Summary
En høy gjennomstrømning skjermen av syntetiske små molekyler ble utført på modellen plantearter, Arabidopsis thaliana. Denne protokollen, utviklet for en flytende håndtering robot, øker hastigheten på fremover kjemiske genetikk skjermer, akselerere oppdagelsen av romanen små molekyler påvirker Fræna.
Abstract
Kjemisk genetikk blir stadig brukt for å dekode trekk i planter som kan gjenstridige til tradisjonelle genetikk på grunn av genet redundans eller dødelighet. Imidlertid er sannsynligheten for et syntetisk lite molekyl blir bioaktive lav; Derfor må tusenvis av molekyler testes for å finne de av interesse. Væske håndtering robotikk systemer er utformet for å håndtere store mengder av prøver, øke hastigheten som et kjemisk bibliotek kan bli vist i tillegg til minimere/standardisere feil. Å oppnå en høy gjennomstrømming frem kjemiske genetikk skjerm av et bibliotek over 50.000 små molekyler på Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protokoller med en benk toppen flerkanals flytende håndtering robot ble utviklet som krever minimal tekniker engasjement. Med disse protokollene ble 3,271 små molekyler oppdaget som forårsaket synlig fenotypiske endringer. 1,563 forbindelser indusert kort røtter, 1,148 forbindelser endret farge, 383 forbindelser forårsaket roten håret og andre, ikke-kategorisert, endringer og 177 forbindelser som hemmet spiring.
Introduction
I de siste 20 årene har forskere innen anlegget biologi gjort store fremskritt med kjemiske genetikk tilnærminger, både forover og bakover, forbedre vår forståelse av cytoskjelett, hormon biosyntesen cellevegg biosyntesen og signalnettverk, gravitropism, patogenesen, purine biosyntesen og endomembrane handel1,2,3,4,5. Bruke frem kjemiske genetikk teknikker kan identifikasjon av fenotyper rundt og tillater forskere til å forstå genotypic grunnlaget for bestemte prosesser. Omvendt søker omvendt kjemiske genetikk ut kjemikalier som samhandler med en forhåndsbestemt protein målet6. Arabidopsis har vært i forkant av disse funnene i anlegget biologi fordi dens Genova er liten, tilordnet og kommentert. Den har en kort generasjonstid, og det er flere mutant/reporter linjer tilgjengelig for å lette identifikasjon av avvikende subcellular maskiner7.
Det er to store flaskehalser som treg fremdriften frem kjemiske genetisk skjermer, første sortering og bestemme målet for sammensatt interesse8. En stor hjelp i å øke hastigheten på små molekyl utvalg er bruk av automatisering og automatisert utstyr9. Flytende håndtering roboter er et utmerket verktøy for håndtering av store biblioteker av små molekyler og har vært medvirkende i å drive fremgang i biologi10. Protokollen presenteres her er utviklet for å lindre flaskehalsen tilknyttet utvelgelsesprosedyren, aktivere identifikasjon av bioaktive små molekyler i et hurtig tempo. Denne teknikken reduserer byrden av arbeid og tid på vegne av operatøren også svært økonomiske kostnadene prinsippet etterforskeren.
Så langt har de fleste kjemiske biblioteker analysert holdt mellom 10 000 og 20 000 forbindelser, noen med som 150.000 og noen med så få som 709,11,12,13,14, 15 , 16. protokollen innført her ble gjennomført på en lite molekyl bibliotek av 50.000 forbindelser (se Tabell for materiale), en av de større frem kjemiske genetikk skjermer gjennomført på Arabidopsis hittil. Denne protokollen passer med den nåværende trenden mot økt effektivitet og hurtighet om fremover kjemiske genetikk, spesielt som gjelder ugressmiddel discovery, discovery av insektmiddel, soppdreper oppdage, funn, og kreft biologi17 ,18,19,20,21. Men implementert her med Arabidopsis, kan denne protokollen, lett bli tilpasset cellekulturer, sporer og potensielt selv insekter i flytende medium i 96-, 384- eller 1536-og plater. Liten størrelse er Arabidopsis mottakelig for screening i 96 bra plater. Distribuere frø jevnt blant brønner er imidlertid en utfordring. Hånd seeding er nøyaktig, men arbeidskrevende, og om det er enheter som er utformet til å dispensere frø i 96-brønnen platene, de er dyre å kjøpe. Her viser vi hvordan dette trinnet kan omgås med bare et lite tap i nøyaktighet.
Det overordnede målet med denne metoden var å gjøre screening et stort kjemiske bibliotek mot Arabidopsis mer håndterlig, uten at nøyaktighet, via bruk av en flytende håndtering robot. Bruk av denne metoden forbedrer effektiviteten av forskeren ved å redusere tiden det tar å fullføre første fortynning serien ledelse og påfølgende fenotypiske skjermer, slik at rask visualisering av prøvene under dissecting mikroskop, og rask Identifikasjon av romanen bioaktive små molekyler. Figur 1 viser denne protokollen tasten resultater i 4 trinn.
Figur 1: generelle arbeidsflyten av skjermbildet frem kjemiske genetikk. En oversikt over protokollen for å beskrives med noen detaljer for hver av de 4 viktigste trinnene. 1: motta kjemiske biblioteket, 2: gjør fortynning biblioteket, 3: gjør Screening platene og 4: rugende og visualisere Screening platene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opprette en fortynning bibliotek
- Etiketten 625 fortynning biblioteket plater for hånd, sikre at de samsvarer med deres tilsvarende platen fra kjemiske biblioteket. I tillegg koble i flyt og ut flyt slanger til multikanal tips vask automatisert Labware Positioner (ALP) ved å føre dem gjennom konsollen stasjonen til 5 Gallon reservoaret (se Tabell for materiale).
- Få tilgang til datamaskinen, og slå på vask pumpen gjennom tilkobling av enheten kontrolleren til multikanal tips vask ALP for å sirkulere vann. Dette vil slå av automatisk på slutten av protokollen.
- Belastning, knyttet for hånd, de magasin 10 til Stacker karusellen, i følgende rekkefølge Hotell A - D (Figur 4, magasin); en boks med AP96 P20 Pipette-spisser i rommet 1, fire 96-brønns V-bunnplater i rom 2-5 med to øvre platene som inneholder lager konsentrasjoner bestilte biblioteket og de to nederste platene tom (figur 5, magasin). I tillegg laster en boks med AP96 P20 Pipette-spisser i rommet 6 og fire 96-brønns V-bunnplater i rom 7-9 med de to øverste platene som inneholder lager konsentrasjoner av bestilte biblioteket og de to nederste platene tom (figur 5, magasin).
- Satt opp, for hånd, dekk med en 300 mL vann reservoaret på P3, 300 mL 70% EtOH badekar på P7, tips Loader ALP (TL1) og flerkanals tips vask ALP (TW1) (Figur 4, dekk og figur 5, dekk).
- Bruker operativsystemet programvare, presentere AP96 P20 Pipette-spisser fra magasin 10 og flytte dem til tips Loader ALP.
Merk: 1,5 gjennom 1.12 alle gjøres med væsken robotens operativsystem programvare; se Tabellen for materiale. - Presentere rom 2 fra Hotel A og skille alle fire 96-brønns V-bunn plater på dekk, plassere nederst to på P4 og P8 og de to P5 og P9 (Figur 4).
- Last AP96 P20 Pipette-spisser med tips Loader ALP på 96-kanal 200 µL hodet. Sug opp 90 µL fra 300 mL vann reservoaret og dispensere i 96-brønnen V-fortynning bunnplaten på P4. Gjenta dette trinnet for plate P8.
- Bland kjemiske biblioteket plate P5 ved gjentagelser aspirating og dispensing 15 µL tre ganger. Dessuten Sug opp 10 µL fra kjemiske biblioteket plate P5 og dispensere 10 µL i fortynning plate P4.
- Bland løsninger plate P4 ved gjentagelser aspirating og dispensing 50 µL totalt tre ganger. Når blandet, rene AP96 P20 Pipette-spisser av aspirating og dispensing 70 µL av 70% EtOH fra P7, deretter vaske dem i multikanal tips vask ALPENES aspirating og dispensing en 110% mengde vann fire ganger.
- Gjenta trinn 1.8-1.9 for sekundet par av plater på P8 og P9. Når du oppretter andre 96-brønns V-bunnplaten fortynning, bunke plater i følgende rekkefølge fra bunn til topp: P9, P5, P8 og P4. Deretter plassere stabelen på en tom statisk ALP; enten P1, P2, P6, P10, P11, P12 eller P13.
- Gjenta trinn 1.6-1.10 til rom 5 i Hotel A er tom. Gjenta trinn 1.5 nå Room 6, flytte nye AP96 P20 Pipette Tips til tips Loader ALP og plassere den brukte AP96 P20 Pipette-spisser på en tom statisk ALP.
- Gjenta trinn 1.6-1.10 til rom 9 av Hotel A er tom. Men for å fortsette til Hotel B, må plater og tips på dekk lastes inn Hotel A.
- Å fylle for hånd, 300 mL vann reservoaret. Dette trinnet er avgjørende, og programmet kan innlemme en pause detaljering denne meldingen, som krever at brukeren "continue", før du utfører neste trinn.
- Gjenta trinn 1.5-1.13 for de gjenværende hotellene, sikrer en hele 300 mL vann reservoaret hver gang før du fortsetter til neste hotellet.
2. legge til Media-frø blanding til sortering plater
- ½ Murashige og Skoog (MS) Media med 0,1% Agar ved tilsetning av 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1.0 g Agar 1 L DI H2O. justere pH til 5.7 skjønt tillegg av 5 M kaliumhydroksid mens overvåking med en pH-sonde.
- Sterilisere frø ved å riste dem i 1% blekemiddel og SDS mellom 15 og 30 minutter, og skyll 4 ganger med en lik mengde vann med sentrifugering. Når frø er sterilt, plasserer du dem i 4 ° C fra 24 timer til 7 dager for vernilization. Arabidopsis biologiske Resource Center beskriver flere metoder for sterilisering, vernilization og vekst22.
- Legge frø til media for hånd på en tetthet på 0,1 g/100 mL. Denne tetthet gir et gjennomsnitt på 3-10 frø per brønn av en 96-brønns plate.
- Sted, hånd, fire 96-brønns Flat-bunnplater i rom 1 og 2 av hotellet (figur 6, Hotel A). Plasser en boks med AP96 P250 Pipette Tips om tips Loader ALP en 300 mL reservoaret fylt med media-frø blandingen opprettet i trinnene 2.1-2.3 på P3 og et 300 mL reservoar fylt med 70% EtOH på P7 (Figur 4, dekk og figur 6 Dekk).
Merk: 2,5 gjennom 2.8 er ferdig med operativsystemet programvare. - Presentere rom 1 og 2 i Hotel, og skille stabler av fire plater. Sett en plate på hver av de tomme statiske Alpene (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 og P12). Last AP96 P250 Pipette-spisser på 96-kanal 200 µL hodet.
- Sug opp 90 µL fra 300 mL media-frø reservoaret på P3 og støte inn i første 96-brønns leiligheten-bunnplaten. Gjenta denne prosessen til alle åtte plater inneholder medier-frø blandingen.
- Rengjør AP96 P250 Pipette-spisser ved aspirating og dispensing 70 µL fra 300 mL reservoaret fylt med 70% EtOH på P7. Vaske tips i multikanal tips vaske ALP av aspirating og dispensing en 110% mengde vann fire ganger, losse tips på TL1 og samle platene for hånd.
3. tilføyer små molekyler til sortering plater
- Belastning, for hånd, en boks med AP96 P250 Pipette-spisser i rommet 1 Hotel A, to 96-brønns V-bunnplater fortynning biblioteket i rom 2, 4, 6 og 8 og to 96 godt Flat-Screening bunnplater i rom 3, 5, 7 og 9 (Figur 4 Magasin og figur 7, Hotel A). I tillegg koble slanger til og fra multikanal tips vask ALP til 5 Gallon reservoaret.
Merk: 3.2 gjennom 3.10 er ferdig med operativsystemet programvare. - Konfigurere dekk inneholder en 300 mL 70% EtOH vask reservoaret på P7; media-frø reservoaret kan stå på dekk på P3 (Figur 4, dekk og figur 7dekk). I tillegg slå på konsollen stasjonen via tilkoblingen av enheten kontrolleren å sirkulere vann gjennom multikanal tips vask ALP. Dette vil slå av automatisk på slutten av protokollen.
- Presentere AP96 P250 Pipette tips boksen fra Hotel A og flytte den til tips Loader ALP.
- Presentere 96-brønns V-fortynning biblioteket bunnplater rom 2 av hotellet A dekk og sted en statisk ALP P4 og på P8. Presentere 96-brønns Flat-Screening bunnplater fra rom 3 av Hotel A til dekk og plassere på statisk ALP P5 og på P9.
- Last AP96 P250 Pipette-spisser med tips Loader ALP på 96-kanal 200 µL hodet.
- Bland 96-brønns V-fortynning bunnplaten på P4 av aspirating og dispensing 50 µL tre ganger. Etter at Sug opp 10 µL fra denne platen og støte inn i 96-brønnen leiligheten-Screening bunnplaten på P5.
- Bland løsningene i platen på P5 ved aspirating og dispensing 50 µL tre ganger. Rengjør AP96 P250 Pipette-spisser med etanol ved aspirating og dispensing 70 µL av 70% EtOH fra reservoaret på P7 og deretter vaske tipsene i multikanal tips vask ALPENES aspirating og dispensing en 110% mengde vann fire ganger.
- Gjenta trinn 3.5 og 3.6 for andre 96-brønns V-fortynning biblioteket bunnplaten (P8) og 96-brønns Flat-Screening bunnplaten (P9).
- Stabel to 96-brønns V-bunnplater fortynning bibliotek sammen og de to 96-brønns Flat bunn Screening platene sammen. Flytte platene til statisk Alpene P1, P2, P6, P10, P11, P12 eller P13.
- Gjenta trinn 3.4-3.9 tre ganger, å legge utvannet kjemikalier til screening plater totalt åtte ganger. Til slutt, sjekk antall frø i hver brønn av screening platene gjennom visuelle konformasjon og supplere disse brønner med færre enn tre frø av ekstra sterilisert og vernalized frø.
4. inkubasjon og visualisering av Screening plater
- Inkuber 96-brønns Flat-Bottom Screening platene i fire dager i en miljømessig kammer på 22 ° C på en 16/8 lys/mørke syklus i uttørking bevis beholder. Visualisere 96-brønns Flat-Bottom Screening platene under dissecting mikroskop. Registrere alle avvikende fenotyper for videre etterforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til å nøyaktig og effektivt karakterisere fenotyper basert på tillegg av små molekyler på screening konsentrasjoner under dissecting mikroskop er målet med denne metoden for fremover kjemiske genetikk på Arabidopsis. Av fenotyper observert når alle 50.000 forbindelser hadde vist var forskjellige og kan deles inn i flere forskjellige klasser (figur 2). Figur 3A -F viser eksempler på fenotyper som ble observert ved lav forstørrelse under dissecting mikroskop. Noen fenotyper gitt svar (Figur 3 g, H). Disse måtte testes i lave konsentrasjoner slik at kjemiske ikke gi en annen fenotypen på en lavere dose.
Dårlige resultater kan oppstå av mange grunner. En er dårlig spiring priser av frø. Dette kan forårsake en screening plate hovedsakelig viser ingen spiring eller ufullstendig spiring fenotyper (Figur 3 g, H), som kan være misvisende. For å overvinne dette, pre-test spiring priser for alle frø brukes. Når spiring priser er etablert og er større enn 95% for Arabidopsis, er vernalization av frø før kjemiske tillegg et viktig skritt sikre samtidige spiring. Mangel på samtidige spiring kan føre til falske positiver i phenotyping. I tillegg kan dårlige resultater oppstå hvis media kan fordampe under inkubasjon. Denne mangelen på fuktighet forhindrer frø spirende og kan unngås ved hjelp av uttørking-bevis beholdere. Dessuten DMSO og media er i kolonnene for to eksterne av hver plate, sikre riktig mikro klima og spiring priser er oppnådd.
Tilfredsstillende eksperimentelle resultater oppnår når spiring priser er > 95%, frø er vernalized før tillegg i 96-brønnen flat bunn plater, sikre samtidige spiring, og media ikke fordampe under inkubasjon. Ideelt sett kjemikalier skal testes i en konsentrasjon som lar alle frøene til å spire og fenotyper skal vurderes nøyaktig (figur 3A-F). Fleste behandlinger produsert seedlings med fenotyper som var visuelt skille fra narr kontroller med ingen morfologiske fenotyper (figur 3A), med det store flertallet av avvikende fenotyper bestående av bleket og sterkt forkrøplet røtter (figur 2).
Figur 2: de vanligste fenotyper observert og andelen av hver fenotypen observert. A) totalt 3,271 små molekyler ble funnet for å være bioaktive på 100 µM etter fire dager med inkubasjon. Fargen angir alvorlighetsgraden av fenotypen (svart = mer alvorlig, hvit = mindre alvorlig). De vanligste observert fenotypen gjaldt rot morfologi, med mer enn 1500 forbindelser inducing forkrøplet røtter av ulik alvorlighetsgrad. Farge var også ofte påvirket av forbindelsene i dette biblioteket, av 1,148 registrert som helt bleket eller delvis misfarget. Like under 400 forbindelser produsert karakteristiske roten håret fenotyper-enten forkrøplet eller både forkrøplet og fargerike. Endelig var spiring påvirket av like under 200 forbindelser. I disse tilfellene frø enten fullførte ikke spiring eller selv begynner ikke å spire. B) seedlings viser unormalt i roten morfologi, enten å være forkrøplet eller alvorlig forkrøplet, utgjorde nesten halvparten av alle svært avvikende frøplanter. Den neste største gruppen var de som resulterte i bleket eller misfarget frøplanter. Fenotyper som gjaldt roten håret unormalt også laget en betydelig del mens hemming av spiring, enten ingen spiring eller ufullstendig spiring, oppstod bare en liten prosentandel av alle bioaktive forbindelser. Til slutt var det en rekke fenotyper som skjedde med slik en lav frekvens, ble de gruppert inn i kategorien 'andre', et eksempel var produksjonen av grønne mucilage, sett i Figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilder av representant fenotyper observert under skjermbildet frem kjemiske genetikk. Ingen synlige morfologiske avvik (A), brun rot hår (B) forkrøplet root (C), alvorlig forkrøplet root (D), bleket (E), grønn mucilage (F), ufullstendig spiring (G) og ingen spiring (H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: oversikt over Stacker 10 og dekk satt opp før innvielsen av protokollen. Stacker karusellen består av fire Truck 10's (Hotell A - D) som hver plass 10 rom. Dekk har en rekke Alpene: tips Loader, magasin Shuttle, multikanal tips vask og 13 statisk Alpene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: magasin 10 og dekk satt opp nødvendig for å skape en fortynning bibliotek. De fire Truck 10 er lastet med bokser av AP96 P20 Pipette-spisser i rom 1 og 6 av A - D og stabler av fire 96-brønns V-bunnplater i rom 2-5 og rom 7-9 av A - D. Dekk oppsettet består av to 300 mL reservoarer statisk Alpene P3 og P7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: magasin 10 og dekk satt opp for å legge til Media-frø blanding til Screening plater. Stacker-10 er lastet med fire 96-brønns Flat-bunnplater i rom 1 og 2 av Hotel A. Dekk oppsettet består av to 300 mL reservoarer statisk Alpene P3 og P7 og en boks med AP96 P250 Pipette Tips om TL1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: magasin 10 og dekk satt opp for å legge små molekyler til Screening plater. Stacker-10 er lastet med en boks av AP96 P250 Pipette-spisser i rommet 1, en stabel med to 96-brønns V-bunnen fortynning plater i rom 2, 4, 6 og 8 og en stabel med to 96-brønns Flat-bunnplater fylt med media-frø blandingen i rom 3 , 5, 7 og 9. Dekk oppsettet består av to 300 mL reservoarer statisk Alpene P3 og P7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er utformet for å hjelpe forskere med å fullføre en frem kjemiske genetikk skjerm på Arabidopsis. Vi gir representant resultater fra en skjerm av 50.000 forbindelser (figur 2 og Figur 3), en av de største fremre kjemiske genetikk skjermene utføres på Arabidopsis hittil9,13,23. Bruk av en flytende håndtering robot aktivert mer effektiv fortynning bibliotek og screening biblioteket generasjon, forbedrer hastigheten og effektiviteten av identifikasjon av romanen forbindelser. Øke kapasiteten til skjermen i en høy gjennomstrømning natur ble fulgt av synkende arbeid på vegne av forskeren. Denne teknikken ble utviklet for å brukes med 96-brønns plater, som kan romme små frø eller planter synlig under dissecting mikroskop. Utnytte plater med større brønner å passe større frø vil kreve endringer i produksjon og design.
Ytterligere begrensninger av denne teknikken inkluderer problemer med å bruke denne utstyrsdel med aseptiske teknikker; men fant vi ikke høye prosenter av forurensning på grunn av ½ MS media mangler sukrose. En kunne omgå eventuelle forurensning problemet ved å plassere roboten inne en bakteriefri rom, slik at for sterilt og cellekultur eller bruker en flytende håndtering robot med en bakteriefri kammer24,25. En annen begrensning er størrelsen og frø aspirasjon. En liten pipette tips som AP96 P20 ville tette med frø; Derfor må et større pipette tips brukes for frø dispensing og løsning miksing.
Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere forsiktig merkingen av alle platene i fortynning biblioteket og screening bibliotek, de er i riktig retning med riktig rekkefølge når fôringen roboten. Fjern merking og systematisk er enkelt og kan løse dette problemet. Et annet viktig skritt er å sikre at det riktige utstyret er i riktig sted før du starter eksperimentet, både innenfor de magasin 10 og på dekk. Hvis utstyret ikke er riktig plassert på dekk, 96-kanal 200 µL hodet kan krasje, skade apparatet og krever vedlikehold. Et annet viktig skritt er å sikre at riktig mengde væske er plassert i 300 mL reservoarene og at dette beløpet er skrevet riktig inn i programvaren. Hvis tallene ikke samsvarer, tipsene vil ikke komme væske og aspirasjon skjer ikke.
Det er også nødvendig å ta skritt for å sikre at resultatene er korrekte. Én feil som vi la merke til mens utvikle protokollen var knyttet til tips liv. Etter påfølgende lasting og lossing, mister tips evnen til å Sug opp og dispensere nøyaktig. Det er derfor viktig at hvert sett av 96 tips brukes maksimalt fire ganger. Det er også viktig å endre vaskevann regelmessig for å unngå muligheten for kjemikalier legges utilsiktet til screening plater. Endelig har noen kjemikalier en tendens til å bunnfall ut av løsningen26. For å sikre hver kjemisk legges på riktig konsentrasjonen, er blande trinnene innlemmet i fortynning og screening protokoll. Unnlatelse av å blande kan føre lave mengder kjemikalier blir lagt til fra biblioteket til biblioteket, utfordrende tolkning av potensielle kjemisk indusert fenotyper.
Bruke riktig platene for hver del av protokollen er også svært viktig. V-bunn plater er utformet for å sikre at små mengder væske kan være aspirated og anbefales for bruk i etableringen av fortynning biblioteket. Men er disse platene ikke egnet for screening-delen av protokollen, siden deres refleksjon av lys fører til dårlig visualisering av fenotyper. For å observere av fenotyper i 3-4 dagers gammel frøplanter, må skjermen utføres i flat bunn plater.
Når screening platene er opprettet, er visualisering nødvendig. 96-brønns flat bunn plater tillate lett visualisering under dissekere mikroskop. Det er viktig at platene er lagret i uttørking-bevis beholdere for å redusere fordampning av media. Et alternativ til mikroskopiske visualisering bruker en høyoppløselig skanner. Bildene produsert med høy oppløsning avsløre fleste av fenotyper i skjermen og gi et arkiv over resultater som kan bli revisited i fremtiden. Når visualisering er fullført, og biblioteket du ønsker vist, kan denne metoden deretter utføres på ulike organismer eller med et annet kjemiske bibliotek. Endringer på utstyret kan tillate steril kultur, slik at ventures i riker stamceller, sopp, insekter og planter2,18,25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue og Andrea Sanchez for konstruktiv og kritisk diskusjon. Dr. Sharyn Perry for fenotypiske fotografiene. Dette materialet er basert på arbeid støttes av National Science Foundation under samarbeidende avtalen nr. 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
