Summary
सिंथेटिक छोटे अणुओं की एक उच्च प्रवाह स्क्रीन मॉडल संयंत्र प्रजातियों, Arabidopsis थालियानापर आयोजित किया गया था । इस प्रोटोकॉल, एक तरल हैंडलिंग रोबोट के लिए विकसित, आगे रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन की गति बढ़ जाती है, उपंयास छोटे संयंत्र शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित करने वाले अणुओं की खोज में तेजी ।
Abstract
रासायनिक आनुवंशिकी तेजी से पौधों में लक्षण समझाना है कि पारंपरिक आनुवंशिकी जीन अतिरेक या घातकता के कारण के लिए अड़ियल हो सकता है कार्यरत किया जा रहा है । हालांकि, एक सिंथेटिक छोटे अणु के सक्रिय होने की संभावना कम है; इसलिए, हजारों अणुओं का परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि ब्याज की उन खोजने के लिए । तरल हैंडलिंग रोबोटिक्स सिस्टम नमूनों की बड़ी संख्या को संभालने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, जो गति के साथ एक रासायनिक पुस्तकालय को कम करने के अलावा में दिखलाई जा सकता है बढ़ाने/ एक उच्च प्रवाह को प्राप्त करने के लिए आगे रासायनिक आनुवंशिकी ५०,००० छोटे अणुओं पर Arabidopsis थालियाना (Arabidopsis) के एक पुस्तकालय, प्रोटोकॉल एक बेंच-टॉप मल्टीचैनल तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग कर विकसित किया गया है कि ंयूनतम की आवश्यकता तकनीशियन की भागीदारी । इन प्रोटोकॉल के साथ, ३,२७१ छोटे अणुओं की खोज की है कि दिखाई phenotypic परिवर्तन का कारण बना रहे थे । १,५६३ यौगिकों प्रेरित लघु जड़ें, १,१४८ यौगिकों बदल रंगाई, ३८३ यौगिकों जड़ बाल और अन्य, गैर वर्गीकृत, परिवर्तन, और १७७ यौगिकों बाधित अंकुरण के कारण.
Introduction
संयंत्र जीव विज्ञान के क्षेत्र में पिछले 20 वर्षों में शोधकर्ताओं ने रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण, दोनों आगे और रिवर्स का उपयोग कर महान प्रगति की है, सेल दीवार जैव संश्लेषण की हमारी समझ में सुधार, cytoskeleton, हार्मोन जैव संश्लेषण और संकेतन, gravitropism, रोगजनन, प्यूरीन का संश्लेषण, और endomembrane ्े1,2,3,4,5. आगे रासायनिक आनुवंशिकी तकनीक रोजगार ब्याज की phenotypes की पहचान सक्षम बनाता है और शोधकर्ताओं विशेष प्रक्रियाओं के genotypic आधार समझने के लिए अनुमति देता है । इसके विपरीत, रिवर्स रासायनिक आनुवंशिकी बाहर रसायन है कि एक पूर्व निर्धारित प्रोटीन लक्ष्य6के साथ बातचीत करना चाहता है । Arabidopsis संयंत्र जीव विज्ञान में इन खोजों के सबसे आगे रहा है, क्योंकि इसके जीनोम छोटा है, प्रतिचित्रित, और व्याख्या की । यह एक छोटी पीढ़ी के समय है, और वहां कई उत्परिवर्ती/रिपोर्टर ंयायपालिका उपसेलुलर मशीनरी की पहचान की सुविधा के लिए उपलब्ध लाइनों7।
इसमें दो बड़ी अड़चनें हैं, जो आगे की रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन की प्रगति को धीमा करती हैं, प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्रक्रिया और ब्याज के यौगिक के लक्ष्य का निर्धारण कर रही हैं8. छोटे अणु चयन की गति बढ़ाने में एक प्रमुख सहायता स्वचालन और स्वचालित उपकरणों का उपयोग है9. तरल हैंडलिंग रोबोट छोटे अणुओं के बड़े पुस्तकालयों से निपटने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है और जैविक विज्ञान में प्रगति ड्राइविंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है10। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्क्रीनिंग प्रक्रिया से जुड़ी अड़चन को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो तीव्र गति से सक्रिय छोटे अणुओं की पहचान को सक्षम कर रहा है। इस तकनीक के संचालक की ओर से श्रम और समय के बोझ को कम करते हुए भी सिद्धांत अन्वेषक को आर्थिक लागत कम होती है.
इस प्रकार अब तक, सबसे रासायनिक पुस्तकालयों का विश्लेषण १०,००० और २०,००० यौगिकों के बीच आयोजित किया है, के साथ कुछ के रूप में १५०,००० और कुछ के रूप में के रूप में कुछ के रूप में ७० 9,11,12,13,14 15 , 16. यहां पेश प्रोटोकॉल ५०,००० यौगिकों के एक छोटे अणु पुस्तकालय पर लागू किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें), बड़ा आगे रासायनिक आनुवंशिकी Arabidopsis तारीख को आयोजित की स्क्रीन में से एक । यह प्रोटोकॉल वृद्धि की ओर वर्तमान रुझान के साथ फिट बैठता है और आगे रासायनिक आनुवंशिकी के संबंध में गति, विशेष रूप से के रूप में यह herbicide खोज से संबंधित है, कीटनाशक खोज, फंजीसाइड डिस्कवर, ड्रग डिस्कवरी, और कैंसर जीव विज्ञान17 ,18,19,20,21. हालांकि Arabidopsis के साथ यहां कार्यांवित, इस प्रोटोकॉल, आसानी से सेल संस्कृतियों, बीजाणु के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और तरल माध्यम में संभावित भी कीड़े ९६ के भीतर-, ३८४-, या १५३६-अच्छी तरह से प्लेटें । अपने छोटे आकार के कारण, Arabidopsis ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में स्क्रीनिंग के लिए उत्तरदायी है । हालांकि, कुओं के बीच समान रूप से बीज वितरण एक चुनौती है । हाथ बोने सटीक लेकिन श्रम गहन है, और हालांकि वहां ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में बीज वितरण के लिए डिजाइन उपकरणों रहे हैं, वे खरीद महंगे हैं । यहां, हम बताते है कि कैसे इस कदम सटीकता में सिर्फ एक छोटे से नुकसान के साथ दरकिनार किया जा सकता है ।
इस विधि के समग्र लक्ष्य को परखने Arabidopsis के खिलाफ एक बड़े रासायनिक पुस्तकालय बनाने के लिए किया गया था, सटीकता से समझौता किए बिना, एक तरल हैंडलिंग रोबोट के उपयोग के माध्यम से. इस विधि का उपयोग प्रारंभिक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रबंधन और बाद में phenotypic स्क्रीन को पूरा करने के लिए उठाए गए समय को कम करके शोधकर्ता की दक्षता में सुधार, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों के त्वरित दृश्य की अनुमति है, और तेजी से उपन्यास के क्रियाशील लघु अणुओं की पहचान । चित्र 1 इस प्रोटोकॉल की कुंजी परिणामों को 4 चरणों में दर्शाया गया है ।
चित्रा 1: आगे रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन के समग्र कार्यप्रवाह. प्रोटोकॉल का एक सिंहावलोकन 4 मुख्य चरणों में से प्रत्येक के लिए कुछ विस्तार के साथ वर्णित किया जाना है । 1: रसायन पुस्तकालय, 2 प्राप्त: कमजोर पड़ने पुस्तकालय, 3 बनाने: स्क्रीनिंग प्लेटें, और 4: मशीनिंग और स्क्रीनिंग प्लेट visualizing । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. एक कमजोर पड़ने पुस्तकालय बनाना
- लेबल ६२५ हाथ से कमजोर पड़ने पुस्तकालय प्लेटें, यह सुनिश्चित करना है कि वे रासायनिक पुस्तकालय से उनकी इसी थाली के लिए मैच । इसके अतिरिक्त, प्रवाह और बाहर मल्टीचैनल टिप धोने स्वचालित Labware स्थान (ALP) के लिए उंहें सांत्वना ड्राइव के माध्यम से 5 गैलन जलाशय ( सामग्री की तालिकादेखें) से गुजर द्वारा प्रवाह hoses में कनेक्ट ।
- कंप्यूटर का उपयोग और मल्टीचैनल टिप धोने ALP के लिए डिवाइस नियंत्रक के कनेक्शन के माध्यम से धोने पंप पर बारी के क्रम में पानी प्रसारित करने के लिए । यह प्रोटोकॉल के अंत में स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा ।
- लोड, हाथ से, स्टेकर 10 स्टेकर हिंडोला से जुड़ा है, निंनलिखित क्रम में होटल में ए डी (चित्रा 4, स्टेकर); कमरे में AP96 P20 पिपेट युक्तियों का एक बॉक्स 1, ४ ९६-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेटें दो ऊपरी क्रम पुस्तकालय से स्टॉक सांद्रता युक्त प्लेटों के साथ 2-5 कमरे में और दो कम प्लेटेंखाली (चित्रा 5, स्टेकर) । इसके अतिरिक्त, 6 कमरे में AP96 P20 पिपेट युक्तियों का एक बॉक्स लोड, और ४ ९६-अच्छी तरह से वी के दो ऊपरी क्रम पुस्तकालय के स्टॉक सांद्रता युक्त प्लेटों और दो कम प्लेटें खाली (चित्रा5, स्टेकर) के साथ 7-9 कमरे में नीचे प्लेटें ।
- सेट अप, हाथ से, एक ३०० मिलीलीटर पर जल जलाशय के साथ डेक, P7 पर एक ३०० मिलीलीटर ७०% ेतोः स्नान, टिप लोडर ALP (TL1), और मल्टीचैनल टिप वॉश ALP (TW1) (चित्रा 4, डेक और चित्रा 5, डेक) ।
- ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग, वर्तमान AP96 P20 पिपेट युक्तियां स्टेकर 10 से और उंहें टिप लोडर ALP में ले जाएं ।
नोट: १.५ के माध्यम से १.१२ सभी तरल हैंडलिंग रोबोट ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है; सामग्री की तालिकादेखें । - वर्तमान कमरे 2 होटल से एक और अलग सभी ४ ९६-अच्छी तरह से वी डेक पर नीचे प्लेटें, पी 4 और P8 पर नीचे दो और P5 और P9 पर शीर्ष दो (चित्रा4) ।
- लोड AP96 P20 पिपेट युक्तियां लोडर ALP के साथ ९६-चैनल २०० µ l सिर पर सुझाव । महाप्राण ९० µ एल से ३०० मिलीलीटर जल जलाशय और पी 4 पर ९६ अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने प्लेट में बांटना । P8 पर प्लेट के लिए इस कदम को दोहराएँ ।
- P5 पर रासायनिक पुस्तकालय की थाली को दोहराए aspirating और तिरस्कृत करके 15 µ l को तीन बार मिलाएं । इसके अतिरिक्त, महाप्राण पर केमिकल लाइब्रेरी प्लेट से 10 µ l P5 और पी 4 पर कमजोर पड़ने वाली प्लेट में 10 µ l को बांटें ।
- मिश्रण पर प्लेट के समाधान द्वारा पी 4 दोहराव aspirating और औषधालय ५० µ l कुल तीन बार. एक बार मिलाया, aspirating द्वारा AP96 P20 पिपेट सुझावों को साफ और µ से ७०% ेतोः के ७० P7 एल, तो उंहें मल्टीचैनल टिप धोने ALP में धोने और पानी की एक ११०% मात्रा चार बार वितरण ।
- दोहराएँ चरण १.८-P8 और P9 पर प्लेटों की दूसरी जोड़ी के लिए १.९. दूसरी ९६-अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने प्लेट बनाने पर, नीचे से ऊपर के क्रम में प्लेटें ढेर: P9, P5, P8, और पी 4 । फिर, एक खाली स्थैतिक ALP पर स्टैक रखें; या तो P1, P2, P6, P10, P11, P12, या P13 ।
- दोहराएं चरण १.६-१.१० तक होटल में 5 कमरा खाली है । दोहराएं कमरे तक पहुंचने पर १.५ चरण 6, नई AP96 P20 पिपेट युक्तियां लोडर ALP और एक खाली स्थैतिक AP96 पर इस्तेमाल P20 पिपेट ALP युक्तियां रखने के लिए सुझाव ।
- दोहराएं चरण १.६-१.१० तक होटल A के कक्ष 9 खाली है । हालांकि, होटल बी के लिए आगे बढ़ने के क्रम में, डेक पर प्लेटें और सुझावों होटल ए में पुनः लोड किया जाना चाहिए ।
- फिर से भरना, हाथ से ३०० मिलीलीटर जल जलाशय । यह कदम महत्वपूर्ण है, और कंप्यूटर प्रोग्राम एक इस संदेश का ब्यौरा थामने को शामिल कर सकते हैं, को हिट करने के लिए उपयोगकर्ता की आवश्यकता ' जारी रखें ', अगले कदम उठाने से पहले.
- दोहराएं १.५-१.१३ शेष होटल के लिए, एक पूर्ण ३०० मिलीलीटर पानी जलाशय हर बार अगले होटल के लिए आगे बढ़ने से पहले सुनिश्चित करने के लिए ।
2. मीडिया-बीज मिश्रण को स्क्रीनिंग प्लेटों में जोड़ना
- ०.१% के साथ ½ Murashige और Skoog (एमएस) मीडिया बनाओ ४.३ ग्राम एमएस साल्ट के अलावा द्वारा आगर, ०.५० g एमईएस, १.० g आगर को 1 एल डि एच2O. ph को ५.७ के लिए समायोजित करें हालांकि 5 एम पोटेशियम हीड्राकसीड के अलावा पीएच जांच के साथ निगरानी करते हुए ।
- उंहें 1% ब्लीच और 15 और 30 मिनट के बीच एसडीएस में मिलाकर बीज निष्फल, और फिर कुल्ला 4 बार पानी की एक बराबर मात्रा के साथ केंद्रापसारक द्वारा । बीज बाँझ हो एक बार, उन्हें vernilization के लिए 7 दिनों के लिए 24 घंटे से 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह है । Arabidopsis जैविक संसाधन केंद्र नसबंदी, vernilization, और विकास के22के अतिरिक्त तरीकों का वर्णन करता है ।
- ०.१ g/100 मिलीलीटर के घनत्व पर हाथ से मीडिया में बीज जोड़ें । यह एक ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 3-10 बीज के एक औसत में घनत्व परिणाम ।
- जगह, हाथ से, ४ ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटें 1 कमरे में और होटल के 2 एक (चित्रा6, होटल ए) । टिप लोडर ALP पर AP96 P250 पिपेट युक्तियों का एक बॉक्स प्लेस, एक ३०० मिलीलीटर मीडिया बीज मिश्रण के साथ भरा कदम २.१-पी 3 पर २.३, और एक ३०० मिलीलीटर ेतोः पर ७०% P7 से भरा जलाशय (चित्रा 4, डेक और चित्रा 6 , डेक) ।
नोट: २.५ के माध्यम से २.८ ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है । - वर्तमान कमरे 1 और 2 होटल में एक, और चार प्लेटों के ढेर अलग । प्रत्येक खाली स्थिर आल्प्स (पी 4, P5, P6, P8, P9, P10, P11, और P12) पर एक थाली प्लेस । लोड AP96 P250 पिपेट टिप्स ऑन द ९६-चैनल २०० µ l Head.
- महाप्राण ३०० एमएल मीडिया से ९० µ एल पी पी पर बीज जलाशय और पहले ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे थाली में बांटना । इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक सभी आठ प्लेटों मीडिया बीज मिश्रण होते हैं.
- µ पर ७०% ेतोः से भरे ३०० मिलिक जलाशय से ७० P7 l को aspirating और औषधालय द्वारा AP96 P250 पिपेट सुझावों को साफ करें । मल्टीचैनल टिप धोने ALP में सुझावों aspirating द्वारा धोने और पानी की एक ११०% मात्रा चार बार वितरण, TL1 पर सुझाव उतारना, और हाथ से प्लेटें इकट्ठा ।
3. छोटे अणुओं को स्क्रीनिंग प्लेटों में जोड़ना
- लोड, हाथ से, कमरे में AP96 P250 पिपेट टिप्स का एक बॉक्स होटल के 1, २ ९६-अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने वाली पुस्तकालय प्लेटों में कमरे 2, 4, 6, और 8, और २ ९६ अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेटों में 3, 5, 7, और 9( चित्रा 4 , स्टेकर और चित्रा 7, होटल ए) । इसके अतिरिक्त, 5 गैलन जलाशय के लिए और मल्टीचैनल टिप धो ALP से hoses कनेक्ट ।
नोट: ३.२ के माध्यम से ३.१० ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है । - P7 पर एक ३०० मिलीलीटर ७०% ेतोः धोने जलाशय शामिल करने के लिए डेक कॉंफ़िगर करें; मीडिया बीज जलाशय पी3 (चित्रा 4, डेक और चित्रा 7, डेक) पर डेक पर छोड़ दिया जा सकता है । साथ ही, मल्टीचैनल Tip वॉश ALP के माध्यम से पानी प्रसारित करने के लिए डिवाइस नियंत्रक के कनेक्शन के माध्यम से कंसोल ड्राइव पर चालू करें । यह प्रोटोकॉल के अंत में स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा ।
- AP96 P250 पिपेट टिप बॉक्स होटल से एक और यह टिप लोडर ALP के लिए ले जाने के लिए प्रस्तुत करते हैं ।
- वर्तमान ९६-अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने वाली पुस्तकालय प्लेटें होटल के 2 कमरे से डेक करने के लिए और स्थिर ALP पी 4 पर एक जगह और P8 पर एक । वर्तमान ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेट से कमरे 3 होटल के एक डेक के लिए और स्थिर ALP P5 पर एक जगह है और P9 पर एक ।
- लोड AP96 P250 पिपेट युक्तियां लोडर ALP के साथ ९६-चैनल २०० µ l सिर पर सुझाव ।
- aspirating द्वारा पी 4 पर ९६-अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने वाली प्लेट मिश्रण और वितरण ५० µ एल तीन बार । निंनलिखित है कि, इस थाली से महाप्राण 10 µ एल और P5 पर ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेट में बांटना ।
- aspirating द्वारा P5 पर थाली में समाधान मिश्रण और ५० µ एल तीन बार वितरण । aspirating द्वारा इथेनॉल के साथ AP96 P250 पिपेट सुझावों को साफ और µ में जलाशय से ७०% ेतोः के ७० P7 एल वितरण और फिर मल्टीचैनल टिप धोने ALP में सुझावों को धोने और पानी की एक ११०% मात्रा चार बार वितरण ।
- दोहराएं चरण ३.५ और ३.६ के लिए दूसरा ९६-अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने लाइब्रेरी प्लेट (P8) और ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेट (P9) ।
- ढेर २ ९६-अच्छी तरह से वी नीचे कमजोर पड़ने वाले पुस्तकालय प्लेट एक साथ और २ ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेट एक साथ । स्थिर आल्प्स P1, P2, P6, P10, P11, P12, या P13 के लिए प्लेटों हटो ।
- दोहराएँ चरण ३.४-३.९ तीन बार, स्क्रीनिंग प्लेटों के लिए पतला रसायनों को जोड़ने के कुल आठ बार. अंत में, दृश्य अनुरूपता के माध्यम से स्क्रीनिंग प्लेटों के प्रत्येक कुआं में बीज की संख्या की जांच करें और अतिरिक्त निष्फल और वसंत बीज से कम तीन बीज के साथ उन कुओं के पूरक ।
4. मशीन और स्क्रीनिंग प्लेटों के दृश्य
- एक सुखाना प्रूफ कंटेनर में एक 16/8 प्रकाश पर 22 डिग्री सेल्सियस पर एक पर्यावरण चैंबर में चार दिनों के लिए ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेटें । एक विदारक खुर्दबीन के नीचे ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे स्क्रीनिंग प्लेट कल्पना । आगे की जांच के लिए सभी ंयायपालिका phenotypes रर ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
की क्षमता को सही और कुशलता से एक विदारक खुर्दबीन के नीचे स्क्रीनिंग सांद्रता में छोटे अणुओं के अलावा पर आधारित phenotypes की विशेषता Arabidopsis पर आगे रासायनिक आनुवंशिकी की इस विधि का अंत लक्ष्य है। phenotypes मनाया जब सभी ५०,००० यौगिकों विविध था दिखलाई दिया गया था और कई अलग वर्गों में टूट सकता है (चित्रा 2). चित्र 3 ए -एफ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कम आवर्धन पर मनाया गया कि phenotypes के उदाहरण को दर्शाया गया है । कुछ phenotypes अनिर्णायक परिणाम (चित्रा 3 जी, एच) प्रदान की है । ये कम सांद्रता पर retested करने के लिए सुनिश्चित करें कि रासायनिक एक कम मात्रा में एक अलग phenotype प्रदान नहीं किया था ।
गरीब परिणाम कई कारणों से पैदा कर सकते हैं । एक गरीब बीज की अंकुरण दर है । यह एक स्क्रीनिंग प्लेट मुख्य रूप से कोई अंकुरण या अपूर्ण अंकुरण phenotypes (चित्रा 3 जी, एच), जो भ्रामक हो सकता है प्रदर्शन करने के लिए कारण हो सकता है । इस पर काबू पाने के लिए, पूर्व परीक्षण सभी बीजों के लिए अंकुरण दरों का इस्तेमाल किया । एक बार अंकुरण दरों की स्थापना की गई है, और Arabidopsis के लिए ९५% से अधिक कर रहे हैं, रासायनिक अतिरिक्त करने से पहले बीज की vernalization एक साथ अंकुरण सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । एक साथ अंकुरण की कमी phenotyping में झूठी सकारात्मक के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस के अलावा, गरीब परिणाम अगर मीडिया को गर्मी के दौरान वाष्पीकरण की अनुमति दी है पैदा कर सकते हैं । जलयोजन की यह कमी बीज अंकुरण से बचाता है और सुखाना प्रूफ कंटेनरों के उपयोग के माध्यम से बचा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, DMSO और मीडिया समाधान हर थाली के दो बाहरी स्तंभों में हैं, उचित सूक्ष्म जलवायु और अंकुरण की दर सुनिश्चित प्राप्त कर रहे हैं ।
संतोषजनक प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब अंकुरण की दर हैं > 95%, बीज ९६ में इसके अलावा करने से पहले वसंतित कर रहे हैं-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटें, एक साथ अंकुरण सुनिश्चित करने, और मीडिया मशीन के दौरान लुप्त नहीं होता है. आदर्श रूप में, रसायनों एक एकाग्रता है कि सभी बीज अंकुरित और phenotypes सही मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है पर परीक्षण किया जाएगा (आंकड़ा 3एएफ) । उपचार के बहुमत phenotypes के साथ कि नेत्रहीन थे नकली नियंत्रण से रूपात्मक phenotypes (चित्रा 3) के साथ अंकुरित का उत्पादन किया, ंयायपालिका phenotypes के विशाल बहुमत के साथ शामिल ब्लीच और गंभीर रूप से अवरुद्ध जड़ें (चित्रा 2) ।
चित्रा 2: सबसे आम phenotypes मनाया और प्रत्येक phenotype के अनुपात मनाया. a) कुल ३,२७१ छोटे अणुओं को चार दिन की मशीन के बाद १०० µ मीटर पर क्रियाशील पाया गया । रंग phenotype की गंभीरता को इंगित करता है (काले = अधिक गंभीर, सफेद = कम गंभीर) । सबसे अधिक मनाया phenotype रूट आकृति विज्ञान के लिए संबंधित, से अधिक १,५०० यौगिकों उत्प्रेरण गंभीरता अलग की जड़ें प्रेरित. रंगाई भी सामांयतः इस पुस्तकालय में यौगिकों से प्रभावित था, १,१४८ अंकुर के साथ पूरी तरह से प्रक्षालित या आंशिक रूप से फीका पड़ा हुआ । बस के तहत ४०० यौगिकों विशिष्ट रूट हेयर phenotypes का उत्पादन-या तो स्टंट या दोनों स्टंट और चमकीले रंग का । अंत में, सिर्फ २०० यौगिकों के तहत अंकुरण प्रभावित हुआ । इन मामलों में, बीज या तो अंकुरण पूरा नहीं किया या अंकुरित होना शुरू भी नहीं किया । ख) जड़ आकृति विज्ञान में असामान्यताओं का प्रदर्शन अंकुर, या तो स्टंट या गंभीर रूप से अवरुद्ध किया जा रहा है, सभी phenotypically ंयायपालिका अंकुरों के लगभग आधे का गठन. अगला सबसे बड़ा समूह उन है कि प्रक्षालित या फीका पड़ा हुआ अंकुर के परिणामस्वरूप थे । Phenotypes कि जड़ बाल विषमताओं से संबंधित भी एक बड़ा हिस्सा बना दिया, जबकि अंकुरण के निषेध, या तो कोई अंकुरण या अपूर्ण अंकुरण, केवल सभी के एक छोटे प्रतिशत में हुआ सक्रिय यौगिकों । अंत में, वहां phenotypes कि इतनी कम आवृत्ति पर हुई के एक नंबर थे, वे ' श्रेणी में वर्गीकृत किया गया ' अंय, एक उदाहरण है जो ग्रीन कफ का उत्पादन था, चित्रा 3में देखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: प्रतिनिधि phenotypes की छवियां आगे रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन के दौरान मनाया । कोई दिखाई रूपात्मक विषमताओं (A), भूरे रंग की जड़ बाल (B), अवरुद्ध रूट (C), गंभीर रूप से स्टंट किए गए रूट (D), ब्लीच्ड (E), हरा कफ (F), अपूर्ण अंकुरण (G), और कोई अंकुरण (H). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: प्रोटोकॉल की दीक्षा से पहले स्टेकर 10 और डेक की स्थापना का अवलोकन. स्टेकर हिंडोला चार स्टेकर है 10 (एक होटल डी) जो प्रत्येक दस कमरे को समायोजित शामिल है । डेक आल्प्स की एक किस्म रखती है: टिप लोडर, स्टेकर शटल, मल्टीचैनल टिप धोने, और 13 स्थैतिक आल्प्स । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: स्टेकर 10 और एक कमजोर पड़ने वाली पुस्तकालय बनाने के लिए आवश्यक डेक की स्थापना की । चार स्टेकर 10 के बक्से के साथ लोड कर रहे है AP96 P20 पिपेट सुझावों के कमरे में 1 और होटल के 6 a-d और ४ ९६ के ढेर-अच्छी तरह से वी कमरों में नीचे प्लेटें 2-5 और होटल के कमरे 7-9 a-d । डेक लेआउट स्थिर आल्प्स पी पी और P7 पर २ ३०० मिलीलीटर जलाशयों के होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: स्टेकर 10 और डेक को स्क्रीनिंग प्लेटों के लिए मीडिया बीज मिश्रण जोड़ने के लिए स्थापित । स्टेकर 10 ४ ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटें 1 कमरे में और होटल के 2 के साथ भरी हुई है । डेक लेआउट स्थिर आल्प्स पी सी और P7 और TL1 पर AP96 P250 पिपेट सुझावों का एक बॉक्स पर २ ३०० मिलीलीटर जलाशयों के होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 7: स्टेकर 10 और डेक को स्क्रीनिंग प्लेटों के लिए छोटे अणुओं को जोड़ने के लिए स्थापित । स्टेकर 10 कमरे में AP96 P250 पिपेट सुझावों के एक बॉक्स के साथ भरी हुई है 1, एक २ ९६ के ढेर-अच्छी तरह से वी नीचे कमरे 2, 4, 6, और 8 में कमजोर पड़ने वाली प्लेटें, और २ ९६ के ढेर-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटें मीडिया से भरा-3 कमरों में बीज मिश्रण , 5, 7, और 9 । डेक लेआउट स्थिर आल्प्स पी पी और P7 पर २ ३०० मिलीलीटर जलाशयों के होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल Arabidopsis पर एक आगे रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन को पूरा करने में शोधकर्ताओं सहायता के लिए डिज़ाइन किया गया है । हम ५०,००० यौगिकों (चित्रा 2 और चित्रा 3) की एक स्क्रीन से प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं, एक सबसे बड़ा आगे रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन करने के लिए Arabidopsis पर प्रदर्शन किया दिनांक9,13,23. एक तरल हैंडलिंग रोबोट के उपयोग और अधिक कुशल कमजोर पड़ने पुस्तकालय और स्क्रीनिंग पुस्तकालय पीढ़ी सक्षम, गति और उपंयास यौगिकों की पहचान की क्षमता में सुधार । एक उच्च प्रवाह प्रकृति में स्क्रीन करने के लिए क्षमता में वृद्धि शोधकर्ता की ओर से घटते श्रम के साथ था । इस तकनीक के साथ इस्तेमाल किया जा डिजाइन किया गया था ९६-अच्छी तरह से प्लेटें, जो छोटे बीज या एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई पौधों को समायोजित कर सकते हैं । बड़े कुओं के साथ प्लेट का उपयोग करने के लिए बड़े बीज फिट प्रवाह और डिजाइन में संशोधनों की आवश्यकता होगी ।
इस तकनीक की अतिरिक्त सीमाएं अपूतित तकनीकों के साथ उपकरणों के इस टुकड़े का उपयोग करने की कठिनाई शामिल हैं; हालांकि, हम ½ एमएस मीडिया कमी सुक्रोज के कारण संदूषण के उच्च प्रतिशत का सामना नहीं किया । एक एक बाँझ कमरे में रोबोट रखकर किसी भी प्रदूषण मुद्दे को दरकिनार, बाँझ शर्तों और सेल संस्कृति, या एक बाँझ चैंबर के साथ एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करके के लिए अनुमति दे सकता है24,25. एक और सीमा टिप आकार और बीज आकांक्षा है । ऐसे AP96 P20 के रूप में एक छोटे पिपेट टिप बीज के साथ रोकना होगा; इसलिए, एक बड़ा पिपेट टिप बीज वितरण और समाधान मिश्रण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम कमजोर पड़ने वाले पुस्तकालय और स्क्रीनिंग पुस्तकालय में सभी प्लेटों की सावधान लेबलिंग, सुनिश्चित करना है कि वे सही क्रम के साथ उचित अभिविंयास में है जब रोबोट खिला शामिल हैं । स्पष्ट लेबलिंग और व्यवस्थित प्रसंस्करण सीधा है और इस मुद्दे को दूर कर सकते हैं । एक और महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि सही उपकरण प्रयोग शुरू करने से पहले सही जगह में है, दोनों के भीतर स्टेकर 10 और डेक पर । यदि उपकरण डेक पर ठीक से नहीं रखा गया है, ९६-चैनल २०० µ एल सिर दुर्घटना सकता है, साधन और रखरखाव की आवश्यकता को नुकसान पहुँचाए । एक और महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि तरल की सही मात्रा ३०० मिलीलीटर जलाशयों के भीतर रखा गया है और यह कि इस राशि को सही ढंग से सॉफ्टवेयर में प्रवेश किया है । यदि संख्या मैच नहीं है, युक्तियां तरल तक पहुंच नहीं होगा और आकांक्षा नहीं हो जाएगा ।
यह भी सुनिश्चित करने के लिए कदम उठाने के लिए आवश्यक है कि परिणाम प्राप्त सही हैं । एक त्रुटि है कि हम जबकि प्रोटोकॉल विकसित देखा जीवन टिप से जुड़ा हुआ था । लगातार लोड हो रहा है और उतराई के बाद, सुझावों को महाप्राण और सही ढंग से वितरित करने की क्षमता खो देते हैं । इसलिए यह आवश्यक है कि ९६ युक्तियों का प्रत्येक सेट अधिकतम चार बार उपयोग किया जाता है. यह भी जरूरी है कि रसायनों के लिए क्षमता से बचने के लिए नियमित रूप से धोने के पानी को बदलने के लिए अनजाने में स्क्रीनिंग प्लेटों में जोड़ा । अंत में, कुछ रसायनों के समाधान के बाहर हाला की प्रवृत्ति है26। प्रत्येक रासायनिक सही एकाग्रता में जोड़ा जाता है सुनिश्चित करने के लिए, मिश्रण कदम कमजोर पड़ने और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में शामिल कर रहे हैं । मिश्रण करने के लिए विफलता पुस्तकालय से पुस्तकालय के लिए जोड़ा जा रहा है रसायनों की कम मात्रा में परिणाम, संभावित रासायनिक प्रेरित phenotypes की व्याख्या को चुनौती दे सकता है.
प्रोटोकॉल के प्रत्येक भाग के लिए सही प्लेटों का उपयोग करना भी बहुत महत्वपूर्ण है । V-नीचे प्लेटें तरल की छोटी मात्रा aspirated जा सकता है और कमजोर पड़ने पुस्तकालय के निर्माण में उपयोग के लिए सिफारिश कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । हालांकि, इन प्लेटों प्रोटोकॉल के स्क्रीनिंग भाग के लिए उपयुक्त नहीं हैं, प्रकाश के अपने प्रतिबिंब के बाद से phenotypes के गरीब दृश्य की ओर जाता है । 3-4 दिन पुराने अंकुरों के phenotypes का निरीक्षण करने के लिए, स्क्रीन को फ्लैट के नीचे प्लेटों में रखना होगा ।
एक बार स्क्रीनिंग प्लेट बनाया गया है, दृश्यावलोकन की आवश्यकता है. ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेटों विदारक सूक्ष्मदर्शी के तहत आसान दृश्य की अनुमति । यह आवश्यक है कि मीडिया के वाष्पीकरण को कम करने के लिए प्लेटें सुखाना प्रूफ कंटेनरों में जमा की जाएं । सूक्ष्म दृश्य के लिए एक विकल्प एक उच्च संकल्प स्कैनर का उपयोग कर रहा है । उच्च संकल्प पर उत्पादित छवियां इस स्क्रीन में मनाया phenotypes के बहुमत से पता चलता है और परिणाम है कि भविष्य में दोबारा गौर किया जा सकता है की एक संग्रह प्रदान करते हैं । एक बार दृश्य पूरा हो गया है, और अपनी पसंद की लाइब्रेरी दिखलाई, इस विधि तो विभिन्न जीवों पर या एक अलग रासायनिक पुस्तकालय के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है. उपकरण में संशोधन बाँझ संस्कृति के लिए अनुमति दे सकता है, स्टेम सेल के स्थानों में उद्यम की अनुमति, कवक, कीड़ों, और छोटे पौधों2,18,25,27।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम Jozsef सारस, Mitchel रिचमंड, Jarrad Gollihue, और Andrea सांचेज रचनात्मक और महत्वपूर्ण चर्चा के लिए धंयवाद । Sharyn पेरी phenotypic फोटोग्राफ्स के लिए डॉ. यह सामग्री सहकारी समझौते No १३५५४३८ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
