Summary
Высокая пропускная способность экрана синтетических малых молекул было проведено на модели видов растений, Arabidopsis thaliana. Этот протокол, разработанный для обработки жидких робот, увеличивает скорость вперед химических генетики экранов, ускоряя открытие новых малых молекул, затрагивающих физиологии растений.
Abstract
Химические генетики все чаще используется для декодирования черты в растениях, которые могут быть непокорных для традиционных генетика ген избыточности или летальность. Однако низка вероятность синтетических малые молекулы, будучи биоактивные; Таким образом для того, чтобы найти те интерес должен испытываться тысячи молекул. Жидкость, робототехники, которые предназначены для обработки большого количества образцов, увеличивая скорость, с которой химические библиотека может проверяться в дополнение к минимуму/стандартизации ошибка обработки. Для достижения высок объём вперед химических генетики экран библиотеки 50000 малых молекул на Arabidopsis thaliana (арабидопсиса), протоколов с помощью многоканальных жидкость стендовые обработки робот были разработаны, которые требуют минимальный техник участие. С помощью этих протоколов были обнаружены 3 271 малых молекул, что вызвало видимые фенотипические изменения. 1,563 соединений индуцированной коротких корней, 1148 соединений изменения окраски, 383 соединений вызвало корневого волоска и другие, не классифицированы, изменения и 177 соединений препятствует прорастанию.
Introduction
В последние 20 лет исследователи в области биологии растений добились больших успехов с помощью химических генетики подходов, как вперед, так и обратного, улучшение нашего понимания биосинтез клеточной стенки, цитоскелета, биосинтеза гормонов и сигнализации, Геотропизм, патогенез, биосинтез пуриновых и endomembrane торговля1,-2,-3,-4,-5. Использование техники вперед химических генетики позволяет идентифицировать фенотипов интерес и позволяет исследователям понять генотипической основ конкретных процессов. И наоборот обратная химическая генетики ищет химических веществ, которые взаимодействуют с заранее белка цели6. Arabidopsis был на переднем крае этих открытий в биологии растений, потому что его генома мал, сопоставления и с комментариями. Она имеет короткий поколения время, и есть несколько линий мутант/репортер для облегчения идентификации аберрантных субцеллюлярные машин7.
Существует два основных узких мест, которые замедляют прогресс вперед химических генетических экранов, первоначальный процесс отбора и определения целевого объекта соединения интерес8. Основных помощь в увеличении скорости выделения малых молекул является использование автоматизации и автоматизированное оборудование9. Обработка жидких роботы являются отличным инструментом для обработки больших библиотек малых молекул и сыграли важную роль в стимулировании прогресса в биологических наук10. Здесь представлены протокол предназначен для облегчения узкое место, связанное с процессом отбора, способствующих выявлению биоактивные малых молекул быстрыми темпами. Этот метод уменьшает бремя труда и времени от имени оператора, а также снижение экономической стоимости принцип следователь.
К настоящему времени проанализированы наиболее химических библиотек провели между 10000 и 20000 соединений, некоторые с как 150,000 и некоторые с всего лишь 709,11,12,13,14, 15 , 16. Протокол представил здесь был реализован на маленькой молекулы библиотеки 50000 соединений (см. Таблицу материалы), один из больших вперед химических генетики экраны проводятся на Arabidopsis до настоящего времени. Этот протокол соответствует нынешней тенденции к повышению эффективности и скорости относительно вперед химических генетики, особенно что касается обнаружения гербицидов, инсектицидов обнаружения, фунгицид обнаружить, наркотиков, обнаружения и биологии рака17 ,18,19,,2021. Хотя и здесь реализованы с Arabidopsis, этот протокол, может быть легко адаптирована для культур клеток, споры и потенциально даже насекомых в жидкой среде 96-, 384-или 1536-ну пластины. Из-за ее небольшой размер Arabidopsis поддается скрининга в 96 хорошо пластины. Однако распространение семян равномерно среди скважин является проблемой. Рука посева является точной, но трудоемким, и хотя есть устройства, предназначенные для распределять семена в 96-луночных пластин, они являются дорогостоящими для покупки. Здесь мы покажем, как можно обойти этот шаг с только небольшой потери точности.
Общая цель этого метода было сделать скрининг большой химической библиотеки против Arabidopsis более управляемым, без ущерба для точности, через использование жидкого обработки робота. Использование этого метода повышает эффективность работы исследователя, уменьшая время, необходимое для завершения начального разбавления серии управления и последующих фенотипические экраны, позволяя быстро визуализации образцов под микроскопом рассечения и быстрого выявление новых биологически активных малых молекул. Рисунок 1 изображает этот протокол ключевых результатов в 4 этапа.
Рисунок 1: рабочий процесс общего экрана вперед химических генетики. Обзор протокола должен быть описан с некоторые детали для каждого из 4 ключевых шагов. 1: получение химического Библиотека, 2: создание разрежения библиотеки, 3: скрининг пластины, и 4: инкубации и визуализации скрининг пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание библиотеки разрежения
- Ярлык 625 разрежения библиотека пластины вручную, обеспечение того, что они соответствуют к их соответствующим пластины из химических библиотеки. Кроме того, подключение потока и потока рукавов на многоканальный Совет мыть автоматизированных лабораторное оборудование позиционера (ALP) путем передачи их через диск консоли 5 галлон резервуар (см. Таблицу материалы).
- Доступ к компьютеру и включите насос мыть через подключение контроллера устройства для многоканальных Совет мыть ALP для циркуляции воды. Это автоматически выключится в конце протокола.
- Нагрузки, от руки, укладчик 10 придает укладчик карусель, в следующем порядке в отелях A - D (рис. 4, укладчик); Одна коробка AP96 P20 наконечники в номер 1, четыре 96-луночных V-нижней пластины в номерах 2-5 с двух верхних пластин, содержащие запасов концентрации от заказанного библиотеки и двух нижних пластин пустой (рис. 5, укладчик). Кроме того, загрузить одну коробку AP96 P20 наконечники в номер 6 и четыре 96-луночных V-нижней пластины в номерах 7-9 с двумя верхней пластины, содержащие запасов концентрации приказал библиотеки и двух нижних пластин пустой (рис. 5, укладчик).
- Установите вверх, вручную, палуба с 300 мл воды водохранилища на P3, 300 мл 70% EtOH ванну на P7, Совет погрузчик ALP (TL1) и Совет мыть ALP многоканальный (TW1) (Рисунок 4, палубы и Рисунок 5, палуба).
- Используя программное обеспечение, представить AP96 P20 наконечники из 10 укладчик и переместите их в Совет погрузчик ALP.
Примечание: 1.5 через 1.12 все сделали с жидкостью, обработка робота программного обеспечения; Смотрите Таблицу материалы. - Настоящее время номер 2 от отеля A и разделить все четыре 96-луночных V-нижней плиты на палубе, поместив в нижней два P4 и P8 и два верхних P5 и P9 (рис. 4).
- Загрузите AP96 P20 наконечники с кончика погрузчик ALP на голову 200 мкл 96-канал. Аспирационная 90 µL из 300 мл воды водохранилища и обойтись в 96-луночных V-днище разрежения на P4. Повторите этот шаг для пластины на P8.
- Смесь химических библиотека пластины на P5 многократно аспирационных и дозирования 15 мкл три раза. Кроме того аспирационная 10 мкл от химического библиотека пластины на P5 и лунки 10 мкл в пластину разрежения на P4.
- Смешайте решения пластину на P4, многократно аспирационных и дозирования 50 мкл в общей сложности три раза. После того, как смешанные, чистый AP96 P20 наконечники аспирационных и дозирования 70 мкл 70% EtOH от P7, затем мыть их в ALP Совет мыть многоканальный аспирационных и дозирования 110% объема воды четыре раза.
- Повторите шаги 1.8-1.9 для второй пары пластин на P8 и P9. После создания второй 96-луночных V-днище разрежения, стека и пластины в следующем порядке от нижнего к началу: P4, P8, P9 и P5. Затем место стека на одной пустой статические ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 или P13.
- Повторите шаги 1.6-1.10 до 5 номер в отеле A является пустым. Повторите шаг 1,5 после достижения номер 6, перемещение новых AP96 P20 наконечники наконечник погрузчик ALP и размещения используется AP96 P20 наконечники на пустой статические ALP.
- Повторите шаги 1.6-1.10 до 9 номеров A является пустым. Однако для того, чтобы перейти к отель B, пластины и советы на палубе должны быть перезагружены в отеле A.
- Вручную, повторно заполните резервуар для воды 300 мл. Этот шаг имеет решающее значение, и компьютерная программа может включать паузу подробно это сообщение, требующее от пользователя нажмите «продолжить», перед выполнением следующего шага.
- Повторите шаги 1,5-1.13 для остальных гостиниц, обеспечивая полный 300 мл воды водохранилища каждый раз перед переходом к следующему отель.
2. Добавление медиа семян смеси для скрининга пластины
- ½ фотосинтетическую и СМИ Скуг (МС) с 0.1% агар с добавлением солей 4.3 g MS, 0,50 г МЧС, 1.0 g агар до 1 Л ди H2O. скорректировать рН до 5,7 Хотя добавлением гидроксида калия 5 М при мониторинге с рН зонд.
- Стерилизовать семена, встряхивая их в 1% отбеливателя и SDS между 15 и 30 минут, а затем промыть 4 раза с равным объемом воды центрифугированием. После того, как семена стерильными, разместите их на 4 ° C от 24 часов до 7 дней для vernilization. Центр ресурсов биологического Arabidopsis описывает дополнительные методы стерилизации, vernilization и рост22.
- Вручную добавьте семена в СМИ на плотности 0,1 г/100 мл. Эта плотность приводит к в среднем 3-10 семян на хорошо 96-луночных плиты.
- Место, от руки, четыре 96-луночных плоским-нижней пластины в номера 1 и 2 отеля A (Рисунок 6, Гостиница). Поместите коробку AP96 P250 наконечники на наконечник погрузчик ALP, 300 мл водохранилище заполнены смесью СМИ семян, созданную во время шагов 2.1-2.3 на P3 и 300 мл водохранилище заполняется с 70% EtOH на P7 (Рисунок 4, палубы и Рисунок 6 Для загара).
Примечание: 2.5 через 2.8 сделали с программное обеспечение. - Номера 1 и 2 в отель и отдельные стеки четырех пластин. Поместите одну пластину на каждой из пустой статической Альп (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 и P12). Загрузите AP96 P250 наконечники на голове 200 мкл 96-канал.
- Аспирационная 90 µL из 300 мл медиа семян водохранилища на P3 и обойтись в первый 96-луночных квартиру-днище. Повторите этот процесс до тех пор, пока все восемь плиты содержат смесь СМИ семян.
- Очистить AP96 P250 наконечники аспирационных и дозирования 70 мкл от водохранилища 300 мл, заполнены с 70% EtOH на P7. Вымойте Советы в ALP мыть Совет многоканальный аспирационных и дозирования 110% объема воды в четыре раза, выгрузить советы на TL1 и вручную собрать пластины.
3. Добавление малых молекул скрининг пластины
- Нагрузка, вручную, коробка AP96 P250 наконечники в номер отеля 1 A, два 96-луночных V-библиотека Плиты днищ разрежения в номера для 2, 4, 6 и 8 и два 96 хорошо плоскодонные скрининг пластин в комнаты, 3, 5, 7 и 9 (рис. 4 Укладчик и рис. 7, отель A). Кроме того подключения шлангов от многоканальный Совет ALP мыть на 5 галлон резервуар и.
Примечание: 3.2 через 3.10 сделали с программное обеспечение. - Настройте для загара содержат 300 мл 70% EtOH мыть резервуар на P7; СМИ семян водохранилища могут быть оставлены на палубе в P3 (Рисунок 4, палубы и рис. 7, палуба). Кроме того включите диск консоли через подключение контроллера устройства для циркуляции воды через многоканальный Совет мыть ALP. Это автоматически выключится в конце протокола.
- Представить AP96 P250 пипеткой Совет поле от отеля A и переместить его в Совет погрузчик ALP.
- Настоящее время 96-луночных V-Плиты днищ разрежения библиотеки из 2 номеров A на палубе и место один на статических ALP P4 и один на P8. Настоящее время 96-луночных квартиры-скрининг Плиты днищ от обслуживание 3 Отель A на палубу и один на статических ALP P5 и один на P9.
- Загрузите AP96 P250 наконечники с кончика погрузчик ALP на голову 200 мкл 96-канал.
- Смешать 96-луночных V-днище разрежения на P4 аспирационных и дозирования 50 мкл три раза. После этого, аспирационная 10 мкл от этой пластины и обойтись в 96-луночных квартиру-днище скрининг на P5.
- Смешайте решения в пластину на P5 аспирационных и дозирования 50 мкл три раза. Очистить AP96 P250 наконечники с этанолом, аспирационных и дозирования 70 мкл 70% EtOH из водохранилища на P7 и затем вымыть советы в многоканальный Совет ALP мыть аспирационных и дозирования 110% объема воды в четыре раза.
- Повторите шаги 3.5 и 3.6 для второй 96-луночных V-днище разрежения библиотеки (P8) и 96-луночных плоский-скрининг днище (P9).
- Стек два 96-луночных V-Плиты днищ разрежения библиотека вместе и два 96-луночных плоский скрининг нижней пластины вместе. Переместите плиты статические Альпы P1, P2, P6, P10, P11, P12 или P13.
- Повторите шаги 3.4-3.9 три раза, добавив разреженных химических веществ Скрининг плиты в общей сложности восемь раз. Наконец проверьте количество семян в каждой скважине скрининга пластин через визуальные конформации и дополнение этих скважин с менее трех семян дополнительных стерилизованные и vernalized семян.
4. инкубации и визуализация скрининга пластины
- Инкубируйте 96-луночных плоскодонные скрининг пластины для четырех дней в экологической палаты при 22 ° C на цикле свет/темно 16/8 в контейнере доказательство усыхания. Визуализируйте скрининг пластины с плоским дном 96-луночных под микроскопом рассечения. Запись всех фенотипов аномальным для дальнейшего расследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность точно и эффективно охарактеризовать фенотипов, основанные на добавление малых молекул на скрининг концентрации под микроскопом рассечения является конечной целью данного метода вперед химических генетики на арабидопсиса. Фенотипов, когда были проверены все 50,000 соединений весьма разнообразен и может быть разбит на несколько различных классов (рис. 2). На рисунке 3A -F изображены примеры фенотипов, которые наблюдались в малое увеличение под микроскопом рассечения. Некоторые фенотипов представили убедительных результатов (Рисунок 3 g, H). Они должны были быть протестированы при более низких концентрациях, чтобы обеспечить химическое вещество не различные фенотип в более низкой дозе.
Плохие результаты могут возникать по многим причинам. Один является ставки бедных прорастания семян. Это может привести к скрининг плиты преимущественно выставлять не всхожесть или неполной всхожесть фенотипов (Рисунок 3 g, H), который может ввести в заблуждение. Чтобы преодолеть это, тестирование до прорастания ставки для всех семян используется. После прорастания тарифы были установлены и больше чем 95% для выращивания арабидопсиса, яровизация семян перед добавлением химических является ключевым этапом обеспечения одновременного прорастания. Отсутствие Одновременное проращивание может привести к ложных срабатываний в фенотип. Кроме того плохие результаты могут возникнуть, если средства массовой информации может испариться во время инкубации. Это отсутствие гидратации предотвращает прорастания семян и можно избежать за счет использования контейнеров сушки доказательство. Кроме того ДМСО и СМИ решения в двух внешних столбцах каждой пластины, обеспечивая надлежащее микро-климатов и прорастание цены получаются.
Удовлетворительные результаты экспериментов достигаются при прорастании ставки > 95%, семена vernalized до того в 96-луночных плоскодонные пластины, обеспечивая Одновременное проращивание, и средства массовой информации не испаряется во время инкубации. В идеале, химических веществ будет испытываться на концентрацию, что позволяет все семена прорастают и фенотипы чтобы точно оценить (рис. 3A-F). Большинство процедур производства саженцев с фенотипов, которые были визуально неотличим от макет элементов управления не морфологических фенотипов (Рисунок 3А), подавляющее большинство аберрантных фенотипов, состоящий из беленой и сильно низкорослые корни (рис. 2).
Рисунок 2: наиболее распространенные фенотипов наблюдается и долю каждого фенотипа наблюдается. A) после четырех дней инкубации в общей сложности 3 271 малых молекул оказались биоактивные в 100 мкм. Цвет указывает на серьезность фенотипу (черный = более суровые, белый = менее тяжелой). Наиболее часто наблюдается фенотипа относится к корень морфологии, с более чем 1500 соединений вызывая низкорослые корни различной степени тяжести. Окраска также часто затрагиваемых соединений в этой библиотеке, с 1148 саженцев, записанная как полностью обесцвеченные или частично бесцветные. Чуть менее 400 соединений производится фенотипов отличительные корневого волоска – либо низкорослые или оба низкорослые и ярко окрашены. Наконец прорастание пострадал от чуть менее 200 соединений. В этих случаях семена не завершить всхожесть или даже не начать прорастать. B) саженцев, экспонируется аномалии в корень морфологии, либо низкорослые или сильно низкорослые, составляют почти половину всех фенотипически аберрантных саженцев. Следующая группа крупнейших были те, которые привели к беленого или обесцвеченные саженцев. Фенотипов, которые касаются корня волос аномалии, также составляют значительную часть а ингибирование прорастания, либо не всхожесть или неполной прорастания, произошло только в небольшой процент всех биологически активных соединений. Наконец существует ряд фенотипов, которые произошли на такой низкой частоты, они были сгруппированы в категории «другие», примером которого является производство зеленого слизь, показано на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: изображения представитель фенотипов наблюдается во время экрана вперед химических генетики. Нет видимых морфологических аномалий (A), коричневый корневых волосков, (B), росте корня (C), серьезно сдерживали корень (D), отбеленная (E), зеленые слизь (F), неполное прорастания (G) и не прорастания (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: обзор 10 укладчик и палубы, настроить перед началом протокола. Укладчик Карусель состоит из четырех укладчик 10 (Гостиницы A - D) который разместиться десять комнат. Колода содержит разнообразные Альп: наконечник загрузчик, укладчик шаттл, многоканальный Совет мыть и 13 статических Альп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: укладчик 10 и палубы, созданы необходимые для создания библиотеки разрежения. Четыре 10 укладчик загружаются с коробках AP96 наконечники P20 в залах 1 и 6 отелей A - D и стеки четыре 96-луночных V-нижней пластины в номерах 2-5 и номера 7-9 отелей в A - D. Планировка состоит из двух резервуаров 300 мл на статических Альпы P3 и P7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: укладчик 10 и палубы, созданы для добавления медиа-семян смеси скрининг пластин. Укладчик 10 загружается с четырьмя 96-луночных плоским-нижней пластины в номерах 1 и 2 Hotel A. Макет колода состоит из двух резервуаров 300 мл на статических Альпы P3 и P7 и коробка AP96 P250 наконечники на TL1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: укладчик 10 и палубы, созданы для добавления небольших молекул для скрининга плит. Укладчик 10 загружается с коробкой AP96 P250 наконечники в номер 1, стек два 96-луночных V-разрежения нижней плиты в номерах 2, 4, 6 и 8 и стек два 96-луночных квартиры-поддоны заполнены с медиа семян смеси в 3 номера , 5, 7 и 9. Планировка состоит из двух резервуаров 300 мл на статических Альпы P3 и P7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предназначен для оказания помощи исследователям в выполнении вперед химических генетики экран на Arabidopsis. Мы предоставляем представитель результаты от экрана 50 000 соединений (рис. 2 и рис. 3), один из крупнейших экранов вперед химических генетики над Arabidopsis на сегодняшний день9,13,23. Применение жидкой обработке робота позволило эффективнее библиотека разрежения и отбора библиотека поколения, повышая скорость и эффективность идентификации новых соединений. Увеличение потенциала для экрана в природе высокая пропускная способность сопровождали снижение труда от имени исследователь. Этот метод был разработан для использования с 96-луночных пластины, которые могут разместиться небольшие семена или растения, видимые под микроскопом рассечения. Использование плит с больших скважин для крупных семян потребует изменения пропускной способности и дизайн.
Дополнительные ограничения этой техники относятся трудности с использованием этой частью оборудования с асептических методов; Однако мы не сталкиваемся высокий процент загрязнения из-за ½ MS СМИ не хватает сахарозы. Одно может обойти любой вопрос загрязнения, поместив робота в стерильной комнате, позволяя для стерильных условий и культуры клеток, или с помощью жидкого обработки робот с стерильной палате24,25. Еще одним ограничением является размер чаевых и стремление семян. Кончик небольшой пипеткой например AP96 P20 будет забивать с семенами; Таким образом больше кончика пипетки должен использоваться для семян дозирования и смешивания решения.
Важнейшие шаги в рамках настоящего Протокола включают в себя тщательный маркировки всех плит в библиотеке разрежения и отбора Библиотека, обеспечение того, что они находятся в надлежащей ориентации наряду с правильный порядок при кормлении робота. Очистить маркировки и систематической обработки прост и может преодолеть эту проблему. Другим важным шагом является обеспечение необходимого оборудования в правильное место перед началом эксперимента, как внутри Стакер 10, так и на палубе. Если оборудование не устанавливается надлежащим образом на палубе, 96-канальный 200 мкл голова может аварии, повреждения инструмента и требующие обслуживания. Другим важным шагом является обеспечение того, что правильное количество жидкости находится в пределах 300 мл водохранилищ и что эта сумма является правильно вступил в программное обеспечение. Если цифры не совпадают, советы не достигнет жидкости и стремление не произойдет.
Это также необходимо принять меры к тому, что полученные результаты являются точными. Одна ошибка, что мы заметили, при разработке протокола был связан с тонкий конец жизни. После последовательных погрузки и разгрузки советы теряют способность аспирационная и обойтись точно. Поэтому важно, что каждый набор 96 советов используется максимум четыре раза. Важно также изменить мыть водой регулярно, чтобы избежать возможных химических веществ добавляемый непреднамеренно скрининг пластины. Наконец некоторые химические вещества имеют тенденцию осадка из решения26. Чтобы убедиться, что каждому химическому добавляется в правильной концентрации, смешивая шаги включены в разрежения и отбора протокол. Неспособность смесь может привести к низкой количество химических веществ, будучи добавлен от библиотеки к библиотеке, сложной интерпретации потенциальных химических индуцированной фенотипов.
Используя правильный пластины для каждой части протокола также очень важно. V-нижней пластины предназначены для обеспечения небольших объемов жидкости могут быть атмосферный и рекомендуются для использования в создании библиотеки разрежения. Однако эти пластины не подходят для проверки части протокола, поскольку их отражения света приводит к плохой визуализации фенотипов. Для того чтобы наблюдать фенотипов 3-4 дня старый саженцев, экран должен осуществляться в пластины с плоским дном.
Как только будут созданы скрининг пластины, визуализация не требуется. 96-луночных плоскодонные пластины позволяют легко визуализации под рассекает микроскопы. Важно, что пластины хранятся в контейнерах сушки доказательство для уменьшения испарения средств массовой информации. Альтернативой микроскопических визуализации используется с высоким разрешением сканера. Изображения с высоким разрешением выявить большинство фенотипов, наблюдается в этом экране и обеспечивают Архив результатов, которые могут быть пересмотрены в будущем. После того, как визуализация является полным, и экранированные библиотеки по вашему выбору, этот метод затем может быть выполнена, на различных организмов или другой химической библиотекой. Изменения в оборудование может позволить для стерильных культуры, позволяя предприятиям в области стволовых клеток, грибка, насекомых и мелких растений2,18,25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Jozsef аист, Mitchel Ричмонд, Jarrad Gollihue и Андреа Sanchez для конструктивного и критического обсуждения. Д-р Перри Sharyn для фенотипического фотографий. Этот материал основан на работе, поддержке Национального научного фонда под кооперативного соглашения № 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013).
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
