Summary
En hög genomströmning skärm av syntetiska små molekyler utfördes på den modell växtart, Arabidopsis thaliana. Detta protokoll, som utvecklats för en vätskehantering robot, ökar hastigheten på framåt kemisk genetik skärmar, accelererande upptäckten av nya små molekyler som påverkar växtfysiologi.
Abstract
Kemisk genetik används alltmer att avkoda egenskaper i växter som kan vara motsträviga till traditionella genetik på grund av genen redundans eller dödlighet. Sannolikheten för en syntetisk liten molekyl är bioaktiva är dock låg; Därför måste tusentals molekyler testas för att hitta de av intresse. Vätskehantering robotics system är utformade för att hantera ett stort antal prover, öka hastigheten med vilken ett kemiskt bibliotek kan säkerhetskontrolleras förutom minimera/standardisera fel. Att uppnå en hög genomströmning framåt kemisk genetik skärm av ett bibliotek av 50.000 små molekyler på Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protokoll med hjälp av en bänk flerkanaliga vätska hantering robot utvecklades som kräver minimal teknikern engagemang. Med dessa protokoll upptäcktes 3.271 små molekyler som orsakat synliga fenotypiska förändringar. 1 563 föreningar inducerad korta rötter, 1 148 föreningar ändras färgläggningen, 383 föreningar orsakade rot hår och andra, icke-Kategoriserad, förändringar och 177 föreningar hämmade grobarhet.
Introduction
Under de senaste 20 åren har forskare inom växtbiologi gjort stora framsteg med kemisk genetik metoder, både framåt och bakåt, förbättra vår förståelse av växtcellväggar, cytoskelettet, hormon biosyntes och signalering, gravitropism, patogenes, purin biosyntes och endomembrane människohandel1,2,3,4,5. Anställa framåt kemisk genetik tekniker möjliggör identifiering av fenotyper av intresse och tillåter forskare att förstå den genotypiska underbyggnaden för särskilda processer. Omvänt, omvänd kemisk genetik söker upp kemikalier som samverkar med en förutbestämd protein mål6. Arabidopsis har varit i spetsen för dessa upptäckter i växtbiologi eftersom dess genomet är små, mappas, och kommenterade. Den har en kort generationstid, och det finns flera mutant/reporter rader tillgängliga för att underlätta identifiering av avvikande subcellulär maskiner7.
Det finns två större flaskhalsar som bromsa utvecklingen av framåt kemiska genetiska skärmar, inledande screening process och att fastställa målet för sammansatta av intresse8. Ett större stöd i öka hastigheten på liten molekyl urval är användning av automation och automatiserad utrustning9. Vätskehantering robotar är ett utmärkt verktyg för att hantera stora bibliotek med små molekyler och har varit avgörande för körning framsteg i biologiska vetenskaper10. Det protokoll som presenteras här är utformad för att lindra den flaskhals som är associerad med screeningprocessen, möjliggör identifiering av bioaktiva små molekyler i snabb takt. Denna teknik minskar bördan av arbete och tid på uppdrag av operatören samtidigt också minska den ekonomiska kostnaden för principen prövaren.
Hittills har har de flesta kemiska bibliotek analyseras haft mellan 10 000 och 20 000 föreningar, några med så många som 150 000 och några med så få som 709,11,12,13,14, 15 , 16. protokollet infört häri genomfördes på en liten molekyl bibliotek av 50.000 föreningar (se Tabell för material), en av de större framåt kemisk genetiken skärmar bedrivs på Arabidopsis hittills. Detta protokoll passar med den nuvarande trenden mot ökad effektivitet och hastighet angående framåt kemisk genetik, särskilt som den avser herbiciden upptäckten, insektsmedel upptäckten, fungicid Upptäck, drug discovery och cancerbiologi17 ,18,19,20,21. Men genomförs här med Arabidopsis, skulle detta protokoll, lätt kunna anpassas till cellkulturer, sporer och potentiellt även insekter i flytande medium inom 96 - 384- eller 1536 brunnar. På grund av sin ringa storlek är Arabidopsis mottagliga för screening i plattor med 96. Distribuera fröna jämnt mellan brunnar är dock en utmaning. Hand sådd är korrekt men arbetskrävande, och även om det finns anordningar för att fördela frön i 96 brunnar, de är dyra att köpa. Här visar vi hur detta steg kan kringgås med bara en liten förlust i noggrannhet.
Det övergripande målet med denna metod var att göra screening ett stort kemiska bibliotek mot Arabidopsis mer lätthanterligt, utan att kompromissa med noggrannhet, via användning av en vätskehantering robot. Användningen av denna metod förbättrar effektiviteten av forskaren genom att minska den tid det tar att slutföra första spädningen serie ledning och efterföljande fenotypiska skärmar, möjliggör snabb visualisering av prover i dissekera Mikroskop, och snabb identifiering av nya bioaktiva små molekyler. Figur 1 illustrerar detta protokollets viktigaste resultaten i 4 steg.
Figur 1: övergripande arbetsflödet för skärmen framåt kemisk genetik. En översikt av protokollet att beskrivas med några Detaljer för varje 4 viktiga steg. 1: ta emot kemiska biblioteket, 2: att göra utspädning biblioteket, 3: att göra Screening plåtarna och 4: ruvning och visualisera Screening plattorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. skapa en utspädning bibliotek
- Etikett 625 utspädning bibliotek plattor för hand, se till att de matchar deras motsvarande plattan från kemiska biblioteket. Dessutom ansluta i flöde och ut flödet slangar till flerkanals tips tvätta automatiserad Labware lägesställare (ALP) genom att passera dem genom konsolen disken till 5 Gallon reservoar (se Tabell för material).
- Åtkomst till datorn och slå på tvätta pumpen genom anslutning av enheten handkontrollen till flerkanals tips tvätta ALP för att cirkulera vatten. Detta kommer att inaktivera automatiskt i slutet av protokollet.
- Belastning, bifogas för hand, Stacker 10's Stacker karusellen, i följande ordning i hotell A - D (figur 4, Stacker); en låda med AP96 P20 pipettspetsar i rum 1, fyra 96 brunnar V-botten pläterar i rum 2-5 med de två övre plattor som innehåller lager koncentrationer från beställda biblioteket och de två nedersta plattorna Töm (figur 5, Stacker). Dessutom, Fyll en låda med AP96 P20 pipettspetsar i rum 6 och fyra 96 brunnar V-botten pläterar i rum 7-9 med de två övre plattor som innehåller lager koncentrationer av beställda biblioteket och de två nedersta plattorna Töm (figur 5, Stacker).
- Ställa upp, för hand, däcket med en 300 mL vattenreservoar på P3, en 300 mL 70% EtOH bad på P7, spets Loader ALP (TL1) och flerkanaligt tips tvätta ALP (TW1) (figur 4, däck och figur 5, däck).
- Med hjälp av operativa programvara, presentera AP96 P20 pipettspetsar från Stacker 10 och flytta dem till spets Loader ALP.
Obs: 1.5 genom 1.12 alla är klar med den vätskehantering robotens operativsystem; Se Tabell för material. - Presentera Room 2 från Hotel A och separera alla fyra 96 brunnar V-botten pläterar på däck, utsläppande botten två på P4 och P8 och de två översta på P5 och P9 (figur 4).
- Ladda AP96 P20 pipettspetsar med Tip lastaren ALP på 96-kanals 200 µL huvudet. Aspirera 90 µL från 300 mL vatten reservoaren och fördela i 96 brunnar V-utspädning bottenplattan på P4. Upprepa detta steg för plattan på P8.
- Blanda kemiska bibliotek plattan på P5 genom upprepade aspirera och dispensering 15 µL tre gånger. Dessutom aspirera 10 µL från kemiska bibliotek plattan på P5 och fördela 10 µL i utspädning plattan på P4.
- Blanda lösningarna av plattan på P4 genom upprepade aspirera och dispensering 50 µL totalt tre gånger. Väl blandad kan rena det AP96 P20 pipettspetsar av aspirera och dispensering 70 µL av 70% EtOH från P7, sedan tvätta dem i flerkanals tips tvätta ALP av aspirera och dispensering en 110% volym vatten fyra gånger.
- Upprepa steg 1,8-1,9 för det andra paret av plattor på P8 och P9. När du skapar andra 96 brunnar V-utspädning bottenplattan, stack plattorna i följande ordning från botten till toppen: P9, P5, P8 och P4. Sedan placera bunten på en tom statiska ALP; antingen P1, P2, P6, P10, P11, P12 eller P13.
- Upprepa steg 1,6-1.10 tills rum 5 i Hotel A är tom. Upprepa steg 1,5 vid når rum 6, flyttar nya AP96 P20 pipettspetsar till spets Loader ALP och placera de begagnade AP96 P20 pipettspetsar på en tom statiska ALP.
- Upprepa steg 1,6-1.10 tills 9 i rum A är tom. Men för att fortsätta till Hotel B, måste tallrikar och tips på däck laddas in i Hotel A.
- Åter fylla, för hand, 300 mL vatten reservoaren. Detta steg är avgörande, och programmet kan införliva en paus som beskriver detta budskap, att användaren måste slå 'continue', innan du utför nästa steg.
- Upprepa steg 1,5-1.13 för de återstående hotell, säkerställa en full 300 mL vattenreservoar varje gång innan du fortsätter till nästa hotellet.
2. lägga till Media-frö blandning till Screening plattor
- ½ Murashige och Skoog (MS) Media med 0,1% Agar genom tillsats av 4.3 g MS Salts, 0.50 g MES, 1,0 g Agar till 1 L DI H2O. Justera pH till 5,7 dock tillägg av 5 M kaliumhydroxid medan övervakning med en pH-givare.
- Sterilisera frön genom att skaka dem i 1% blekmedel och SDS mellan 15 och 30 min och skölj sedan 4 gånger med en lika volym vatten genom centrifugering. När fröna är steril, placera dem vid 4 ° C från 24 timmar till 7 dagar för vernilization. Arabidopsis biologiska Resource Center beskriver ytterligare metoder för sterilisering, vernilization och tillväxt22.
- Lägg frön till media för hand med en täthet av 0,1 g/100 mL. Denna täthet resulterar i ett genomsnitt av 3-10 frön per väl av en plattan med 96 brunnar.
- Plats, för hand, fyra 96 brunnar platt-botten pläterar i rum 1 och 2 i Hotel A (figur 6, Hotel A). Placera en låda med AP96 P250 pipettspetsar på spets Loader ALP, en 300 mL reservoar fylld med media-utsäde blandningen skapade i steg 2.1-2.3 på P3 och en 300 mL reservoar fylld med 70% EtOH på P7 (figur 4, däck och figur 6 Däck).
Obs: 2.5 genom 2,8 görs med operativa programvara. - Presenterar rum 1 och 2 i Hotel A och separera högarna med fyra plåtar. Placera en plåt på varje tom statiska Alperna (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 och P12). Ladda AP96 P250 pipettspetsar på 96-kanals 200 µL huvudet.
- Aspirera 90 µL från 300 mL media-seed-reservoaren på P3 och fördela i den första platt med 96 brunnar-bottenplattan. Upprepa denna process tills alla åtta plattor innehåller media-utsäde blandningen.
- Rengör den AP96 P250 pipettspetsar genom att aspirera och dispensering 70 µL från reservoaren 300 mL fylld med 70% EtOH på P7. Tvätta tips i flerkanals tips tvätta ALP genom att aspirera och dispensering en 110% volym vatten fyra gånger, lasta tips på TL1 och samla plattorna för hand.
3. lägga till små molekyler till Screening plattor
- Belastning, för hand, en låda med AP96 P250 pipettspetsar in 1 i rum A, två 96 brunnar V-bottenplåtar utspädning bibliotek i rum 2, 4, 6 och 8, och två 96 väl platt-Screening bottenplåtar i rum 3, 5, 7 och 9 (figur 4 Stacker och figur 7, Hotel A). Dessutom ansluta slangarna till och från flerkanals tips tvätta ALP till 5 Gallon reservoar.
Obs: 3.2 genom 3.10 görs med operativa programvara. - Konfigurera på däck för att innehålla en 300 mL 70% EtOH tvätta reservoar på P7; media-utsäde reservoaren kan lämnas på däck på P3 (figur 4, däck och figur 7, däck). Dessutom slå på konsolen disken genom anslutning av enheten handkontrollen att cirkulera vatten genom Multichannel tips tvätta ALP. Detta kommer att inaktivera automatiskt i slutet av protokollet.
- Presentera AP96 P250 pipett tips rutan från Hotel A och flytta den till spets Loader ALP.
- Presentera den 96 brunnar V-utspädning bibliotek bottenplåtar från rum 2 av Hotel A med däck och placera en på statiska ALP P4 och en på P8. Presentera platt med 96 brunnar-Screening bottenplåtar från rum 3 av Hotel A till däck och placera en på statiska ALP P5 och en på P9.
- Ladda AP96 P250 pipettspetsar med Tip lastaren ALP på 96-kanals 200 µL huvudet.
- Blanda 96 brunnar V-utspädning bottenplattan på P4 av aspirera och dispensering 50 µL tre gånger. Efter att aspirera 10 µL från denna platta och fördela i platt med 96 brunnar-Screening bottenplattan på P5.
- Blanda lösningarna i plattan på P5 genom att aspirera och dispensering 50 µL tre gånger. Rengör den AP96 P250 pipettspetsar med etanol genom att aspirera och dispensering 70 µL av 70% EtOH från reservoaren på P7 och sedan tvätta tipsen i flerkanals tips tvätta ALP av aspirera och dispensering en 110% volym av vatten fyra gånger.
- Upprepa steg 3.5 och 3.6 för andra 96 brunnar V-bottenplattan utspädning bibliotek (P8) och 96 brunnar platt-Screening bottenplatta (P9).
- Stack två 96 brunnar V-utspädning bibliotek bottenplåtar grupp och två 96 brunnar platt botten Screening plattorna tillsammans. Flytta plattorna till statiska Alperna P1, P2, P6, P10, P11, P12 och P13.
- Upprepa steg 3,4-3,9 tre gånger, lägga utspädda kemikalier till screening plattor totalt åtta gånger. Slutligen, kolla antalet frön i varje brunn av screening plattorna genom visuella konformation och komplettera dessa brunnar med färre än tre frön av ytterligare steriliseras och vernalized frö.
4. inkubation och visualisering av Screening plattor
- Inkubera 96 brunnar platt-nedersta Screening plattorna i fyra dagar i en klimatkammare vid 22 ° C på en cykel med 16/8 i ljus och mörker i en uttorkning bevis behållare. Visualisera de 96 brunnar platt-Screening bottenplåtar i dissekera Mikroskop. Spela in alla avvikande fenotyper för vidare utredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan att effektivt och noggrant karakterisera fenotyper baserat på tillägg av små molekyler på screening koncentrationer i dissekera Mikroskop är slutmålet av denna metod för framåt kemisk genetik på Arabidopsis. De fenotyper som observerats när alla 50 000 föreningar hade kontrollerats var varierande och kunde brytas i flera olika klasser (figur 2). Figur 3A -F skildrar exempel på fenotyper som observerades vid låg förstoring under dissekera Mikroskop. Vissa fenotyper gav ofullständiga resultat (figur 3 g, H). Dessa hade till testas vid lägre koncentrationer se till att kemikalien inte tillhandahåller ett olika fenotyp vid en lägre dos.
Dåliga resultat kan uppstå av många anledningar. En är dålig grobarhet priser av frön. Detta kan orsaka en screening tallrik att huvudsakligen uppvisar ingen grobarhet eller ofullständig grobarhet fenotyper (figur 3 g, H), vilket kan vara vilseledande. För att övervinna detta, förväg testa grobarheten priser för alla frön används. När grobarhet priser har fastställts, och är större än 95% för Arabidopsis, är vernalization av utsäde före kemiska tillägg ett viktigt steg för att säkerställa samtidig grobarhet. Avsaknaden av samtidiga grobarhet kan leda till falskt positiva i fenotypning. Utöver detta kan dåliga resultat uppstå om media får avdunsta under inkubation. Denna brist på fukt hindrar frön från att spira och kan undvikas genom användning av uttorkning-bevis behållare. Dessutom DMSO och media lösningar är i två externa kolumner i varje tallrik, att säkerställa korrekt mikro klimat och grobarhet priser erhålls.
Tillfredsställande experimentella resultat uppnås när grobarhet priser är > 95%, frön är vernalized före tillägg till 96 brunnar platt-bottenplåtar, säkerställa samtidig grobarhet, och media inte avdunstar under inkubation. Idealiskt, kemikalier skulle testas i en koncentration som gör att alla frön att gro. och fenotyper bedömas noggrant (figur 3A-F). Flesta behandlingar producerade plantor med fenotyper som var visuellt omöjlig att skilja från mock kontroller med inga morfologiska fenotyper (figur 3A), med den stora majoriteten av avvikande fenotyper som består av blekt och allvarligt hämmad rötter (figur 2).
Figur 2: de vanligaste fenotyper som observerats och andelen varje fenotyp observerats. (A) sammanlagt 3.271 små molekyler befanns vara bioaktiva vid 100 µM efter fyra dagars inkubation. Färgen anger svårighetsgraden av fenotypen (svart = svårare, vit = mindre allvarliga). De vanligaste observerade fenotyp avsåg rot morfologi, med mer än 1 500 föreningar inducerande förkrympta rötter av varierande svårighetsgrad. Färgning påverkades också vanligen av föreningar i detta bibliotek, med 1 148 plantor registreras som helt blekt eller delvis missfärgad. Knappt 400 föreningar produceras distinkt rotahåret fenotyper – antingen förkrympta eller båda förkrympta och färgglada. Slutligen, grobarhet påverkades av knappt 200 föreningar. I dessa fall frön antingen slutfördes inte grobarhet eller ens börja inte att gro.. (B) plantor uppvisar avvikelser i roten morfologi, antingen som förkrympta eller allvarligt förkrympta, utgjorde nästan hälften av alla fenotypiskt avvikande plantorna. Den nästa största gruppen var de som resulterade i blekt eller missfärgade plantor. Fenotyper som avsåg rot hår avvikelser gjorde också upp en ansenlig del medan hämning av grobarhet, antingen inga grobarhet eller ofullständig grobarhet, inträffade endast en liten andel av alla bioaktiva föreningar. Slutligen fanns det ett antal fenotyper som inträffade vid sådan en låg frekvens, de grupperades i kategorin 'andra', varav ett exempel var produktionen av gröna algblomningen, ses i figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bilder av representativa fenotyper observerats under skärmen framåt kemisk genetik. Inga synliga morfologiska abnormaliteter (A), brun rothår (B), hämmad root (C), allvarligt förkrympta root (D), blekt (E), grön Mucilago (F), ofullständig grobarhet (G) och ingen groning (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: översikt över Stacker 10 och däck ställa in före inledandet av protokollet. Stacker karusellen består av fyra Stacker 10's (hotell A - D) som varje rymmer tio rum. Däcket håller en mängd Alperna: spets lastaren, Stacker Shuttle, flerkanals spets tvätten och 13 statiska Alperna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Stacker 10 och däck ställa in krävs för att skapa en utspädning bibliotek. De fyra Stacker 10's är laddade med lådor med AP96 P20 pipettspetsar i rum 1 och 6 i hotell A - D och travar av fyra 96 brunnar V-botten pläterar i rum 2-5 och rum 7-9 på hotell A - D. Layouten däck består av två 300 mL reservoarer på statiska Alperna P3 och P7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Stacker 10 och däck in för att lägga till Media-frö blandning till Screening pläterar. Stacker 10 är laddad med fyra 96 brunnar platt-botten pläterar i rum 1 och 2 i Hotel A. Layouten däck består av två 300 mL reservoarer på statiska Alperna P3 och P7 och en låda med AP96 P250 pipettspetsar på TL1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Stacker 10 och däck in för att lägga till småmolekyler till Screening pläterar. Stacker 10 är laddad med en låda med AP96 P250 pipettspetsar i rum 1, en bunt med två 96 brunnar V-botten utspädning plattor i rum 2, 4, 6, och 8 och en bunt med två 96 brunnar platt-bottenplåtar fylld med media-utsäde blandningen i rum 3 , 5, 7 och 9. Layouten däck består av två 300 mL reservoarer på statiska Alperna P3 och P7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll syftar till att hjälpa forskare i att åstadkomma en framåt kemisk genetik skärm på Arabidopsis. Vi tillhandahåller representativa resultat från en skärm av 50.000 föreningar (figur 2 och figur 3), en av de största framtida kemisk genetik skärmarna utförs på Arabidopsis hittills9,13,23. Användning av en vätskehantering robot aktiverat effektivare utspädning bibliotek och screening bibliotek generation, förbättrad hastighet och effektivitet för identifiering av nya föreningar. Öka förmågan att skärmen i en hög genomströmning natur åtföljdes av minskande arbetskraft för forskaren. Denna teknik var avsedd att användas med 96 brunnar pläterar, som rymmer små frön eller plantor synliga under en dissekera Mikroskop. Utnyttja plattor med större brunnar att passa större frön skulle kräva ändringar av genomströmning och design.
Ytterligare begränsningar av denna teknik är svårigheten att med denna del av utrustningen med aseptisk teknik; dock vi inte möter höga procentsatser av förorening på grund av ½ MS media saknar sackaros. Man kunde kringgå någon kontamination problemet genom att placera roboten i ett sterilt rum, gör det möjligt för sterila förhållanden och cellodling eller genom att använda en vätskehantering robot med en steril kammare24,25. En annan begränsning är storlek och utsäde aspiration. En liten pipettspetsen såsom den AP96 P20 skulle täppa med frön; Därför måste en större pipettspetsen användas för utsäde dosering och lösning blandning.
Kritiska steg inom detta protokoll inkluderar noggrann märkning av alla plåtar i den utspädning och screening biblioteket, försäkrar de är i rätt riktning tillsammans med rätt ordning när utfodring roboten. Avmarkera märkning och systematisk bearbetning är okomplicerad och kan övervinna problemet. Ett annat viktigt steg är att säkerställa att rätt utrustning är på rätt plats innan du börjar experimentet, både inom de Stacker 10's och på däck. Om utrustningen inte är korrekt placerad på däck, den 96-kanals 200 µL huvud kunde krascha, skadar instrumentet och kräver underhåll. Ett annat viktigt steg är att säkerställa att rätt mängd vätska placeras inom 300 mL reservoarerna och att detta belopp är korrekt in i programvaran. Om siffrorna inte matchar tips når inte vätskan och aspiration sker inte.
Det är också nödvändigt att vidta åtgärder för att säkerställa att resultaten är korrekta. Ett fel som vi märkte samtidigt utveckla protokollet var knutna till spets liv. Efter successiva lastning och lossning, förlorar tips sin förmåga att aspirera och expediera korrekt. Det är därför viktigt att varje uppsättning 96 tips används högst fyra gånger. Det är också viktigt att ändra tvättvattnet regelbundet för att undvika risken för kemikalier läggas oavsiktligt till screening plattor. Slutligen, vissa kemikalier har en tendens att fällningen av lösning26. För att säkerställa varje kemikalie läggs i rätt koncentration, införlivas blandande steg i utspädnings- och screening protokoll. Underlåtenhet att blanda kan leda till små mängder av kemikalier som tillsats från bibliotek till bibliotek, utmanande tolkning av potentiella kemiska inducerad fenotyper.
Det är också mycket viktigt att använda rätt plattorna för varje del av protokollet. V-botten pläterar är utformade så att små volymer vätska kan vara aspirerade och rekommenderas för användning i skapandet av utspädning biblioteket. Dock är dessa plattor inte lämpliga för screening del av protokollet, eftersom deras reflektion av ljus leder till dålig visualisering av fenotyper. För att observera fenotyperna av 3-4 dag gamla plantor, utföras skärmen i platt-bottenplåtar.
När screening plattorna har skapats, krävs visualisering. 96-väl platt-bottenplåtar tillåter enkel visualisering under dissekera Mikroskop. Det är absolut nödvändigt att plattorna är lagrade i uttorkning-bevis behållare för att minska avdunstningen av media. Ett alternativ till mikroskopiska visualisering använder en högupplöst scanner. Bilder som produceras i hög upplösning avslöja flesta av de fenotyper som observerats i denna skärm och ger ett arkiv av de resultat som kan ses i framtiden. När visualisering är klar, och biblioteket du väljer skärmad, kunde denna metod sedan utföras på olika organismer eller med ett annat kemiska bibliotek. Modifieringar på utrustningen kan möjliggöra för sterila kultur, att låta ventures in på stamceller, svamp, insekter och små växter2,18,25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue och Andrea Sanchez för konstruktiv och kritisk diskussion. Dr. Sharyn Perry för fenotypisk fotograferar. Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation under kooperativa avtal nr 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
