Summary
En høj overførselshastighed skærm af syntetiske små molekyler blev gennemført på model plantearter, Arabidopsis thaliana. Denne protokol, udviklet til et flydende håndtering robot, øger hastigheden af fremad kemiske genetik skærme, fremskynde opdagelsen af nye små molekyler påvirker plantefysiologi.
Abstract
Kemiske genetik anvendes i stigende grad til at afkode træk i planter, der kan være genstridige at traditionelle genetik på grund af genet redundans eller dødelighed. Men sandsynligheden for et syntetisk lille molekyle bliver bioaktive er lav; Derfor, tusindvis af molekyler skal afprøves for at finde dem, af interesse. Flydende håndtering robotics systemer er designet til at håndtere store mængder prøver, øge den hastighed, hvormed en kemisk bibliotek kan blive screenet ud over at minimere/standardisering fejl. At opnå en høj overførselshastighed fremad kemiske genetik skærm af et bibliotek af 50.000 små molekyler på Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protokoller ved hjælp af en bænk-top multikanals væske håndtering robot blev udviklet som kræver minimal tekniker inddragelse. Med disse protokoller, blev 3,271 små molekyler opdaget der forårsagede synlige fænotypiske forandringer. 1,563 forbindelser induceret korte rødder, 1,148 forbindelser ændret farvning, 383 forbindelser forårsaget rod hår og andre, ikke kategoriseret, ombygninger og 177 forbindelser hæmmet spiring.
Introduction
I de sidste 20 år har forskere inden for Plantebiologi gjort store fremskridt ved hjælp af kemiske genetik tilgange, både frem og bak, forbedre vores forståelse af cellevæggen biosyntesen, cytoskeleton, hormon biosyntese og signalerer, gravitropism, patogenese, purin biosyntese og endomembrane handel med1,2,3,4,5. Ansætte fremad kemiske genetik teknikker giver mulighed for identifikation af fænotyper af interesse og gør det muligt for forskere at forstå de genotypiske fundament for bestemte processer. Omvendt, omvendt kemiske genetik opsøger kemikalier, der interagerer med en forudbestemt protein mål6. Arabidopsis har været på forkant med disse opdagelser i Plantebiologi, fordi dens genom er små, kortlagt, og kommenteret. Det har en kort generationstid, og der er flere mutant/reporter linier til rådighed til at lette identifikationen af afvigende subcellulært maskiner7.
Der er to flaskehalse, der langsomt fremskridt frem kemiske genetiske skærme, den indledende screening proces og fastsættelse af mål for sammensat af interesse8. En større støtte i at øge hastigheden af lille molekyle udvalg er brug af automatisering og automatiseret udstyr9. Flydende håndtering robotter er et fremragende værktøj til håndtering af store biblioteker af små molekyler og har medvirket i driving fremskridt i biologiske videnskaber10. Protokollen præsenteres her er designet til at afhjælpe flaskehalsen tilknyttet screeningsprocessen, muliggør identifikation af bioaktive små molekyler i et hastigt tempo. Denne teknik reducerer byrden af arbejdskraft og tid for erhvervsdrivende, mens også mindske de økonomiske omkostninger til princippet investigator.
Hidtil har mest kemisk biblioteker analyseret holdt mellem 10.000 og 20.000 forbindelser, nogle med så mange som 150.000 og nogle med så få som 709,11,12,13,14, 15 , 16. protokol indført heri blev gennemført på et lille molekyle bibliotek af 50.000 forbindelser (Se Tabel af materialer), en af de større fremad kemiske genetik skærme foregår på Arabidopsis til dato. Denne protokol passer med den nuværende tendens til øget effektivitet og hastighed vedrørende fremad kemiske genetik, især da det vedrører herbicid discovery, insekticid discovery, fungicid opdage, narkotikamisbrug opdagelse og kræft biologi17 ,18,19,20,21. Selvom gennemført her med Arabidopsis, kan denne protokol, let tilpasses til cellekulturer, sporer og potentielt selv insekter i Lage i 96-, 384- eller 1536-godt plader. På grund af sin lille størrelse er Arabidopsis indstillet til screening i 96 godt plader. Distribuere frøene jævnt blandt brønde er dog en udfordring. Hånd såning er nøjagtig men arbejdskrævende, og selv om der er enheder designet til at dispensere frø i 96-brønd plader, de er dyre at købe. Vi viser her, hvordan dette trin kan omgås med bare en lille tab i nøjagtighed.
Det overordnede mål med denne metode var at gøre screening et stort kemisk bibliotek mod Arabidopsis mere håndterbare, uden at gå på kompromis nøjagtighed, via brugen af en flydende håndtering robot. Brug af denne metode forbedrer effektiviteten af forskeren ved at reducere den tid, det tager at fuldføre første fortynding serie forvaltning og efterfølgende fænotypiske skærme, giver mulighed for hurtig visualisering af prøver under en dissekere mikroskop, og hurtig identifikation af nye bioaktive små molekyler. Figur 1 viser denne protokol centrale resultater i 4 trin.
Fig. 1: samlede arbejdsproces af skærmbilledet frem kemiske genetik. En oversigt over protokollen kan beskrives med nogle detaljer for hver af de 4 vigtigste skridt. 1: modtager den kemiske bibliotek, 2: gør biblioteket fortynding, 3: at gøre Screening plader og 4: inkubere og visualisere Screening pladerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. at skabe en fortynding bibliotek
- Label 625 fortynding bibliotek plader i hånden, at sikre, at de passer til deres tilsvarende plade fra den kemiske bibliotek. Derudover forbinde i flow og out flow slanger til multikanal Tip vask automatiseret Labware Positioner (ALP) ved at overføre dem via konsollen kørsel til 5 Gallon Reservoir (Se Tabel af materialer).
- Få adgang til computeren og tænde vask pumpen gennem tilslutning af enheden-Controller til multikanal Tip vask ALP for at cirkulere vandet. Dette vil slukke automatisk i slutningen af protokollen.
- Belastning, knyttet i hånden, stabler 10 til stabler karrusel, i følgende rækkefølge i hoteller A - D (figur 4, stabler); en kasse med AP96 P20 Pipette Tips i Room 1, fire 96-brønd V-bundplade i værelser 2-5 med de to øverste plader der indeholder stock koncentrationer fra den bestilte bibliotek og de to nederste plader tømme (figur 5, stabler). Derudover indlæse en kasse med AP96 P20 Pipette Tips i værelse 6, og fire 96-brønd V-bundplade i værelser 7-9 med de to øverste plader der indeholder stock koncentrationer af det bestilte bibliotek og de to nederste plader tømme (figur 5, stabler).
- Sat op, i hånden, dækket med en 300 mL vandreservoir på P3, en 300 mL 70% EtOH bad på P7, Tip Loader ALP (TL1) og multikanal Tip vask ALP (TW1) (figur 4og figur 5, dæk, dæk).
- Du bruger den driver software, præsentere AP96 P20 Pipette Tips fra stabler 10 og flytte dem til Tip Loader ALP.
Bemærk: 1,5 gennem 1.12 alle er gjort med væsken håndtering robot's driver software; Se Tabel af materialer. - Præsentere værelse 2 fra Hotel A og adskille alle fire 96-brønd V-bund plader på dækket, placere nederst to på P4 og P8 og to øverste på P5 og P9 (figur 4).
- Indlæse AP96 P20 Pipette Tips med Tip Loader ALP på 96-kanal 200 µL hoved. Opsug 90 µL fra 300 mL vandreservoir og dispensere i 96-brønd V-fortynding bundpladen på P4. Gentag dette trin for plade på P8.
- Bland den kemiske bibliotek plade på P5 af gentagne sugning og udlevering 15 µL tre gange. Derudover Aspirér 10 µL fra kemiske bibliotek pladen, P5 og dispensere 10 µL til fortynding pladen på P4.
- Bland løsninger af pladen på P4 af gentagne sugning og udlevering 50 µL alt tre gange. Når blandet, ren AP96 P20 Pipette Tips af sugning og udlevering 70 µL af 70% EtOH fra P7, derefter vasker dem i multikanals Tip vask ALP ved sugning og udlevering en 110% volumen vand fire gange.
- Gentag trin 1,8-1,9 til det andet par af pladerne på P8 og P9. Ved at oprette den anden 96-brønd V-fortynding bundplade, stak plader i følgende rækkefølge fra bund til top: P9, P5, P8 og P4. Derefter placere i stakken på en tom statisk ALP; enten P1, P2, P6, P10, P11, P12 eller P13.
- Gentag trin 1,6-1.10 indtil Room 5 i Hotel A er tom. Gentag trin 1.5 nåede plads 6, flytter nye AP96 P20 Pipette Tips til Tip Loader ALP og placere den anvendte AP96 P20 Pipette Tips på en tom statisk ALP.
- Gentag trin 1,6-1.10 indtil værelse 9 af Hotel A er tom. Men for at komme videre til Hotel B, plader og tips på dæk skal genindlæses i Hotel A.
- Re udfylde i hånden, 300 mL vandreservoir. Dette trin er afgørende, og edb-program kan indarbejde en pause, der beskriver denne besked, at brugeren skal hit 'Fortsæt', før han udfører det næste trin.
- Gentag trin 1,5-1.13 for de resterende hoteller, at sikre en fuld 300 mL vandreservoir hver gang inden går videre til det næste hotel.
2. tilføjelse af Media-frø blanding til Screening plader
- Gør ½ Murashige og Skoog (MS) medier med 0,1% Agar ved tilsætning af 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar til 1 L DI H2O. justere pH til 5.7 selv om tilsætning af 5 M kaliumhydroxid mens overvågning med en pH-sonde.
- Sterilisere frøene ved at ryste dem i 1% blegemiddel og SDS mellem 15 og 30 min, og derefter skylles 4 gange med samme rumfang vand ved centrifugering. Når frøene er sterile, placere dem på 4 ° C fra 24 timer til 7 dage for vernilization. Arabidopsis biologiske Resource Center beskriver yderligere metoder til sterilisation, vernilization og vækst22.
- Tilføje frø til medier i hånden på en tæthed af 0,1 g/100 mL. Denne massefylde resulterer i et gennemsnit på 3-10 frø pr. brønd af en 96-brønd plade.
- Sted, ved hånd, fire 96-godt fladskærms-bundplade i værelser 1 og 2 i Hotel A (figur 6, Hotel A). Placer en kasse med AP96 P250 Pipette Tips om Tip Loader ALP, en 300 mL reservoir fyldt med media-frø blanding lavet i trin 2.1-2.3 på P3, og en 300 mL reservoir fyldt med 70% EtOH på P7 (fig. 4, dæk og figur 6 Dæk).
Bemærk: 2,5 gennem 2.8 er færdig med den driver software. - Præsentere værelser 1 og 2 i Hotel A, og adskille stakkene af fire plader. Placer en plade på hver af de tomme statiske alper (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11, og P12). Indlæse AP96 P250 Pipette Tips på 96-kanal 200 µL hoved.
- Opsug 90 µL fra 300 mL media-frø reservoir på P3 og dispensere til den første 96-brønd flade-bundplade. Gentag denne proces, indtil alle otte plader indeholder medier-frø blanding.
- Rengør AP96 P250 Pipette Tips ved sugning og udlevering 70 µL fra 300 mL reservoiret fyldt med 70% EtOH på P7. Vaske tips i multikanals Tip vaske ALP ved sugning og udlevering en 110% volumen vand fire gange og losse tips på TL1 samles pladerne i hånden.
3. tilføjelse små molekyler til Screening plader
- Belastning af hånden, en kasse med AP96 P250 Pipette Tips i Room 1 af Hotel A, to 96-brønd V-bund fortynding bibliotek plader i værelser 2, 4, 6 og 8, og to 96 godt flad bund Screening plader ind i rum 3, 5, 7 og 9 (figur 4 Stabler og figur 7, Hotel A). Derudover forbindelse slanger til og fra multikanal Tip vask ALP til 5 Gallon Reservoir.
Bemærk: 3.2 gennem 3.10 er færdig med den driver software. - Konfigurere dæk til at indeholde en 300 mL 70% EtOH vask reservoir på P7; media-frø reservoir kan stå på dækket på P3 (figur 4og figur 7, dæk, dæk). Derudover tænde konsollen drev gennem tilslutning af enheden-Controller til at cirkulere vandet gennem multikanal Tip vask ALP. Dette vil slukke automatisk i slutningen af protokollen.
- Præsentere AP96 P250 Pipette Tip Box fra Hotel A og flytte det til Tip Loader ALP.
- Præsentere den 96-brønd V-bund fortynding bibliotek plader fra værelse 2 af Hotel A til dæk og sted en statisk ALP P4 og på P8. Præsentere den 96-brønd flade-Screening bundplade fra værelse 3 Hotel a til dæk og placere en på statisk ALP P5 og på P9.
- Indlæse AP96 P250 Pipette Tips med Tip Loader ALP på 96-kanal 200 µL hoved.
- Bland den 96-brønd V-fortynding bundpladen på P4 af sugning og udlevering 50 µL tre gange. Efter denne Aspirér 10 µL fra denne plade og dispensere i 96-godt fladskærms-Screening bundpladen på P5.
- Bland løsninger i pladen på P5 af sugning og udlevering 50 µL tre gange. Rengør AP96 P250 Pipette Tips med ethanol ved sugning og udlevering 70 µL af 70% EtOH fra reservoir på P7 og derefter vaske tips i multikanals Tip vask ALP ved sugning og udlevering en 110% volumen af vand fire gange.
- Gentag trin 3.5 og 3.6 for den anden 96-brønd V-fortynding bibliotek bundpladen (P8) og 96-godt fladskærms-Screening bundpladen (P9).
- Stak to 96-brønd V-bund fortynding bibliotek pladerne sammen og de to 96-godt flad bund Screening plader sammen. Flytte pladerne til statisk Alperne P1, P2, P6, P10, P11, P12 eller P13.
- Gentag trin 3.4-3,9 tre gange, tilføje fortyndet kemikalier til screening plader i alt otte gange. Endelig, kontrollere antallet af frø i hvert hul i screening plader gennem visuelle kropsbygning og supplere disse brønde med færre end tre frø af yderligere steriliseret og vernalized frø.
4. inkubation og visualisering af Screening plader
- Inkuber 96-godt flad bund Screening plader i fire dage i en miljømæssig kammer ved 22 ° C på en 16/8 lys/mørke cyklus i en udtørring bevis beholder. Visualisere 96-godt flad bund Screening plader under et dissekere mikroskop. Optage alle afvigende fænotyper til yderligere undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnen til at præcist og effektivt karakterisere fænotyper baseret på tilsætning af små molekyler på screening koncentrationer under et dissekere mikroskop er det endelige mål for denne metode frem kemiske genetik på Arabidopsis. Fænotyper observeret, når alle 50.000 forbindelser var blevet screenet var forskellige og kan inddeles i flere forskellige klasser (figur 2). Figur 3A -F afbilder eksempler på fænotyper, der blev observeret ved lav forstørrelse under et dissekere mikroskop. Nogle fænotyper givet inkonklusive resultater (figur 3 g, H). Disse skulle testes ved lavere koncentrationer til at sikre, at kemikaliet ikke give en anderledes fænotype ved en lavere dosis.
Dårlige resultater kan opstå af mange grunde. En er dårlig spireevne satser af frøene. Dette kan forårsage en screening plade til overvejende udviser ingen spiring eller ufuldstændig spiring fænotyper (figur 3 g, H), som kan være vildledende. For at overvinde dette, pre-test spiring satser for alle frø anvendes. Når spiring priser er blevet etableret, og mere end 95% for Arabidopsis, er vernalization af frø inden de kemiske tilsættes et afgørende skridt at sikre samtidige spiring. Manglende samtidige spiring kan føre til falske positiver i fænotyper. Ud over dette, kan dårlige resultater opstå hvis medier får lov til at fordampe under inkubation. Denne mangel på hydrering forhindrer frø fra spire og kan undgås ved hjælp af udtørring-bevis containere. Desuden DMSO og medier løsninger i hver tallerken, at sikre ordentlig mikro klimaer to eksterne kolonner og spiring priser er opnået.
Tilfredsstillende eksperimentelle resultater er nået, når spiring priser > 95%, frø er vernalized inden de tilsættes i 96-godt flad bund plader, sikre samtidige spiring, og medier ikke fordamper under inkubation. Ideelt, kemikalier ville være testet ved en koncentration, der giver alle frø til at spire og fænotyper vurderes præcist (figur 3A-F). Fleste behandlinger produceres stiklinger med fænotyper, der var visuelt skelnes fra mock kontrol med ingen morfologiske fænotyper (figur 3A), med det store flertal af afvigende fænotyper bestående af bleget og alvorligt forkrøblede rødder (figur 2).
Figur 2: den mest almindelige fænotyper observeret og andelen af hver fænotype observeret. A) ialt 3,271 små molekyler fandtes for at være bioaktive på 100 µM efter fire dages inkubation. Farven angiver graden af Fænotypen (sorte = mere alvorlige, hvid = mindre alvorlige). De mest almindeligt observerede fænotype vedrørte root morfologi, med mere end 1.500 forbindelser inducerende forkrøblede rødder af varierende sværhedsgrad. Farvning var også almindeligt påvirket af forbindelser i dette bibliotek, med 1,148 frøplanter registreret som helt bleget eller delvist misfarvede. Lige under 400 stoffer produceret markante root hår fænotyper – enten forkrøblede eller begge forkrøblede og farvestrålende. Endelig, spiring var påvirket af lige under 200 forbindelser. I disse tilfælde frø enten komplet ikke spireevne eller selv begynder ikke at spire. B) stiklinger udviser abnormiteter i roden morfologi, enten bliver forkrøblet eller alvorligt hæmmet, udgjorde næsten halvdelen af alle fænotype afvigende frøplanter. Den næste største gruppe var dem, der resulterede i bleget eller misfarvet frøplanter. Fænotyper, der vedrørte rod hår abnormiteter også gjort en betragtelig del mens hæmning af spiring, enten ingen spiring eller ufuldstændig spiring, kun forekom i en lille procentdel af alle bioaktive stoffer. Endelig var der en række fænotyper, der fandt sted på sådan en lav frekvens, de var grupperet i kategorien 'andre', hvoraf et eksempel var produktionen af grøn planteslim, ses i figur 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: billeder af repræsentative fænotyper observeret under skærmbilledet frem kemiske genetik. Ingen synlige morfologiske abnormiteter (A), brun rodtråde b, forkrøblede root c, alvorligt hæmmet root (D), blegede (E), grøn planteslim (F), ufuldstændige spiring (G) og ingen spiring (H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: oversigt over stabler 10 og dæk, der er oprettet før indledningen af protokollen. Stabler karrusel består af fire stabler 10's (hoteller A - D) som hver rumme 10 værelser. Dæk holder en bred vifte af Alperne: Tip Loader, stabler Shuttle, multikanal Tip vask og 13 statisk Alperne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: stabler 10 og dæk opsætning af nødvendige for at skabe en fortynding bibliotek. De fire stabler 10 er fyldt med kasser med AP96 P20 Pipette Tips i værelser 1 og 6 over hoteller A - D og stakke af fire 96-brønd V-bundplade i rum 2-5 og værelser 7-9 i hoteller A - D. Dæks-layout består af to 300 mL reservoirer på statisk Alperne P3 og P7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: stabler 10 og dæk, der er oprettet for at tilføje Media-frø blanding til Screening plader. Stabler 10 er indlæst med fire 96-godt flad-bundplade i værelser 1 og 2 af Hotel A. Dæks-layout består af to 300 mL reservoirer på statisk Alperne P3 og P7 og en kasse med AP96 P250 Pipette Tips på TL1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: stabler 10 og dæk, der er oprettet for at tilføje små molekyler til Screening plader. Stabler 10 er fyldt med en kasse med AP96 P250 Pipette Tips i Room 1, en stak af to 96-brønd V-bund fortynding plader i værelser, 2, 4, 6, og 8 og en stak af to 96-godt fladskærms-bundplade fyldt med media-frø blanding i værelser 3 , 5, 7 og 9. Dæks-layout består af to 300 mL reservoirer på statisk Alperne P3 og P7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol er designet til at hjælpe forskere med at udføre en fremadrettet kemiske genetik skærm på Arabidopsis. Vi give repræsentative resultater fra en skærm af 50.000 forbindelser (figur 2 og figur 3), en af de største fremskudte kemiske genetik skærme udføres på Arabidopsis til dato9,13,23. Brugen af en flydende håndtering robot aktiveret mere effektiv fortynding bibliotek og screening bibliotek generation, forbedring af hastighed og effektivitet af identifikation af nye forbindelser. Øge kapaciteten til skærmen i en høj overførselshastighed natur var ledsaget af faldende arbejdskraft for forskeren. Denne teknik var designet til at bruges med 96 brønde plader, som kan rumme små frø eller planter ses under et mikroskop for dissekere. Udnytte plader med større wells til at passe større frø ville kræve ændringer i produktion og design.
Yderligere begrænsninger af denne teknik omfatter vanskeligheden ved hjælp af dette stykke udstyr med aseptisk teknik; vi dog ikke støder på høje procenter af forurening på grund af ½ MS medier mangler saccharose. Man kunne omgå enhver forurening spørgsmålet ved at placere robotten i en steril værelse, giver mulighed for sterile forhold og cellekultur, eller ved hjælp af en flydende håndtering robot med en steril afdeling24,25. En anden begrænsning er tip størrelse og frø aspiration. En lille pipette tip som AP96 P20 ville blokere med frø; Derfor skal en større pipette tip bruges til frø udlevering og løsning blanding.
Kritiske trin i denne protokol omfatter den omhyggelig mærkning af alle plader i den fortynding og screening biblioteket, at sikre de er i den korrekte orientering sammen med rigtige rækkefølge, når fodring robotten. Klar mærkning og systematisk behandling er ligetil og kan afhjælpe dette problem. En anden kritisk trin er at sikre, at det rigtige udstyr er det korrekte sted før du starter eksperimentet, både inden for stabler 10 og på dækket. Hvis udstyret ikke er korrekt placeret på dækket, 96-kanal 200 µL hoved kunne crash, beskadige apparatet og kræver vedligeholdelse. En anden kritisk trin er at sikre, at den korrekte mængde væske er placeret i 300 mL reservoirer og at dette beløb er indtastet korrekt i softwaren. Hvis tallene ikke stemmer overens, tips vil ikke nå væsken og aspiration vil ikke forekomme.
Det er også nødvendigt at tage skridt til at sikre, at resultaterne er korrekte. En fejl, som vi bemærkede samtidig udvikle protokollen var forbundet med tip liv. Efter successive lastning og losning, mister tips deres evne til at Aspirér og dispensere præcist. Det er derfor bydende nødvendigt, at hvert sæt af 96 tips bruges maksimalt fire gange. Det er også vigtigt at ændre vaskevand regelmæssigt for at undgå risikoen for kemikalier skal føjes uforvarende til screening plader. Endelig har nogle kemikalier en tendens til at udfælde af løsning26. For at sikre, at hvert kemikalie er tilføjet i den korrekte koncentration, indarbejdes blande trin i fortynding og screening protokol. Undladelse af at blande kunne resultere i små mængder af kemikalier er tilsat fra bibliotek til bibliotek, udfordrende fortolkning af potentiale kemisk induceret fænotyper.
Ved hjælp af de korrekte plader for hver del af protokollen er også meget vigtigt. V-bundplade er designet til at sikre, at små mængder af væske kan være indsugning og anbefales til brug i skabelsen af biblioteket fortynding. Men disse plader er ikke egnet til screening del af protokollen, da deres refleksion af lys fører til dårlig visualisering af fænotyper. For at observere fænotyper af 3-4 dag gamle kimplanter, skal skærmen foretages i fladbundede plader.
Når screening plader er blevet oprettet, er visualisering påkrævet. 96-brønd fladbundede plader tillade let visualisering under dissekere mikroskoper. Det er bydende nødvendigt, at pladerne er gemt i udtørring-bevis beholdere for at reducere fordampningen af medierne. Et alternativ til mikroskopiske visualisering ved hjælp af en høj opløsning scanner. Billeder produceret med høj opløsning afslører størstedelen af fænotyper observeret i denne skærm og give et arkiv over de resultater, der kan revideres i fremtiden. Når visualisering er fuldført, og biblioteket for dit valg screenet, skal denne metode kunne derefter udføres, på forskellige organismer eller med et andet kemisk bibliotek. Ændringer til udstyret, som kan tillade sterile kultur, så ventures i riger af stamceller, svampe, insekter og små planter2,18,25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue og Andrea Sanchez for konstruktiv og kritisk diskussion. Dr. Sharyn Perry for de fænotypiske fotografier. Dette materiale er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Cooperative aftale nr. 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
