Summary
Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.
Abstract
Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.
Introduction
Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell'ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico1,2,3,4,5. L'impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l'identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ricercatori di capire i fondamenti genotipici di particolari processi. Al contrario, genetica chimica inversa Cerca prodotti chimici che interagiscono con un pre-determinata proteina bersaglio6. Arabidopsis è stato all'avanguardia di queste scoperte in biologia vegetale, perché il suo genoma è piccolo, mappato e annotati. Ha un tempo di generazione breve, e sono presenti più righe di mutante/reporter disponibili per facilitare l'identificazione di macchinari subcellulare aberrante7.
Ci sono due principali colli di bottiglia che rallentano i progressi degli schermi genetici chimici in avanti, l'iniziale processo di screening e determinare l'obiettivo del composto di interesse8. Un aiuto importante nell'aumentare la velocità di selezione piccola molecola è l'uso di apparecchiatura automatizzata9e automazione. Robot di manipolazione dei liquidi sono un ottimo strumento per la gestione delle grandi biblioteche di piccole molecole e hanno contribuito a guidare il progresso nelle scienze biologiche10. Il protocollo qui presentato è stato progettato per alleviare il collo di bottiglia associato con il processo di screening, che consentano l'identificazione di piccole molecole bioattive a ritmo veloce. Questa tecnica riduce il carico di lavoro e il tempo per conto dell'operatore, anche diminuendo il costo economico per il ricercatore di principio.
Finora, le librerie più chimiche analizzate hanno tenuto tra 10.000 e 20.000 composti, alcuni con oltre 150.000 ed alcuni con minor come 709,11,12,13,14, 15 , 16. il protocollo introdotto nel presente documento è stato implementato su una libreria piccola molecola di 50.000 composti (Vedi Tabella materiali), uno della più grande genetica chimica avanti schermi condotti su Arabidopsis fino ad oggi. Questo protocollo si adatta con l'attuale tendenza verso una maggiore efficienza e velocità per quanto riguarda la genetica chimica in avanti, soprattutto per quanto riguarda erbicida scoperta, scoperta di insetticida, fungicida scoprire, drug discovery e biologia del cancro17 ,18,19,20,21. Anche se qui implementato con Arabidopsis, questo protocollo, potrebbe facilmente essere adattato alle colture cellulari, spore e potenzialmente anche gli insetti in mezzo liquido all'interno di 96, 384- o 1536 pozzetti. Grazie alle sue piccole dimensioni, Arabidopsis è favorevole alla proiezione a 96 pozzetti. Tuttavia, distribuendo uniformemente tra pozzi è una sfida. Mano il seeding è accurata, ma ad alta intensità di manodopera, e anche se ci sono dispositivi progettati per erogare semi in piastre da 96 pozzetti, essi sono costosi da acquistare. Qui, ci mostrano come questo passaggio può essere aggirato con solo una piccola perdita in precisione.
L'obiettivo generale di questo metodo era per fare lo screening di una grande biblioteca chimica contro Arabidopsis più gestibile, senza compromettere la precisione, tramite l'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi. L'utilizzo di questo metodo migliora l'efficienza del ricercatore di diminuire il tempo necessario per completare la gestione di serie di diluizione iniziale e schermate successive fenotipiche, consentendo una visualizzazione rapida dei campioni sotto un microscopio per dissezione e rapida identificazione di nuove piccole molecole bioattive. Figura 1 illustra i risultati chiave di questo protocollo in 4 passi.
Figura 1: flusso di lavoro complessivo dello schermo in avanti genetica chimica. Una panoramica del protocollo per essere descritto con qualche dettaglio per ciascuno dei 4 passaggi chiave. 1: ricevendo la biblioteca chimica, 2: rendere la libreria di diluizione, 3: rendendo le piastre di Screening e 4: incubazione e visualizzare le piastre di Screening. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. creazione di una libreria di diluizione
- Etichetta 625 piastre di diluizione biblioteca a mano, garantendo che essi corrispondono alla loro piastra corrispondente dalla biblioteca chimica. Inoltre, connettersi in flusso e out tubi di flusso per il multicanale suggerimento lavaggio automatizzato Labware posizionatore (ALP) passando attraverso l'unità di Console per il serbatoio da 5 galloni (Vedi Tabella materiali).
- Accedere al computer e accendere la pompa di lavaggio attraverso la connessione del Controller del dispositivo per il multicanale suggerimento Wash ALP al fine di far circolare l'acqua. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.
- Carico, a mano, il 10 di Stacker fissato al carosello Stacker, nel seguente ordine in Alberghi A - D (Figura 4, Stacker); una scatola di AP96 P20 puntali in camera 1, quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere a 2-5 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio dalla libreria di ordinato e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore). Inoltre, caricare una scatola di AP96 P20 puntali in camera 6 e quattro 96 pozzetti V-piastre inferiori nelle camere: 7-9 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio della biblioteca ordinata e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore).
- Istituire, a mano, il ponte con un serbatoio di acqua 300 mL su P3, un 300 mL 70% EtOH bagno il P7, suggerimento Loader ALP (TL1) e multicanale suggerimento Wash ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, ponte).
- Utilizzando il software operativo, presentare AP96 P20 puntali da 10 Stacker e spostarli all'Alpe Loader Tip.
Nota: 1.5 tramite 1.12 tutte sono fatte con il liquido gestione software operativo del robot; Vedi Tabella materiali. - Presentiamo 2 camera da Hotel A e separare tutti i quattro 96 pozzetti V-fondo piastre sul ponte, mettendo sul fondo due su P4 e P8 e le prime due su P5 e P9 (Figura 4).
- Caricare AP96 P20 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l. 90 µ l del serbatoio di acqua di 300 mL di aspirare e dispensare al v 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4. Ripetere questo passaggio per la piastra su P8.
- Mescolare la piastra libreria chimica su P5 ripetutamente aspirazione e il dosaggio 15 µ l tre volte. Inoltre, aspirare 10 µ l dalla cassa della libreria chimica su P5 e Pipettare 10 µ l nella piastra diluizione su P4.
- Mescolare le soluzioni della piastra sul P4 da ripetutamente aspirazione e il dosaggio 50 µ l di un totale di tre volte. Una volta miscelato, pulire le punte di pipetta P20 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH da P7, poi lavarli in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.
- Ripetere i passaggi da 1.8-1.9 per la seconda coppia di piastre su P8 e P9. Al momento di creare il secondo V 96-Well-piastra inferiore diluizione, stack le piastre nel seguente ordine dal basso verso l'alto: P4, P5, P8 e P9. Quindi, posizionare la risma un vuoto statico ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.
- Ripetere i passaggi 1.6-1.10 5 camera in Hotel A è vuoto. Ripetere il passaggio 1.5 su raggiungendo la camera 6, spostando nuovo AP96 P20 puntali all'Alpe Loader Tip e mettendo i puntali per pipette usate AP96 P20 su un vuoto statico ALP.
- Ripetere i passaggi 1.6-1.10 9 camera di Hotel A è vuoto. Tuttavia, al fine di procedere all'Hotel B, le piastre e suggerimenti sul ponte devono essere ricaricati in a Hotel.
- A mano, ri-riempire il serbatoio di acqua di 300 mL. Questo passaggio è cruciale, e il programma del computer può incorporare una pausa dettagliare questo messaggio, che richiede l'utente a premere 'continua', prima di eseguire il passaggio successivo.
- Ripetere i passaggi da 1.5-1.13 per i rimanenti Hotel, garantendo un serbatoio dell'acqua pieno 300 mL ogni volta prima di procedere all'hotel successivo.
2. aggiunta di miscela di Media-semi per piastre di Screening
- Fare ½ Murashige e Skoog (MS) Media con 0,1% Agar con l'aggiunta di 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar a 1 L DI H2O. regolare il pH a 5.7 però l'aggiunta di 5 M di idrossido di potassio durante il monitoraggio con una sonda di pH.
- Sterilizzare i semi agitando in 1% candeggina e SDS tra 15 e 30 min e poi lavare 4 volte con un volume uguale di acqua mediante centrifugazione. Una volta che i semi sono sterili, metterli a 4 ° C da 24 ore a 7 giorni per vernilization. Il centro di risorse biologiche di Arabidopsis descrive ulteriori metodi di sterilizzazione, vernilization e crescita22.
- Aggiungere i semi ai media a mano ad una densità di 0,1 g/100 mL. Questa densità si traduce in una media di 3-10 semi per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Luogo, a mano, quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di Hotel A (Figura 6, A Hotel). Inserire una casella di AP96 P250 puntali sull'Alpe Loader Tip, un serbatoio 300ml riempito con la miscela di semi di media creata nei passaggi da 2.1-2.3 in P3 e un serbatoio 300 mL riempita con 70% EtOH sul P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Ponte).
Nota: 2.5 tramite 2.8 sono fatto con il software operativo. - Presentare le camere 1 e 2 in Hotel A e separare le pile di quattro piastre. Posizionare una piastra su ciascuna delle Alpi vuoto statico (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Caricare AP96 P250 puntali sulla testa con 96 canali a 200 µ l.
- 90 µ l dal serbatoio 300ml media-seme su P3 di aspirare e dispensare nel primo appartamento di 96 pozzetti-piastra inferiore. Ripetere questo processo fino a quando tutte le otto tavole contengono la miscela di semi di media.
- Pulizia delle punte di pipetta P250 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l dal serbatoio 300 mL riempito con 70% EtOH sul P7. Lavare le punte in multicanale suggerimento lavare Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte, scaricare le punte presso TL1 e raccogliere i piatti a mano.
3. aggiunta di piccole molecole per piastre di Screening
- Carico, a mano, una scatola di AP96 P250 puntali in 1 camera di Hotel A, due V 96 pozzetti-piastre inferiori del libreria di diluizione in camere da 2, 4, 6 e 8 e due 96 ben piatto-Screening piastre inferiori in camere 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Fascicolatore e Figura 7, un Hotel). Inoltre, collegare i tubi flessibili da e verso l'Alpe di Wash suggerimento multicanale per il serbatoio da 5 galloni.
Nota: 3.2 al 3.10 sono fatto con il software operativo. - Configurare il mazzo per contenere un serbatoio di lavaggio 300 mL 70% EtOH presso P7; il serbatoio di media-seme può essere lasciato sul ponte a P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, ponte). Inoltre, accendere l'unità di Console tramite connessione del dispositivo Controller per far circolare l'acqua attraverso l'Alpe Wash suggerimento multicanale. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.
- Presentiamo la scatola di Tip pipetta AP96 P250 da Hotel A e spostarlo all'Alpe Loader Tip.
- Presentare il V 96 pozzetti-piastre di diluizione biblioteca inferiori da 2 camera di Hotel al ponte e posto uno statico ALP P4 e uno su P8. Presentare il piatto di 96 pozzetti-piastre di Screening di fondo da camera 3 di Hotel al ponte e posizionare uno statico ALP P5 e uno su P9.
- Caricare AP96 P250 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l.
- Mescolare il V 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. In seguito, aspirare 10 µ l da questo piatto e versare nel piatto 96-Well-piastra di Screening inferiore su P5.
- Mescolare le soluzioni nella piastra a P5 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. Pulire le punte di pipetta AP96 P250 con etanolo di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH dal serbatoio a P7 e poi lavare i suggerimenti in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.
- Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per il secondo V 96-Well-piastra di fondo diluizione biblioteca (P8) e 96 pozzetti piatto-piastra inferiore Screening (P9).
- Stack due 96 pozzetti V-piastre di diluizione biblioteca inferiori insieme e le due piastre di fondo Screening 96 pozzetti piatto insieme. Spostare le piastre statico Alpi P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.
- Ripetere i passaggi da 3.4-3.9 tre volte, l'aggiunta di prodotti chimici diluiti allo screening piatti un totale di otto volte. Infine, controllare il numero di semi in ciascun pozzetto delle piastre di screening attraverso visual conformazione e integrare tali pozzetti con meno di tre semi per ulteriori seme vernalizzato e sterilizzato.
4. incubazione e visualizzazione delle piastre di Screening
- Incubare le piastre a 96 pozzetti a fondo piatto di Screening per quattro giorni in una camera climatica a 22 ° C su un ciclo luce/buio di 16/8 in un contenitore di prova di essiccazione. Visualizzare le piastre da 96 pozzetti a fondo piatto Vagli sotto un microscopio per dissezione. Registrare tutti i fenotipi aberranti per ulteriori indagini.
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Representative Results
La capacità di esattamente ed efficientemente caratterizzare fenotipi basati sull'aggiunta di piccole molecole alle concentrazioni sotto un microscopio per dissezione di screening è l'obiettivo finale di questo metodo di inoltro genetica chimica su Arabidopsis. I fenotipi osservati quando tutti i 50.000 composti erano stati proiettati era vari e può essere suddiviso in diverse classi distinte (Figura 2). Figura 3A -F raffigura esempi di fenotipi che sono stati osservati a basso ingrandimento sotto un microscopio per dissezione. Alcuni fenotipi fornito risultati inconcludenti (Figura 3, H). Questi hanno dovuto essere riprovati alle concentrazioni più basse per garantire che il prodotto chimico non ha fornito un fenotipo differente ad una dose più bassa.
Scarsi risultati possono verificarsi per molti motivi. Uno è tariffe poveri germinazione dei semi. Ciò può causare una lamiera schermante prevalentemente esporre nessuna germinazione o fenotipi germinazione incompleta (Figura 3, H), che può essere fuorviante. Per ovviare a questo, pre-test per tassi di germinazione per tutti i semi utilizzati. Una volta tassi di germinazione sono stati stabiliti e sono superiori al 95% per Arabidopsis, vernalizzazione di seme prima della aggiunta chimica è un passo fondamentale garantire la germinazione simultanea. Mancanza di germinazione simultanea può portare a falsi positivi in phenotyping. Oltre a questo, scarsi risultati possono sorgere se media è consentita per evaporare durante l'incubazione. Questa mancanza di idratazione impedisce la germinazione di semi e può essere evitata attraverso l'uso di contenitori a prova di essiccazione. Inoltre, soluzioni di DMSO e media sono nelle due colonne esterne di ogni piatto, garantendo la corretta micro climi e tassi di germinazione sono ottenuti.
Risultati sperimentali soddisfacenti si ottengono quando i tassi di germinazione sono > 95%, semi sono vernalizzati prima dell'aggiunta in piastre a 96 pozzetti a fondo piatto, garantendo germinazione simultanea, e media non evapora durante l'incubazione. Idealmente, i prodotti chimici sarebbero stati testati ad una concentrazione che consente tutti i semi di germinare e fenotipi per essere valutati con precisione (Figura 3A-F). La maggior parte delle piantine trattamenti prodotte con fenotipi che erano visivamente indistinguibili dai controlli finti con nessun fenotipi morfologici (Figura 3A), con la maggior parte dei fenotipi aberranti composto sbiancato e gravemente radici stentate (Figura 2).
Figura 2: I fenotipi più comuni osservati e la proporzione di ogni fenotipo osservato. A) un totale di 3.271 piccole molecole sono stati trovati per essere bioattivi a 100 µM dopo quattro giorni di incubazione. Il colore indica la gravità del fenotipo (nero = più severa, bianco = meno grave). Il più comunemente osservato fenotipo riferiscono alla morfologia della radice, con più di 1.500 composti che inducono le radici stentate di varia gravità. Colorazione è stato influenzato anche comunemente i composti in questa libreria, con 1.148 piantine registrate come sbiancato interamente o parzialmente scolorito. Appena sotto 400 composti prodotto distintivo dei capelli di radice fenotipi – sia stentati o entrambi stentata e dai colori vivaci. Infine, la germinazione ha risentito poco meno di 200 composti. In questi casi, semi di germinazione non è stata completata o non hanno ancora cominciato a germinare. B) le piantine che esibiscono le anomalie nella morfologia della radice, o essendo stentate o gravemente stentate, costituivano quasi la metà di tutte le piantine fenotipico aberrante. Il più grande gruppo successivo era quelli che ha provocato piantine sbiancati o scolorite. Fenotipi che hanno appartenuto alla radice dei capelli anomalie che inoltre si compone una parte considerevole mentre l'inibizione della germinazione, nessuna germinazione o la germinazione incompleta, si è verificato solo in una piccola percentuale di tutti i composti bioattivi. Infine, c'erano una serie di fenotipi che si è verificato a tale bassa frequenza, sono stati raggruppati nella categoria 'altra', di cui un esempio è stata la produzione di mucillagine verde, visto nella Figura 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini di rappresentante fenotipi osservati durante la schermata di avanzamento genetica chimica. Nessuna anormalità morfologiche visibili (A), radice di peli radicali marroni (B), arresto della crescita della radice (C), gravemente stentata (D), sbiancato (E), verde mucillagine (F), incompleta germinazione (G) e non germinazione (H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Panoramica del fascicolatore 10 e deck istituito prima dell'inizio del protocollo. Il carosello di Stacker è composto di quattro Stacker 10 (Alberghi A - D) che ogni ospitare dieci camere. Il ponte ospita una varietà delle Alpi: il caricatore di punta, la navetta di Stacker, il lavaggio multicanale Tip e 13 Alpi statico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Deck impostare richiesto per la creazione di una libreria di diluizione ed impilatore 10. I quattro Stacker 10 vengono caricati con scatole di AP96 P20 puntali in camere 1 e 6 di Hotel A - D e pile di quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere 7-9 2-5 e camere di Hotel A - D. Il layout del ponte è costituito da due serbatoi di 300 mL su statico Alpi P3 e P7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: impilatore 10 e Deck impostati per aggiunta di miscela di Media-semi di Screening piastre. Il 10 di Stacker è caricato con quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di A. Hotel Il layout del ponte è costituito da due serbatoi di 300 mL su statico Alpi P3 e P7 e una scatola di AP96 P250 puntali su TL1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: impilatore 10 e Deck impostati per l'aggiunta di piccole molecole per Screening piastre. Il 10 di Stacker è caricato con una scatola di AP96 P250 puntali in camera 1, una pila di due 96 pozzetti V-diluizione inferiore piastre in camere di 2, 4, 6 e 8 e una pila di due 96 pozzetti piatto-piastre inferiori riempito con la miscela di semi di media in 3 camere , 5, 7 e 9. Il layout del ponte è costituito da due serbatoi di 300 mL su statico Alpi P3 e P7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi9,13,23. L'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi permesso più efficiente diluizione biblioteca e generazione della libreria di screening, migliorando la velocità e l'efficienza dell'identificazione di nuovi composti. Aumentando la capacità di schermo in una natura di alta velocità di trasmissione è stata accompagnata da diminuzione del lavoro per conto del ricercatore. Questa tecnica è stata progettata per essere utilizzato con piastre da 96 pozzetti, che possono ospitare piccoli semi o piante visibili sotto un microscopio per dissezione. Utilizzando piastre con pozzetti più grandi per adattarsi più grandi semi richiederebbe modifiche alla velocità effettiva e al design.
Ulteriori limitazioni di questa tecnica includono la difficoltà di utilizzo di questo pezzo di equipaggiamento con tecniche asettiche; Tuttavia, non abbiamo incontrato alte percentuali di contaminazione dovuto ½ MS media privo di saccarosio. Uno potrebbe aggirare qualsiasi problema di contaminazione inserendo il robot in una camera sterile, permettendo per condizioni sterili e coltura delle cellule, o utilizzando un robot di manipolazione dei liquidi con una camera sterile24,25. Un'altra limitazione è formato di punta e l'aspirazione di seme. Un puntale piccolo come il P20 AP96 sarebbe intasare con semi; Pertanto, un puntale più grande deve essere utilizzato per la semina e la soluzione di miscelazione.
Fasi critiche all'interno di questo protocollo includono l'etichettatura attenta di tutte le piastre nella diluizione libreria e biblioteca di screening, siano l'orientamento corretto insieme con ordine corretto quando si alimenta il robot. Chiara etichettatura e dall'elaborazione sistematica è semplice e può superare questo problema. Un altro passo fondamentale è garantire che l'attrezzatura giusta sia nella posizione corretta prima di iniziare l'esperimento, sia entro i 10 di Stacker e sul ponte. Se l'apparecchiatura non è correttamente posizionato sul ponte, il 96-canale 200 µ l testa potrebbe crashare, danneggiando lo strumento e che richiedono manutenzione. Un altro passo fondamentale è garantire che la corretta quantità di liquido è collocata all'interno dei serbatoi di 300 mL e che tale importo è inserito correttamente nel software. Se i numeri non corrispondono, le punte non raggiungerà il liquido e di aspirazione non si verificherà.
Inoltre è necessario adottare misure per assicurare che i risultati ottenuti siano accurati. Un errore che abbiamo notato durante lo sviluppo del protocollo è stato collegato per suggerimento di vita. Dopo successivo carico e scarico, le punte perdono la capacità di aspirare e dispensare con precisione. È quindi imperativo che ogni set di 96 punte viene utilizzato un massimo di quattro volte. Inoltre è importante cambiare l'acqua di lavaggio regolarmente, per evitare il potenziale per i prodotti chimici inavvertitamente aggiunta a piastre di screening. Infine, alcune sostanze chimiche hanno la tendenza a precipitare fuori soluzione26. Per garantire che ogni prodotto chimico viene aggiunto alla concentrazione corretta, miscelazione passaggi sono incorporate in diluizione e protocollo di screening. Mescolare potrebbe comportare in basse quantità di sostanze chimiche viene aggiunto da libreria a libreria, stimolante interpretazione del potenziale chimico indotto fenotipi.
Utilizzando le piastre corrette per ogni parte del protocollo è anche molto importante. Piastre di fondo V sono progettate per assicurare che i piccoli volumi di liquido possono essere aspirati e sono raccomandati per l'uso nella creazione della libreria di diluizione. Tuttavia, queste piastre non sono adatte per la parte di proiezione del protocollo, poiché loro riflessione della luce porta alla visualizzazione difficile dei fenotipi. Al fine di osservare i fenotipi di 3-4 giorno vecchi piantine, lo schermo deve avvenire nelle piastre di fondo piatto.
Dopo avere create le piastre di screening, la visualizzazione è richiesto. piastre a 96 pozzetti a fondo piatto permettono la facile visualizzazione sotto microscopi di dissezione. È imperativo che le piastre sono memorizzate in contenitori a prova di essiccazione per ridurre l'evaporazione dei media. Un'alternativa alla visualizzazione microscopica è utilizzando uno scanner ad alta risoluzione. Immagini prodotte ad alta risoluzione rivelano la maggior parte dei fenotipi osservati in questa schermata e forniscono un archivio dei risultati che può essere rivisitato in futuro. Una volta che la visualizzazione è completa, e la biblioteca di vostra scelta proiettato, questo metodo potrebbe quindi essere eseguito su diversi organismi o con un'altra libreria chimica. Modifiche all'apparecchiatura potrebbero consentire per coltura sterile, permettendo ventures nei regni di cellule staminali, funghi, insetti e piante piccole2,18,25,27.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Jozsef cicogna, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez per la discussione costruttiva e critica. Dr. Sharyn Perry per le fotografie fenotipiche. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto cooperativa contratto n. 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
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