Summary
Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.
Abstract
Chemischer Genetik wird zunehmend Züge in Pflanzen zu entschlüsseln, die widerspenstigen zu traditionellen Genetik durch gen-Redundanz oder Letalität möglicherweise eingesetzt. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit eines synthetischen kleinen Moleküls als bioaktive gering; Daher müssen Tausende von Molekülen getestet werden, um diejenigen von Interesse finden. Liquid handling Roboter Systeme sind entworfen, um große Anzahl von Proben, die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der eine chemische Bibliothek untersucht werden kann, zusätzlich minimieren/Standardisierung Fehler, zu behandeln. Erreichung einen Hochdurchsatz-vorwärts Chemische Genetik-Bildschirm aus einer Bibliothek von 50.000 kleine Moleküle auf Arabidopsis Thaliana (Arabidopsis), Protokolle mit einer Benchtop-Mehrkanal-Flüssigkeit handling-Roboter entwickelt, die minimale erfordern Techniker-Beteiligung. Mit diesen Protokollen wurden 3.271 kleine Moleküle entdeckt, dass sichtbare phänotypische Veränderungen verursacht. 1.563 Verbindungen induziert kurze Wurzeln, 1.148 Verbindungen verändert Färbung, 383 Verbindungen verursacht Wurzelhaare und andere, nicht kategorisiert, Änderungen und 177 Verbindungen gehemmt Keimung.
Introduction
In den vergangenen 20 Jahren haben Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie große Fortschritte mit Hilfe chemischer Genetik Ansätze, sowohl vorwärts als auch rückwärts, gemacht, ein besseres Verständnis der Zellwand Biosynthese, Zellskelett, Hormon-Biosynthese und Signalisierung, Gravitropismus, Pathogenese, Purin-Biosynthese und Endomembrane Handel mit1,2,3,4,5. Einsatz nach vorne Chemische Genetik Techniken ermöglicht die Identifizierung von Phänotypen von Interesse und erlaubt es den Forschern, die genotypischen Grundlagen für bestimmte Prozesse zu verstehen. Im Gegensatz dazu sucht reverse Chemische Genetik Chemikalien, die mit einer vorher festgelegten Protein Ziel6interagieren. Arabidopsis hat an der Spitze dieser Entdeckungen in Pflanzenbiologie, weil sein Genom klein abgebildet und kommentiert. Es hat eine kurze Generationszeit, und es gibt mehrere Mutant/Reporter Zeilen zur Verfügung, um die Identifizierung von aberranten subzelluläre Maschinen7zu erleichtern.
Es gibt zwei große Engpässe, die verlangsamen den Fortschritt der vorwärts chemische genetische Bildschirme, die ersten screening-Prozess und bestimmen das Ziel der Verbindung von Interesse8. Eine große Hilfe bei der Erhöhung der Geschwindigkeit des kleinen Molekül-Auswahl ist die Verwendung von Automatisierung und automatisierte Anlagen9. Liquid Handling-Roboter sind ein hervorragendes Instrument für den Umgang mit großen Bibliotheken von kleinen Molekülen und maßgeblich voran in den biologischen Wissenschaften10gewesen. Die hier vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um den Engpass zugeordneten Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von bioaktiven kleine Moleküle mit einer schnellen Rate. zu lindern Diese Technik verringert die Last der Arbeit und Zeit im Auftrag des Betreibers und auch gleichzeitig die wirtschaftliche Kosten für die Prinzip-Ermittler.
Bisher haben die meisten chemische Bibliotheken analysiert zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, einige mit mehr als 150.000 andere mit nur 709,11,12,13,14, statt. 15 , 16. das Protokoll hier eingeführt wurde auf einer kleinen Molekül-Bibliothek von 50.000 Verbindungen (siehe Tabelle der Materialien) umgesetzt, die größeren vorwärts Chemische Genetik Bildschirme durchgeführt auf Arabidopsis bis heute. Dieses Protokoll passt mit dem aktuellen Trend zu mehr Effizienz und Geschwindigkeit betreffend vorwärts Chemische Genetik, zumal es bezieht sich auf Fungizid, Herbizid Entdeckung, Insektizid Entdeckung entdecken, drug Discovery und Krebsbiologie17 ,18,19,20,21. Obwohl hier mit Arabidopsis implementiert, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden Zellkulturen, Sporen und möglicherweise sogar Insekten im flüssigen Medium innerhalb 96, 384 oder 1536-Well Platten. Aufgrund seiner geringen Größe ist Arabidopsis zugänglicher Screening in 96-well-Platten. Verteilung von Saatgut gleichmäßig auf alle Brunnen ist jedoch eine Herausforderung. Aussaat von Hand genau, aber arbeitsintensiv ist, und zwar gibt es Geräte, die Samen in 96-Well Platten zu verzichten, sie sind teuer in der Anschaffung. Hier zeigen wir, wie dieser Schritt mit nur einem kleinen Verlust an Genauigkeit umgangen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode war eine große chemische Bibliothek gegen Arabidopsis mehr überschaubar, ohne Kompromisse bei der Genauigkeit, über die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter screening zu machen. Die Verwendung dieser Methode verbessert die Effizienz des Forschers durch verringern den Zeitaufwand für die anfängliche Verdünnung Serie Management und nachfolgenden phänotypischen Bildschirmen ermöglicht schnelle Visualisierung der Proben unter dem sezierenden Mikroskop und schnelle Runden Identifizierung neuer bioaktiver kleiner Moleküle. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses Protokolls in 4 Schritten.
Abbildung 1: allgemeine Workflow des Bildschirms nach vorne Chemische Genetik. Einen Überblick über das Protokoll für jedes der 4 wichtigsten Schritte mit einigen Details beschrieben werden. 1: Erhalt der chemischen Bibliothek, 2: die Verdünnung Bibliothek, 3: macht die Screening-Platten und 4: Inkubation und Visualisierung der Screening-Platten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Protocol
1. Erstellen einer Verdünnung-Bibliothek
- Beschriften Sie 625 Verdünnung Bibliothek Platten von hand um sicherzustellen, dass sie auf die entsprechende Platte aus der chemischen Bibliothek übereinstimmen. Darüber hinaus verbinden im Fluss und Schläuchen, die Multichannel-Tipp Wash automatisiert Labware Positionierer (ALP) indem sie durch das Laufwerk der Konsole an den 5-Gallonen-Behälter (siehe Tabelle der Materialien).
- Auf zugreifen Sie den Computer und die Waschpumpe durch die Verbindung von der Gerätesteuerung bis zur Multichannel-Tipp Wash ALP schalten Sie ein, damit Wasser zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.
- Last, befestigt mit der Hand, den Stapler 10 zum Stapler-Karussell in der folgenden Reihenfolge in Hotels A - D (Abbildung 4, Stapler); eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Saal 1, vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 2-5 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen aus der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler). Darüber hinaus laden eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum 6 und vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 7-9 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler).
- Eingestellt von hand, bis das Deck mit einer 300 mL Wasser-Reservoir auf P3, 300 mL 70 % EtOH Badewanne auf P7, Tipp Loader ALP (TL1) und Mehrkanal-Tipp Wash ALP (TW1) (Abbildung 4und Abbildung 5, Deck Deck).
- Mit der Betriebssoftware, präsentieren Sie AP96 P20 Pipettenspitzen aus den Stapler 10 und verschieben Sie sie in die Tipp-Loader-ALP.
Hinweis: 1,5 bis 1.12 alle sind mit der Flüssigkeit, die Handhabung des Roboters Betriebssoftware durchgeführt; siehe Tabelle der Materialien. - 2 Zimmer von Hotel A zu präsentieren und trennen Sie alle vier 96-Well-V-Boden Platten auf dem Deck, Platzierung der Unterseite zwei auf P4 und P8 und die beiden oberen auf P5 und P9 (Abbildung 4).
- Laden Sie AP96 P20 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf. Aspirieren 90 µL aus 300 mL Wasser-Reservoir und verzichten in der 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Platte auf P8.
- Mischen Sie die chemische Bibliothek Platte auf P5 wiederholt Absaugen und 15 µL dreimal. Darüber hinaus Aspirieren Sie 10 µL aus der chemischen Bibliothek Platte auf P5 und verzichten Sie 10 µL in die Verdünnung Platte auf P4 zu.
- Mischen Sie den Lösungen der Platte auf P4 wiederholt Absaugen und 50 µL insgesamt drei Mal. Einmal gemischt, saubere Zeiten der AP96 P20 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH von P7, dann waschen in der Multichannel-Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine Volumen von 110 % des Wassers vier.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,9 für das zweite paar Platten auf P8 und P9. Beim Erstellen der zweiten 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte, Stapel die Platten in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben: P4, P9, P5 und P8. Legen Sie den Stapel auf einem leeren statischen ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis 5 Zimmer im Hotel A leer ist. Wiederholen Sie Schritt 1.5 auf Raum 6 erreichen, Umzug neue AP96 P20 Pipettenspitzen in der Tipp-Loader-ALP und Platzierung der verwendeten AP96 P20 Pipettenspitzen auf einer leeren statischen Alm.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis Zimmer 9 Hotels A leer ist. Jedoch müssen um zur Hotel B zu gelangen, die Platten und Tipps auf dem Deck in Hotel A. zurückgeladen werden
- Nachfüllen Sie, Handarbeit, 300 mL Wasser-Reservoir. Dieser Schritt ist entscheidend, und das Computerprogramm übernehmen eine Pause über diese Nachricht, dass der Benutzer drücken Sie "weiter", vor dem nächsten Schritt fort.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1.13 für die restlichen Hotels, gewährleistet eine volle 300 mL Wasser-Reservoir jedes Mal vor dem Fortfahren zum nächsten Hotel.
2. Hinzufügen von Medien-Saatgut-Mischung zu Platten Screening
- ½ Murashige und Skoog (MS) Medien machen mit 0,1 % Agar durch Zugabe von 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar, 1 L DI H2O. einstellen den pH-Wert 5,7 aber die Zugabe von 5 M Kaliumhydroxid während der Überwachung mit einer pH-Elektrode.
- Sterilisieren Sie Samen durch Schütteln sie in 1 % Bleichmittel und SDS zwischen 15 und 30 min., und spülen Sie dann 4 mal mit einem gleichen Volumen Wasser durch Zentrifugation. Sobald die Samen steril sind, legen Sie sie bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, 7 Tage für Vernilization. Das Arabidopsis Biological Resource Center beschreibt zusätzliche Methoden der Sterilisation, Vernilization und Wachstum22.
- Fügen Sie Samen auf Medien von hand bei einer Dichte von 0,1 g/100 mL. Diese Dichte führt zu einem Durchschnitt von 3-10 Samen pro Bohrloch einer 96-Well-Platte.
- Ort, von Hand, vier 96-Well-Wohnung-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A (Abbildung 6, Hotel A). Legen Sie eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf der Tipp-Loader-ALP, 300 mL Reservoir gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Schritten erstellte 2,1-2,3 auf P3 und 300 mL Reservoir gefüllt mit 70 % EtOH auf P7 (Abbildung 4, Deck und Abbildung 6 Deck).
Hinweis: 2,5 bis 2,8 erfolgen mit der Betriebssoftware. - Präsentieren Sie Zimmer 1 und 2 im Hotel A zu, und trennen Sie die Stapel von vier Platten. Setzen Sie eine Platte auf jede der leeren statischen Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 und P12). Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen auf 96-Kanal 200 µL Kopf.
- Aspirieren 90 µL aus 300 mL Medien-Samen Reservoir auf P3 und verzichten in den ersten 96-Well-Wohnung-Bodenplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle acht Platten der Medien-Saatgut-Mischung enthalten.
- Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL aus dem 300 mL Behälter gefüllt mit 70 % EtOH auf P7. Waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp waschen ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine 110 % Volumen Wasser viermal, entladen Sie die Tipps bei TL1 und sammeln Sie die Platten mit der hand.
3. Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Platten Screening
- Last, von Hand, eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen in Zimmer 1 des Hotel A, zwei 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten in Zimmer 2, 4, 6 und 8 und zwei 96 gut flach-Screening Bodenplatten in Zimmer 3, 5, 7 und 9 (Abbildung 4 Stapler und Abbildung 7, Hotel A). Verbinden Sie Schläuche darüber hinaus zum und vom Multichannel Tipp Wash ALP auf den 5-Gallonen-Tank.
Hinweis: 3.2 bis 3.10 erfolgen mit der Betriebssoftware. - Konfigurieren Sie das Deck um 300 mL 70 % EtOH Wash Reservoir an P7 enthalten; Das Medien-Samen Reservoir kann auf dem Deck auf P3 gelassen werden (Abbildung 4, Deck und Abbildung 7, Deck). Darüber hinaus schalten Sie die Konsole Fahrt durch Verbindung von der Gerätesteuerung Wasser durch Multichannel Tipp Wash ALP zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.
- Präsentieren Sie die AP96 P250 Pipette Tip Box von Hotel A und verschieben Sie es an der Spitze Loader ALP.
- Präsentieren die 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten aus Zimmer 2 Hotels A Deck und Platz eins auf statische ALP P4 und auf P8. Die 96-Well-Wohnung zu präsentieren-Screening Bodenplatten aus Zimmer 3 Hotel a auf das Deck und legen Sie eine statische ALP P5 und eine auf P9.
- Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf.
- Mischen die 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4 durch Absaugen und Verzicht auf 50 µL dreimal. Im Anschluss daran Aspirieren 10 µL von dieser Platte und verzichten in der 96-Well-Wohnung-Screening Bodenplatte auf P5.
- Mischen Sie die Lösungen in die Platte bei P5 Absaugen und 50 µL dreimal. Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen mit Ethanol durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH aus dem Reservoir auf P7 und dann waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf ein Volumen von 110 % des Wasser viermal.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die zweite 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatte (P8) und 96-Well-flach-Screening Bodenplatte (P9).
- Stapel die beiden 96-Well V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten zusammen und die beiden 96-Well flache Unterseite Screening Platten zusammen. Verschieben Sie die Platten an statischen Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,9 dreimal, insgesamt acht Mal Platten Screening verdünnte Chemikalien hinzufügen. Zu guter Letzt überprüfen Sie die Anzahl der Samen in jede Vertiefung der Screening-Platten durch visuelle Konformation und ergänzen Sie diesen Brunnen mit weniger als drei Samen durch zusätzliche sterilisiert und vernalized Samen.
(4) Inkubation und Visualisierung von Screening-Platten
- Inkubieren Sie 96-Well flach-Boden Screening-Platten für vier Tage in einer Klimakammer bei 22 ° C auf einem 16/8 Hell-Dunkel-Zyklus in ein Behältnis Austrocknung. 96-Well flach-Boden Screening-Platten unter dem sezierenden Mikroskop zu visualisieren. Notieren Sie alle abweichende Phänotypen zur weiteren Untersuchung.
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Representative Results
Die Fähigkeit, genau und effizient charakterisieren Phänotypen basierend auf die Zugabe von kleinen Molekülen bei screening-Konzentrationen unter dem sezierenden Mikroskop ist das Endziel dieser Methode der vorwärts Chemische Genetik auf Arabidopsis. Die Phänotypen beobachtet, wenn alle 50.000 Verbindungen gezeigt hatte war vielfältig und kann in mehrere unterschiedliche Klassen (Abbildung 2) aufgeteilt werden. Abbildung 3A -F zeigt Beispiele der Phänotypen, die bei kleiner Vergrößerung unter dem sezierenden Mikroskop beobachtet wurden. Einige Phänotypen bereitgestellten eindeutigen Ergebnisse (Abbildung 3, H). Diese mussten erneut getestet werden, bei niedrigeren Konzentrationen um sicherzustellen, dass die Chemikalie keinen anderen Phänotyp bei einer niedrigeren Dosis bieten.
Schlechte Ergebnisse können aus vielen Gründen entstehen. Schlechte Keimrate der Samen ist. Dadurch kann eine Screening-Platte, überwiegend weisen keine Keimung oder unvollständige Keimung Phänotypen (Abbildung 3, H), die irreführend sein können. Um dies zu überwinden, vor dem test Keimrate für alle Samen verwendet. Sobald Keimrate sich etabliert haben und sind mehr als 95 % für Arabidopsis, ist Vernalisation von Saatgut vor chemischen Zusatz ein wichtiger Schritt, die gleichzeitige Keimung zu gewährleisten. Mangel an gleichzeitigen Keimung kann zu Fehlalarmen in Phänotypisierung führen. Darüber hinaus können schlechte Ergebnisse entstehen, wenn Medien erlaubt ist, während der Inkubation verdunsten. Diese mangelnde Flüssigkeitszufuhr verhindert, dass Samen keimen und kann durch den Einsatz von Austrocknung-Behältern vermieden werden. Darüber hinaus DMSO und Medien-Lösungen sind in den beiden externen Spalten jede Platte, Sicherstellung der ordnungsgemäßen Mikroklimata und Keimrate erzielt werden.
Befriedigende experimentelle Ergebnisse werden erzielt, wenn Keimungsraten sind > 95 %, Samen sind vor der Zugabe in 96-Well flach-Boden-Platten, Gewährleistung gleichzeitige Keimung, vernalized und Medien verdampft nicht während der Inkubation. Im Idealfall würden Chemikalien getestet werden, in einer Konzentration, die alle Samen zu keimen und Phänotypen genau beurteilt werden kann (Abb. 3A-F). Die Mehrheit der Behandlungen produziert Sämlinge mit Phänotypen, die optisch nicht zu unterscheiden von mock Steuerelemente mit keine morphologischen Phänotypen (Abbildung 3A), mit der überwiegenden Mehrheit der abweichende Phänotypen bestehend aus wurden gebleicht und stark verkümmerte Wurzeln (Abbildung 2).
Abbildung 2: die häufigsten Phänotypen beobachtet und der Anteil des einzelnen Phänotyps beobachtet. (A) insgesamt 3.271 kleine Moleküle erwiesen sich bei 100 µM bioaktiven nach vier Tagen Inkubationszeit. Die Farbe gibt den Schweregrad des Phänotyps (schwarz = schweren, weißen = weniger stark). Die am häufigsten beobachteten Phänotyp bezogen sich auf Wurzel Morphologie, mit mehr als 1.500 Verbindungen induzierende verkümmerte Wurzeln unterschiedlichen Schweregrades. Färbung wirkte auch häufig durch die Verbindungen in dieser Bibliothek mit 1.148 Sämlinge als vollkommen gebleicht oder teilweise verfärbt. Knapp 400 Mischungen produziert charakteristische Wurzelhaare Phänotypen – entweder verkümmert oder beide verkümmert und bunt. Schließlich war die Keimung von knapp 200 Verbindungen betroffen. In diesen Fällen Samen keimen nicht abgeschlossen oder nicht einmal ansatzweise zu keimen. (B) Sämlinge ausstellenden Anomalien in der Wurzel Morphologie, entweder verkümmert oder stark verkümmert, fast die Hälfte aller phänotypisch aberranten Sämlinge konstituiert. Die nächste größte Gruppe waren diejenigen, die in gebleichtem oder verfärbte Sämlinge geführt. Phänotypen, die Wurzelhaare Anomalien auch besteht ein beträchtlicher Teil, während die Hemmung der Keimung, entweder keine Keimung oder unvollständige Keimung betrafen, trat nur bei einem kleinen Prozentsatz aller bioaktiven Verbindungen. Schließlich gab es eine Reihe von Phänotypen, die bei solch einer niedrigen Frequenz aufgetreten, sie waren in der Kategorie "Sonstige", zum, die Beispiel, die Produktion von grünem Schleim, in Abbildung 3zu sehen war gruppiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bilder der repräsentativen Phänotypen beobachtet, während der Bildschirm nach vorne Chemische Genetik. Keine sichtbaren morphologischen Anomalien (A), Braun (B), verkümmert (C) Root, stark verkümmert Wurzelhaare root (D), gebleicht (E), grüner Schleim (F), unvollständige Keimung (G) und keine Keimung (H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Übersicht der Stapler 10 und Deck vor Einleitung des Protokolls eingerichtet. Die Stapler-Karussell besteht aus vier Stapler 10 (Hotels A - D) die jeweils zehn Zimmern untergebracht werden. Das Deck bietet eine Vielzahl an Alpen: Tipp-Loader, der Stapler-Shuttle, Multichannel-Tipp waschen und 13 statische Alpen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Stapler 10 und Deck eingerichtet zum Erstellen einer Bibliothek Verdünnung erforderlich. Die vier Stapler 10 sind voller Kisten mit AP96 P20 Pipettenspitzen in Zimmer 1 und 6 des Hotels A - D und Stapeln von vier 96-Well-V-Bodenplatten in 2-5 und Zimmer 7-9 Zimmer des Hotels A - D. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Stapler 10 und Deck eingerichtet für Hinzufügen von Medien-Saatgut Mischung zu Screening Platten. Die Stapler-10 ist mit vier 96-Well-Wohnung geladen-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7 und eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf TL1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Stapler 10 und Deck eingerichtet für Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Screening Platten. Die Stapler-10 ist mit einer Schachtel AP96 P250 Pipettenspitzen in Saal 1, einen Stapel von zwei 96-Well-V geladen-Verdünnung der unteren Platten in Zimmer 2, 4, 6, und 8 und einen Stapel von zwei 96-Well-Wohnung-Bodenplatten gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Zimmer 3 , 5, 7 und 9. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll soll Forscher helfen bei der Bewältigung einer vorwärts Chemische Genetik-Bildschirms auf Arabidopsis. Wir bieten repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm von 50.000 Verbindungen (Abbildung 2 und Abbildung 3), einer der größten vorwärts Chemische Genetik Bildschirme auf Arabidopsis9,13,23bisher durchgeführt. Die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter aktiviert eine effizientere Verdünnung Bibliothek und screening-Bibliothek-Generation, Verbesserung der Geschwindigkeit und Effizienz der Identifizierung der neuartige Substanzen. Erhöhung der Kapazität auf Leinwand in einer Hochdurchsatz-Natur wurde durch eine Verringerung der Arbeit im Namen der Forscher begleitet. Diese Technik wurde entwickelt, um mit 96-Well-Platten verwendet werden, die kleinen Samen oder Pflanzen unter dem sezierenden Mikroskop sichtbar unterbringen können. Verwendung von Platten mit größeren Brunnen um größere Samen passen würde Änderungen an den Durchsatz und die Gestaltung erfordern.
Zusätzliche Einschränkungen dieser Technik umfassen die Schwierigkeit dieses Stück der Ausrüstung mit aseptischen Techniken zu verwenden; Allerdings sind wir nicht hohe Prozentsätze einer Kontamination durch ½ MS Medien fehlt Saccharose gestoßen. Man könnte jede Kontamination Problem umgehen, indem Sie Platzierung des Roboters in einem sterilen Raum, ermöglicht für sterilen Bedingungen und Zellkultur oder mithilfe eines liquid Handling-Roboters mit einer sterilen Kammer24,25. Eine weitere Einschränkung ist Spitzengröße und Samen Aspiration. Eine kleine PIPETTENSPITZE wie AP96 P20 würde mit Samen verstopfen; Daher muss eine größere PIPETTENSPITZE für Saatgut zu dosieren und Mischen von Lösung verwendet werden.
Wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls gehören die sorgfältige Beschriftung von alle Platten in der Verdünnung Bibliothek und Screening-Bibliothek, sicherzustellen, dass sie in der richtigen Ausrichtung zusammen mit der richtigen Reihenfolge sind, wenn den Roboter füttern. Klare Kennzeichnung und systematische Verarbeitung ist unkompliziert und kann dieses Problem überwunden. Ein weiterer entscheidender Schritt besteht darin, die richtige Ausrüstung an der richtigen Stelle ist, bevor das Experiment in den Stapler 10 und auf dem Deck. Wenn das Gerät nicht richtig auf dem Deck platziert ist, könnte der 96-Kanal 200 µL Kopf abstürzen das Gerät beschädigen und Wartung erfordern. Ein weiterer wichtiger Schritt ist sicherzustellen, dass die korrekte Menge der Flüssigkeit innerhalb der 300 mL-Behälter befindet und dieser Betrag korrekt in die Software eingegeben wird. Wenn die Zahlen nicht übereinstimmen, die Tipps erreichen nicht die Flüssigkeit und streben wird nicht auftreten.
Es ist auch notwendig, Maßnahmen ergreifen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse korrekt sind. Ein Fehler, die wir bemerkt während der Entwicklung des Protokolls wurde verknüpft, um Leben zu kippen. Nach aufeinanderfolgenden be- und Entladen verlieren die Spitzen ihre Fähigkeit, Aspirieren und genau dosieren. Es ist daher unerlässlich, dass jeder Satz von 96 Tipps verwendet wird bis zu vier Mal. Es ist auch wichtig, das Waschwasser regelmäßig, um zu vermeiden, das Potenzial für Chemikalien, versehentlich hinzugefügt werden, um die Platten screening zu ändern. Schließlich haben einige Chemikalien eine Tendenz zur Lösung26auszufällen. Um sicherzustellen, dass jede Chemikalie in der richtigen Konzentration hinzugefügt wird, fließen mischen Schritte in der Verdünnung und Screening Protokoll. Mischen Sie kann in geringen Mengen von Chemikalien wird von Bibliothek zu Bibliothek hinzugefügt, anspruchsvolle Interpretation des chemischen Potentials induzierte Phänotypen Nichtbeachtung.
Mit der richtigen Platten für jeden Teil des Protokolls ist auch sehr wichtig. V-Boden Platten sollen sicherstellen, dass kleine Mengen an Flüssigkeit abgesaugt werden können und sind für den Einsatz bei der Erstellung der Bibliothek Verdünnung empfohlen. Diese Platten eignen sich jedoch nicht für das Screening Teil des Protokolls, da ihre Reflexion von Licht zu schlechten Visualisierung der Phänotypen führt. Um die Phänotypen der 3-4 Tage alte Sämlinge beobachten, muss der Bildschirm in flach-Boden Platten durchgeführt werden.
Sobald die siebungplatten erstellt wurden, wird die Visualisierung benötigt. flach-Boden 96-Well-Platten ermöglichen einfache Visualisierung unter Mikroskopen zu sezieren. Es ist zwingend notwendig, dass die Platten in Austrocknung-Behältern zur Verringerung der Verdunstung der Medien gespeichert sind. Eine Alternative zur mikroskopischen Visualisierung ist einen hochauflösende Scanner verwenden. Bilder mit hoher Auflösung zeigen die Mehrheit der Phänotypen, die in diesem Bildschirm beobachtet und bieten ein Archiv mit den Ergebnissen, die in der Zukunft revidiert werden können. Sobald Visualisierung abgeschlossen ist, und die Bibliothek Ihrer Wahl gezeigt, könnte diese Methode dann auf verschiedene Organismen oder durch eine andere chemische Bibliothek durchgeführt werden. Modifikationen am Gerät können für die sterile Kultur, so dass Ventures in das Reich der Stammzellen, Pilze, Insekten und kleine Pflanzen2,18,25,27.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Jozsef Storch, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue und Andrea Sanchez für konstruktive und kritische Diskussion. Dr. Sharyn Perry für die phänotypische Fotografien. Dieses Material basiert auf Arbeit von der National Science Foundation unter Genossenschaft Vereinbarung Nr. 1355438 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
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