פרוטוקול זה מפתח ב- 4 שלבים.
איור 1: זרימת העבודה הכולל של המסך גנטיקה כימי קדימה. מבט כולל על פרוטוקול מכדי לתארו כמה פרטים עבור כל אחד השלבים המפתח 4. 1: קבלת הספרייה כימי, 2: ביצוע הספרייה דילול, 3: מכין את הצלחות הקרנת ו- 4: המקננת והצגה של הלוחות ההקרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יצירת ספריה דילול
- תווית 625 דילול ספריית לוחות בכתב יד, ולהבטיח כי הם תואמים צלחת המקביל שלהם מהספריה כימי. בנוסף, להתחבר זרימה ולצאת צינורות זרימה רב-ערוצי עצה לשטוף כלים אוטומטיים מכשור מעבדתי Positioner (ALP) על ידי הכנסתם הכונן מסוף לטנק 5 המאגר (ראה טבלה של חומרים).
- גישה למחשב והפעל המשאבה שטיפת דרך החיבור של בקר התקן האלפ שטיפת עצה רב-ערוצי כדי לזרום מים. פעולה זו תבטל את באופן אוטומטי בסוף הפרוטוקול.
- עומס, בעבודת יד, ה-10 מערם המצורפת הקרוסלה מערם, לפי הסדר הבא במלונות A - D (איור 4, מערם); קופסא אחת של AP96 P20 פיפטה טיפים מקום 1, 4 V 96-ובכן-לוחות בחדרים 2-5 עם שתי צלחות העליון המכיל ריכוזים מניות מן הספרייה מסודרת והלוחיות התחתון שני ריק (איור 5, מערם). בנוסף, טען קופסא אחת של AP96 P20 פיפטה טיפים בחדר 6, וכן ארבעת V 96-ובכן-לוחות בחדרים 7-9 עם שתי צלחות העליון המכיל ריכוזים מניות של הספרייה מסודרת והלוחיות התחתון שני ריק (איור 5, מערם).
- הגדר, בכתב יד, הסיפון עם מאגר מים 300 מ ב- P3, אמבטיה EtOH 300 מ ל-70% P7, עצה מטעין ALP (TL1), ו ALP שטיפת עצה רב-ערוצי (TW1) (איור 4, הסיפון ו איור 5, הסיפון).
- שימוש בתוכנת ההפעלה, מתנה AP96 P20 פיפטה טיפים 10 מערם ולהעבירם האלפ מטעין עצה.
הערה: 1.5 דרך 1.12 כל נעשים עם הנוזל טיפול תוכנת של הרובוט ההפעלה; ראה טבלה של חומרים. - להציג את 2 חדר מלון א ולהפריד בין כל ארבעת 96-ובכן V-התחתון צלחות על הסיפון, הצבת התחתון 2 P4, P8 ו העליון שני על P5 ו- P9 (איור 4).
- לטעון AP96 P20 פיפטה טיפים עם מטעין עצה אלפ אל 200 96-ערוץ µL הראש. האחות µL 90 מן המאגר 300 מ ל מים, מדבקות/ברקודים לתוך המבקר 96-ובכן-צלחת דילול התחתון-P4. חזור על שלב זה עבור הלוחית P8.
- מערבבים על הלוחית ספריית כימי P5 שוב ושוב כ רפה בעברית, מחלק 15 µL שלוש פעמים. בנוסף, האחות µL 10 מ הלוחית ספריית כימי P5, לוותר על 10 µL המשקולת דילול ב P4.
- מערבבים הפתרונות של הצלחת על P4 שוב ושוב כ רפה בעברית, מחלק 50 µL בסך הכל שלוש פעמים. ברגע מעורב, לנקות הטיפים פיפטה P20 AP96 על ידי כ רפה בעברית dispensing µL 70 70% EtOH מ- P7, ואז מכבסת אותם ב- ALP שטיפת עצה רב-ערוצי על ידי כ רפה בעברית dispensing נפח 110% של המים ארבע פעמים.
- חזור על שלבים 1.8-1.9 עבור זוג צלחות על P8 ו- P9 השני. בעת יצירת המבקר 96-ובכן השני-צלחת דילול התחתון, מחסנית הלוחות לפי הסדר הבא מן התחתון אל העליון: P9, P5, P8 ו- P4. אז, במקום הערימה על אחד ריק ALP סטטי; P1, P2, P6, P10, P11, P12 או P13.
- חזור על שלבים 1.6-1.10 עד 5 חדר ב- Hotel מלון ריקה. חזור על שלב 1.5 להגיע 6 חדרים, חדשה AP96 P20 פיפטה טיפים לעבור האלפ מטעין עצה ועל הצבת העצות פיפטה P20 AP96 בשימוש על סלע סטטי ריק.
- חזור על שלבים 1.6-1.10 עד 9 חדרים של מלון A ריקה. עם זאת, על מנת להמשיך Hotel B, צלחות וטיפים על הסיפון חייב להיטען לתוך המלון א
- למלא מחדש, בכתב יד, מאגר המים 300 מ. שלב זה הוא קריטי, התוכנית המחשב ניתן לשלב עצירה המפרט את ההודעה, המחייב את המשתמש ללחוץ 'המשך', לפני ביצוע השלב הבא.
- חזור על הצעדים 1.5-1.13 למלונות הנותרים, הקפדה מלאה 300 מ ל מים עצמאים בכל פעם לפני שתמשיך למלון הבא.
2. להוסיף את תערובת מדיה-זרע כדי הקרנת לוחות
- להפוך את ½ Murashige Skoog (MS) מדיה עם 0.1% אגר על ידי התוספת של 4.3 g MS מלחי, 0.50 g MES, 1.0 g אגר L DI H 12או להתאים את ה-pH ל 5.7 למרות התוספת של 5 מ' אשלגן הידרוקסידי תוך מעקב אחר עם מכשיר בדיקה pH.
- לחטא זרעים ע י ניעור אותם בין 1% מלבין מרחביות בין 15 ל 30 דקות ולאחר מכן לשטוף 4 פעמים עם אמצעי אחסון שווה של מים על ידי צנטריפוגה. לאחר זרעים סטרילי, למקם אותם ב 4 ° C מ- 24 שעות עד 7 ימים עבור vernilization. מרכז המשאבים ביולוגית תודרנית מתאר שיטות נוספות של עיקור וסירוס, vernilization גידול22.
- להוסיף זרעים מדיה בעבודת יד-צפיפות של 0.1 גרם/100 mL. צפיפות זו התוצאה ממוצע של 3-10 זרעים לכל טוב של צלחת 96-ובכן.
- במקום, בעבודת יד, ארבעה שטוח 96-ובכן-לוחות חדרים 1 ו- 2 של המלון (איור 6, Hotel מלון). מקום קופסת AP96 P250 פיפטה עצות האלפ מטעין עצה, מאגר 300 מ"ל מלא עם התערובת מדיה-זרע שנוצרו בשלבים P3 על 2.1-2.3 ו 300 מ"ל מאגר מלא 70% EtOH-P7 (איור 4, הסיפון, איור 6 הסיפון).
הערה: 2.5 עד 2.8 נעשים עם תוכנת הפעלה. - להציג חדרים 1 ו- 2 Hotel מלון, ולהפריד בין ערמות של ארבעה לוחות. במקום לוח אחד על אחד של האלפים סטטי ריק (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 ו P12). לטעון AP96 P250 פיפטה טיפים על 200 96-ערוץ µL הראש.
- האחות µL 90 מן המאגר מדיה-זרע 300 מ ב- P3, לוותר על לגור בדירה 96-ובכן הראשונה-צלחת התחתון. חזור על תהליך זה עד שמונה צלחות כל להכיל את התערובת מדיה-זרע.
- לנקות את הטיפים פיפטה P250 AP96 על ידי כ רפה בעברית dispensing 70 µL מן המאגר 300 מ"ל מלא 70% EtOH-P7. לשטוף את הטיפים ב רב-ערוצי עצה לשטוף ALP על ידי כ רפה בעברית dispensing נפח 110% של המים ארבע פעמים, לפרוק את הטיפים-TL1, לאסוף את הצלחות בעבודת יד.
3. הוספת את מולקולות קטנות כדי הקרנת לוחות
- עומס, ביד, קופסה של AP96 P250 פיפטה טיפים למלון. החדר 1 של A, שני V 96-ובכן-דילול לוחות ספריית לתוך החדרים 2, 4, 6 ו- 8, ו 96 שני טוב שטוח התחתונה הקרנת לוחות לחדרים 3, 5, 7 ו- 9 (איור 4 מערם ו- איור 7, Hotel מלון). בנוסף, לחבר את הצינורות את רב-ערוצי עצה שטיפת ALP לטנק 5 אגירה וממנה.
הערה: 3.2 דרך 3.10 נעשים עם תוכנת הפעלה. - קביעת תצורה של החפיסה כדי להכיל מאגר לשטוף EtOH של 70% 300 מ"ל-P7; מאגר מדיה-זרע יכול להישאר על הסיפון-P3 (איור 4, הסיפון, איור 7, הסיפון). בנוסף, להפעיל את הכונן מסוף דרך חיבור של בקר התקן לזרום מים דרך האלפ שטיפת עצה רב-ערוצי. פעולה זו תבטל את באופן אוטומטי בסוף הפרוטוקול.
- להציג AP96 P250 פיפטה עצה תיבת Hotel א והעברתו האלפ מטעין עצה.
- להציג את V 96-ובכן-ספריית דילול לוחות 2 חדר של מלון A הסיפון, במקום אחד על ALP סטטי P4 ואחד על P8. להציג את הדירה 96-ובכן-לוחות הקרנה של חדר 3 של מלון לסיפון ומניחים אחד ב- ALP סטטי P5 ואחד על P9.
- לטעון AP96 P250 פיפטה טיפים עם מטעין עצה אלפ אל 200 96-ערוץ µL הראש.
- לערבב את V 96-ובכן-צלחת דילול התחתון-P4 על ידי כ רפה בעברית dispensing 50 µL שלוש פעמים. בעקבות זאת, תשאף µL 10 מן הצלחת הזו, לוותר על תוך הדירה 96-ובכן-הצלחת התחתונה הקרנה על P5.
- מערבבים את הפתרונות בצלחת-P5 על ידי כ רפה בעברית dispensing 50 µL שלוש פעמים. לנקות את הטיפים פיפטה P250 AP96 עם אתנול כ רפה בעברית, מחלק µL 70 70% EtOH מן המאגר-P7 ולאחר מכן לשטוף הטיפים ב רב-ערוצי עצה שטיפת ALP על ידי כ רפה בעברית dispensing נפח 110% של מים ארבע פעמים.
- חזור על הצעדים 3.5 ו 3.6 V 96-ובכן השני-ספריית הצלחת התחתונה דילול (P8), 96-ובכן שטוח-צלחת ההקרנה התחתון (P9).
- מחסנית השניים 96-ובכן V-ספריית דילול לוחות יחד, שתי צלחות של ההקרנה התחתון שטוח 96-ובכן ביחד. להעביר את הצלחות סטטי האלפים P1, P2, P6, P10, P11, P12 או P13.
- חזור על השלבים 3.4-3.9 שלוש פעמים, הוספת כימיקלים מדולל הקרנת פלטות בסך הכל שמונה פעמים. לבסוף, בדוק את המספר של זרעים של כל טוב של הלוחות הקרנה באמצעות אישור חזותי, תוספת מאותן בארות עם פחות משלושה זרעים על ידי זרעים סטיריליים ו vernalized נוספים.
4. דגירה והדמיה של הקרנת לוחות
- דגירה הלוחות הקרנת 96-ובכן שטוח התחתונה במשך ארבעה ימים ב חדר סביבתי ב 22 ° C על מחזור 16/8/כהה במיכל הוכחה לייבוש. דמיינו את 96-ובכן שטוח התחתונה הקרנת פלטות תחת מיקרוסקופ ויבתר. לתעד את כל חריגה פנוטיפים לחקירה נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולת בדייקנות וביעילות לאפיין פנוטיפים בהתבסס על התוספת של מולקולות קטנות-הקרנת ריכוזים תחת מיקרוסקופ ויבתר היא היעד הסופי של שיטת העברה כימית גנטיקה על תודרנית. הפנוטיפים נצפו כל התרכובות 50,000 היו הוקרנו מגוונים, יכול להיות שבור לתוך כמה כיתות נפרדות (איור 2). איור 3 א -F מציג דוגמאות של פנוטיפים אשר נצפו בהגדלה נמוכה תחת מיקרוסקופ ויבתר. כמה פנוטיפים סיפק תוצאות חד משמעיות (איור 3G, H). אלה היו להערכה מחדש בריכוזים נמוכים כדי להבטיח כי החומר הכימי לא מספקים פנוטיפ שונה במינון נמוך יותר.
תוצאות המסכן יכול להיווצר מסיבות רבות. אחת היא שיעורי הנביטה המסכן של הזרעים. זה יכול לגרום צלחת הקרנה בעיקר שהפגינו ללא נביטה או פנוטיפים נביטה לא שלם (איור 3G, H), אשר יכול להיות מטעה. כדי להתגבר על זה, לבדוק מראש במחירים נביטת זרעים כל פעם. לאחר נביטה המחירים נקבעו, גדול מ 95% עבור תודרנית, vernalization של זרע לפני תוספת כימית היא צעד המפתח הבטחת נביטה בו זמנית. חוסר נביטה בו זמנית יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות ב- phenotyping. בנוסף לכך, תוצאות המסכן יכול להיווצר אם המדיה מורשה להתאדות במהלך הדגירה. חוסר שתיה מונעת הנבטת זרעים, יכולים להימנע באמצעות מכולות לייבוש-הוכחה. בנוסף, דימתיל סולפוקסיד ופתרונות התקשורת בשתי העמודות חיצוני של כל צלחת, הבטחת נאות מיקרו אקלים, שיעורי הנביטה מתקבלים.
תוצאות משביעות רצון ניסיוני מושגות כאשר נביטה תעריפי > 95%, זרעים הם vernalized לפני תוספת לוחות 96-ובכן שטוח התחתונה, הבטחת נביטה בו זמנית, ועל התקשורת אינה נגמרת בתקופת הדגירה. באופן אידיאלי, כימיקלים להיבדק אצל בריכוז מאפשר כל הזרעים לנבוט, פנוטיפים להעריך במדויק (איור 3 א-F). הרוב המכריע של השתילים טיפולי המיוצר עם פנוטיפים שהיו חזותית להבחין מגניחותיה הפקדים מעושה עם אין פנוטיפים מורפולוגי (איור 3 א), עם הרוב המכריע של פנוטיפים aberrant המורכב מולבן קשות שורשים ננסיים (איור 2).
איור 2: על הפנוטיפים הנפוץ ביותר שנצפו ושיעור של כל פנוטיפ נצפתה. א) סך של מולקולות קטנות 3,271 נמצאו להיות ביו-100 מיקרומטר לאחר ארבעה ימי דגירה. הצבע מציין את חומרת פנוטיפ (שחור = חמור יותר, לבן = פחות חמור). הנפוץ ביותר שנצפו פנוטיפ לחצו שורש מורפולוגיה, עם יותר מ-1,500 תרכובות גרימת ננסיים שורשים של חומרה משתנות. הגיוון הושפע גם בדרך כלל תרכובות בספריה זו, עם שתילים 1,148 כיאה מולבן לחלוטין או חלקית דהוי. תרכובות רק תחת 400 המיוצר פנוטיפים ייחודי שורש השיער – גם בסקריפטים או שניהם ננסיים צבעוניים. לבסוף, נביטה הושפע תרכובות רק תחת 200. במקרים אלה, זרעים לא הושלמה נביטה או התחיל אפילו לנבוט. B) שתילים מפגין חריגות בתוך השורש מורפולוגיה, גם להיות ננסיים או קשות ננסיים, היוו כמעט מחצית כל השתילים phenotypically סוטה. הקבוצה הגדולה ביותר הבא היו אלו שגרמו שתילים מולבן או דהוי. פנוטיפים זה התייחסו להעברת מומים שורש השיער גם המציא חלק נכבד תוך כדי עיכוב של נביטה, אין נביטה או נביטה לא שלם, אירעה רק באחוז קטן של כל תרכובות ביו. לבסוף, היו מספר של פנוטיפים שארעו בתדירות כזאת נמוכה, הם קובצו לקטגוריה 'האחרת', דוגמה שבה היה הייצור של mucilage ירוק, ראה באיור3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תמונות של פנוטיפים נציג ציין במהלך המסך גנטיקה כימי קדימה. אין חריגות מורפולוגי גלוי (א), שערות השורש חומות (B), ננסיים שורש (ג), קשות ננסיים שורש (ד), מולבן (E), גרין mucilage (נ), לא שלם נביטה (G) ואין נביטה (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: סקירה של 10 מערם, הסיפון להגדיר לפני תחילתן של פרוטוקול. הקרוסלה מערם מורכבת מארבע מערם של 10 (מלונות A - D) אשר כל להכיל עשרה חדרים. הסיפון מחזיקה מגוון רחב של האלפים: מטעין עצה, המעבורת מערם, לשטוף את רב-ערוצי עצה ו 13 האלפים סטטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מערם 10 וסיפון להגדיר הדרושים ליצירת ספריית דילול. ארבע מערם של 10 נטענים עם קופסאות AP96 P20 פיפטה טיפים חדרים 1 ו- 6 של מלונות A - D וערימות של ארבעה V 96-ובכן-לוחות החדרים 2-5 וחדרים 7-9 של מלונות א - ד פריסת סיפון מורכב שני מאגרים 300 מ"ל על האלפים P3 סטטית ועל P7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: מערם 10 וסיפון להגדיר עבור הוספת מדיה-זרע תערובת ללוחות הקרנת. 10 מערם טעון עם ארבעה שטוח 96-ובכן-לוחות חדרים 1 ו- 2 של מלון א פריסת סיפון מורכב שני מאגרים 300 מ"ל על P3 האלפים סטטית ועל P7 ואת קופסת AP96 P250 פיפטה טיפים על TL1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: מערם 10 וסיפון להגדיר עבור הוספת מולקולות קטנות ללוחות הקרנת. 10 מערם טעון עם קופסה של AP96 P250 פיפטה טיפים חדר 1, ערימה של שני V 96-ובכן-דילול התחתון צלחות בחדרים 2, 4, 6, ו- 8 וערימה של שני שטוח 96-ובכן-לוחות מלא עם התערובת מדיה-זרע בחדרים 3 , 5, 7, ו-9. פריסת סיפון מורכב שני מאגרים 300 מ"ל על P3 האלפים סטטית ועל P7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה תוכנן כדי לסייע לחוקרים שישותו מסך קדמי גנטיקה כימי על תודרנית. אנו מספקים תוצאות נציג ממסך של תרכובות 50,000 (איור 2 , איור 3), באחד המסכים הקדמיים גנטיקה כימי הגדול ביותר לבצע תודרנית עד כה9,13,23. השימוש של רובוט טיפול בנוזלים מופעלת ספריית דילול יעיל יותר, הקרנת ספריית הדור, לשפר את המהירות והיעילות של זיהוי של תרכובות הרומן. הגדלת הקיבולת למסך בטבע תפוקה גבוהה לווה על ידי הפחתת העבודה מטעם החוקר. טכניקה זו נועדה לשמש עם צלחות 96-ובכן, אשר יכול להכיל זרעים קטנים או צמחים לעין תחת מיקרוסקופ ויבתר. ניצול צלחות עם בארות גדול יותר כדי להתאים זרעים גדולים יותר ידרוש שינויים התפוקה ואת העיצוב.
מגבלות נוספות של טכניקה זו כוללים את הקושי של קטע זה של ציוד באמצעות טכניקות aseptic; עם זאת, אנו לא נתקלים אחוזים גבוהים של זיהום עקב ½ MS מדיה חסר סוכרוז. אחד יכול לעקוף כל נושא זיהום על-ידי הצבת הרובוט בחדר סטרילי, ומאפשר בתנאים סטריליים, תרבית תאים, או באמצעות רובוט טיפול בנוזלים24,קאמרית סטרילי25. מגבלה נוספת היא גודל קצה זרע השאיפה. טיפ קטן פיפטה כגון P20 AP96 למה עם זרעים; לכן, יש להשתמש טיפ פיפטה גדול יותר עבור זרע dispensing ולערבב פתרון.
שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה כוללות תיוג זהיר של כל לוחות דילול ספריית ובספרייה ההקרנה, להבטיח שהם הם הכיוון הנכון יחד עם סדר הנכון כאשר מאכילים את הרובוט. נקה תיוג, עיבוד שיטתי היא פשוטה, ניתן להתגבר על בעיה זו. עוד צעד קריטי זה להבטיח כי הציוד הנכון הוא במקום הנכון לפני תחילת הניסוי, במרחק של 10 מערם והן על הסיפון. אם הציוד אינם ממוקמים כראוי על הסיפון, µL 200 96-ערוץ הראש עלול לקרוס, נזק לכלי, הדורשים תחזוקה. עוד צעד קריטי זה להבטיח כי הכמות המדוייקת של נוזל ממוקם בתוך המאגרים 300 מ"ל, כמות זו מוזנים כראוי לתוך התוכנה. אם המספרים אינם תואמים, העצות לא יגיע הנוזל, השאיפה לא יתרחש.
יש גם צורך לנקוט צעדים כדי להבטיח כי התוצאות המתקבלות הן מדויקות. שגיאה אחת הבחנו תוך פיתוח הפרוטוקול היה קשור לתת טיפ לחיים. לאחר רצופים העמסה ופריקה, הטיפים מאבדות את יכולתן מחוק לגמרי, מדבקות/ברקודים באופן מדויק. לכן זה הכרחי כי כל קבוצה של 96 טיפים משמש היותר ארבע פעמים. זה חשוב גם להחליף את המים לשטוף באופן קבוע כדי למנוע את האפשרות כימיקלים בשוגג להוסיף הקרנת לוחות. לבסוף, כימיקלים מסוימים יש נטייה לזרז מתוך פתרון26. כדי להבטיח שכל חומר כימי נוסף על הריכוז הנכון, צעדים ערבוב משולבים דילול של פרוטוקול הקרנה. יכול לגרום לכשל לערבב בכמויות נמוכות של כימיקלים להיות פנוטיפים התווספו הספריה לספריה, מאתגר פרשנות של פוטנציאל כימי המושרה.
באמצעות הלוחות הנכון עבור כל חלק של הפרוטוקול זה גם חשוב מאוד. לוחות V נועדו להבטיח כרכים קטנים של נוזל יכול להיות aspirated מומלצים לשימוש ביצירת ספריית דילול. עם זאת, הצלחות האלה אינם מתאימים עבור חלק ההקרנה של הפרוטוקול, מאז שלהם השתקפות האור שמוביל המסכן ויזואליזציה של פנוטיפים. על מנת לצפות על הפנוטיפים של 3-4 ימים שתילי העתיקה, המסך צריך להתבצע בתוך צלחות שטוח התחתונה.
ברגע שנוצרו הלוחות ההקרנה, ויזואליזציה נדרש. צלחות 96-ובכן שטוח התחתונה מאפשרים להדמיה בקלות תחת מיקרוסקופ לנתח. זה הכרחי כי הלוחות מאוחסנים במכולות לייבוש-הוכחה כדי להפחית האידוי של התקשורת. אלטרנטיבה מיקרוסקופיים ויזואליזציה היא באמצעות סורק ברזולוציה גבוהה. תמונות שמפיקים ברזולוציה גבוהה לחשוף את רוב הפנוטיפים שנצפתה מסך זה ולספק ארכיון של התוצאות וניתן לחזור בעתיד. ברגע ויזואליזציה הושלם, והוקרן הספרייה של הבחירה שלך, יכול בשיטה זו לאחר מכן להתבצע על אורגניזמים שונים או עם ספרייה כימיים שונים. שינויים הציוד עלולה לאפשר לתרבות סטרילי, ומאפשר מיזמים לתוך העולמות של תאי גזע, פטריות, חרקים, מפעלים קטנים2,18,25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים Jozsef החסידה, מיטשל ריצ'מונד, לג'רד Gollihue, אנדריאה סאנצ'ס לדיון ביקורתי ובונה. ד ר פרי Sharyn עבור הצילומים פנוטיפי. חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת שיתופית הסכם מס 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
