Summary
Un écran à haut débit de petites molécules de synthèse a été réalisé sur les espèces de plantes de modèle, Arabidopsis thaliana. Ce protocole, développé pour un robot de manipulation de liquides, augmente la vitesse d’écrans avant génétique chimique, accélérer la découverte de nouvelles petites molécules affectant la physiologie végétale.
Abstract
Génétique chimique est plus en plus utilisée pour décoder les caractères chez les plantes qui peuvent être récalcitrants à la génétique traditionnelle en raison de la redondance de gène ou de la létalité. Cependant, la probabilité d’une petite molécule synthétique étant bioactive est faible ; par conséquent, des milliers de molécules doivent être testés afin de trouver ceux d’intérêt. Manipulation robotique systèmes sont conçus pour gérer un grand nombre d’échantillons, augmentation de la vitesse avec laquelle une chimique peut être criblée outre minimiser/standardisation erreur de liquides. Pour obtenir un écran haut débit avant génétique chimique d’une bibliothèque de 50 000 petites molécules sur Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocoles utilisant un liquide multicanaux de paillasse robot de manutention ont été élaborés nécessitant un minimum participation du technicien. Avec ces protocoles, 3 271 petites molécules ont été découverts qui a provoqué des altérations phénotypiques visibles. 1 563 composés induisirent des racines courtes, coloration de 1 148 composés modifiés, 383 composés causés les poils absorbants et autres, hors-catégorie, altérations et la germination de 177 composés inhibées.
Introduction
Au cours des 20 dernières années chercheurs dans le domaine de la biologie végétale ont fait des progrès considérables, grâce à la génétique chimique avant et arrière, améliorer notre compréhension de la biosynthèse de la paroi de la cellule, le cytosquelette, la biosynthèse des hormones et de signalisation, gravitropisme, pathogenèse, biosynthèse de la purine et endomembranaire traite1,2,3,4,5. Employant des techniques de génétique chimique avant permet l’identification des phénotypes d’intérêt et permet aux chercheurs de comprendre les fondements génotypiques des procédés particuliers. À l’inverse, génétique chimique inverse recherche les produits chimiques qui interagissent avec une protéine pré-déterminé cible6. Arabidopsis a été à l’avant-garde de ces découvertes en biologie végétale, parce que son génome est petit, mappé, avec mention. Il a un temps de génération court, et il y a plusieurs lignes de mutant/journaliste disponibles afin de faciliter l’identification des machines subcellulaire aberrante7.
Il y a deux principaux goulets d’étranglement qui ralentissent la progression d’avancer les écrans génétiques chimiques, le processus de sélection et de déterminer la cible du composé d’intérêt8initial. Une aide importante en augmentant la vitesse de sélection de petite molécule est l’utilisation de l’automatisation et l’équipement automatisé de9. Robots de manutention de liquides sont un excellent outil pour gérer les grandes bibliothèques de petites molécules et ont joué un rôle important dans la conduite des progrès dans les sciences biologiques10. Le protocole présenté ici vise à alléger le goulot d’étranglement lié au processus de sélection, permettant d’identifier des molécules bioactives petits à un rythme accéléré. Cette technique diminue la charge de travail et le temps pour le compte de l’opérateur tout en diminuant aussi le coût économique à l’enquêteur de principe.
Jusqu’ici, les bibliothèques plus chimiques analysés ont lieu entre 10 000 et 20 000 composés, certains avec jusqu'à 150 000 et certains avec aussi peu que 709,11,12,13,14, 15 , 16. le protocole présenté ci-après a été implémenté sur une bibliothèque de petite molécule de 50 000 composés (voir la Table des matières), un de la plus grande génétique chimique avant écrans menée sur Arabidopsis à ce jour. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle vers une efficacité accrue et la vitesse au sujet du avant génétique chimique, en particulier en ce qui concerne à la découverte de l’herbicide, découverte de l’insecticide, fongicide Découvrez, drug discovery et la biologie du cancer17 ,18,19,20,21. Bien que mis en œuvre ici avec Arabidopsis, ce protocole, pourrait facilement être adaptés aux cultures de cellules, des spores et potentiellement même insectes dans un milieu liquide dans 96-, 384- ou plaques 1536 puits. En raison de sa petite taille, Arabidopsis se prête au dépistage en plaques bien 96. Toutefois, distribuer les graines uniformément entre les puits est un défi. Ensemencement de la main est exacte mais de forte intensité de main de œuvre, et qu’il existe des dispositifs conçus pour répartir les graines dans des plaques à 96 puits, ils sont coûteux à l’achat. Ici, nous montrons comment cette étape peut être contournée avec juste une petite perte en précision.
L’objectif général de cette méthode était de faire le dépistage d’une grande bibliothèque chimique contre Arabidopsis plus facile à gérer, sans compromettre la précision, via l’utilisation d’un robot de manipulation de liquides. L’utilisation de cette méthode améliore l’efficacité du chercheur en diminuant le temps nécessaire pour compléter la gestion de série de dilution initiale et des examens subséquents phénotypiques, ce qui permet une visualisation rapide des échantillons sous un microscope à dissection et rapide identification de nouvelles petites molécules bioactives. La figure 1 illustre les principaux résultats de ce protocole en 4 étapes.
Figure 1 : flux de travail dans l’ensemble de l’écran avant génétique chimique. Une vue d’ensemble du protocole pour être décrit avec quelque détail pour chacune des 4 étapes clés. 1 : recevant la bibliothèque chimique, 2 : faire la Dilution bibliothèque, 3 : rendre les plaques de dépistage et 4 : incubation et visualiser les plaques de projection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Protocol
1. création d’une bibliothèque de Dilution
- Étiquettes de marquage de Dilution bibliothèque 625 à la main, s’assurer qu’ils correspondent à leur plaque correspondante de la bibliothèque chimique. De plus, se connecter au flux et tuyaux d’écoulement pour le multicanal Astuce lavage automatisé Labware positionneur (ALP) en les passant à travers le disque de la Console pour le réservoir de 5 gallons (voir Table des matières).
- Accéder à l’ordinateur et allumez la pompe de lavage grâce à la connexion du contrôleur de périphérique à l’Alpe de lavage multicanale Astuce afin de faire circuler l’eau. Il s’éteindra automatiquement à la fin du protocole.
- Charge, à la main, le gerbeur électrique 10 fixée pour le Carrousel de Stacker, dans l’ordre suivant dans les hôtels A - D (Figure 4, Stacker) ; une boîte de pointes de Pipette AP96 P20 dans la salle 1, quatre 96 puits V-plaques de fond en chambres de 2 à 5 avec les deux plaques supérieures contenant des concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vide (Figure 5, Stacker). En outre, charger une seule boîte de pointes de Pipette AP96 P20 dans la salle 6 et quatre V de 96 puits-plaques de fond dans les salles 7 à 9 avec les deux plaques supérieures contenant des concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vide (Figure 5, Stacker).
- La valeur maximum, à la main, le pont avec un réservoir d’eau 300 mL sur P3, un bain d’EtOH 70 % 300 mL sur P7, astuce Loader ALP (TL1) et multicanal Astuce lavage ALP (TW1) (Figure 4, pont et Figure 5, pont).
- En utilisant le logiciel d’exploitation, présenter des pointes de Pipette AP96 P20 du Stacker 10 et déplacez-les vers l’Alpe de chargeur Tip.
NOTE : 1.5 par 1.12 tous se font avec le liquide de traitement logiciel de fonctionnement du robot ; Voir Table des matières. - Présenter 2 chambre d’Hotel A et séparer tous les quatre 96 puits V-fond plaques sur le pont, mettant le bas deux P4 et P8 et les deux premiers sur P5 et P9 (Figure 4).
- Charger les pointes de Pipette P20 AP96 avec le chargeur de pointe ALP sur la 96 voies 200 µL tête. Aspirer 90 µL dans le réservoir d’eau de 300 mL et diluer dans le V de 96 puits-plaque de Dilution de fond sur P4. Répétez cette étape pour la plaque sur P8.
- La composition de la plaque bibliothèque chimique sur P5 de répétitivement aspirant et 15 µL de distribution trois fois. En outre, aspirer 10 µL de la plaque de bibliothèque chimique au P5 et distribuer 10 µL dans la plaque de dilution sur P4.
- Mélanger les solutions de la plaque sur P4 par répétitivement aspirer et distribuer 50 µL trois fois au total. Une fois mélangé, nettoyer les pointes de Pipette AP96 P20 par aspiration et la distribution de 70 µL de 70 % EtOH de P7, puis les laver dans l’Alpe multicanale astuce de lavage par aspiration et distribution d’un volume de 110 % d’eau quatre fois.
- Répétez les étapes 1,8-1,9 pour la deuxième paire de plaques à P8 et P9. À la création du deuxième V 96 puits-plaque de fond Dilution, pile les plaques dans l’ordre suivant de bas en haut : P4, P5, P8 et P9. Ensuite, placez la pile sur un vide ALP statique ; soit P1, P2, P6, P10, P11, P12 et P13.
- Répétez les étapes 1.6-1.10 jusqu'à 5 chambre à l’Hotel A est vide. Répétez l’étape 1.5 pour atteindre la salle 6, se déplaçant de nouvelles pointes de Pipette P20 AP96 vers l’Alpe de chargeur Tip et placer les pointes de Pipette AP96 P20 utilisé sur un alpage statique vide.
- Répétez les étapes 1.6-1.10 jusqu'à 9 chambre d’Hotel A est vide. Toutefois, afin de procéder à l’hôtel B, les plaques et les conseils sur le pont doivent être rechargées en Hotel A.
- Re-remplir à la main, le réservoir d’eau de 300 mL. Cette étape est fondamentale, et le programme informatique peut intégrer une pause détaillant ce message, obligeant l’utilisateur à frapper « continuer », avant d’effectuer l’étape suivante.
- Répétez les étapes 1.5-1.13 pour les autres hôtels, assurant un réservoir d’eau plein 300 mL chaque fois avant de procéder à l’hôtel suivant.
2. mélange de médias-graines en ajoutant aux plaques de contrôle
- Faire ½ milieu de Murashige et Skoog (MS) médias avec 0,1 % Agar par l’ajout de 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar à 1 L DI H2O. ajuster le pH à 5,7, bien que l’ajout d’hydroxyde de potassium 5 M tout en surveillant avec une sonde de pH.
- Stériliser les graines en les secouant dans 1 % eau de Javel et SDS entre 15 et 30 min et puis rincez 4 fois avec un volume égal d’eau par centrifugation. Une fois que les graines sont stériles, les placer à 4 ° C de 24 heures à 7 jours pour vernilization. Le centre de ressources biologiques Arabidopsis décrit les autres méthodes de stérilisation, vernilization et22de la croissance.
- Ajoutez les graines aux médias à la main à une densité de 0,1 g/100 mL. Cette densité se traduit par une moyenne de 3-10 graines / puits d’une plaque de 96 puits.
- Place, à la main, quatre plat de 96 puits-plaques de fond dans les salles 1 et 2 de l’hôtel A (Figure 6, Hotel A). Placez une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 sur l’Alpe de chargeur Tip, un réservoir de 300 mL remplie avec le mélange de graines de médias créé aux étapes 2.1 à 2.3 sur P3 et un réservoir de 300 mL rempli avec 70 % EtOH sur P7 (Figure 4, pont et Figure 6 Pont).
NOTE : 2.5 à 2.8 sont effectués avec le logiciel d’exploitation. - Présenter les pièces 1 et 2 à l’hôtel A et séparer les piles de quatre assiettes. Placer une assiette sur chacun des Alpes vide statique (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 et P12). Charger les pointes de Pipette AP96 P250 sur la 96 voies 200 µL tête.
- Aspirer 90 µL dans le réservoir de médias-graine de 300 mL sur P3 et verser dans le premier plat de 96 puits-plaque de fond. Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les huit plaques contiennent le mélange de graines de médias.
- Nettoyer les pointes de Pipette P250 AP96 par aspiration et la distribution de 70 µL dans le réservoir de 300 mL rempli à 70 % EtOH sur P7. Lavez les pointes dans le multicanal Tip laver ALP par aspiration et un volume de 110 % de l’eau de distribution quatre fois, décharger les conseils à TL1 et rassembler les plaques à la main.
3. ajouter des petites molécules à plaques de dépistage
- Charge, à la main, une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 en salle 1 de l’hôtel A, deux V 96 puits-plaques de bibliothèque de Dilution de fond en chambres 2, 4, 6 et 8 et deux 96 bien à fond plat de dépistage plaques en chambres de 3, 5, 7 et 9 (Figure 4 Empileur et Figure 7, hôtel A). En outre, raccorder des tuyaux vers et depuis l’Alpe de lavage Tip multicanal pour le réservoir de 5 gallons.
NOTE : 3.2 à 3.10 sont effectués avec le logiciel d’exploitation. - Configurer le pont pour contenir un réservoir 300 mL 70 % EtOH lavage P7 ; le réservoir de médias-graine peut rester sur le pont à P3 (Figure 4, pont et Figure 7, pont). En outre, allumez le lecteur de la Console via connexion du contrôleur de périphérique à faire circuler l’eau à travers l’Alpe de lavage Tip multicanale. Il s’éteindra automatiquement à la fin du protocole.
- Présente la AP96 P250 Pipette Tip boîte de Hôtel A et déplacez-le vers l’Alpe de chargeur Tip.
- Présenter le V de 96 puits-plaques de bibliothèque de Dilution de fond de 2 chambre d’Hotel A sur le deck et placer un P4 ALP statique et P8. Présenter le plat de 96 puits-plaques de projection du fond de la salle 3 de l’hôtel A sur le pont et placez une sur ALP statique P5 et sur P9.
- Charger les pointes de Pipette P250 AP96 avec le chargeur de pointe ALP sur la 96 voies 200 µL tête.
- Mélanger le V de 96 puits-plaque de Dilution de fond sur P4 par aspiration et 50 µL de distribution trois fois. Par la suite, aspirer 10 µL de cette plaque et verser dans le plat de 96 puits-plaque de fond préalable sur P5.
- Mélanger les solutions dans la plaque à P5 en aspirant et 50 µL de distribution trois fois. Nettoyer les pointes de Pipette P250 AP96 avec de l’éthanol par aspiration et la distribution de 70 µL de 70 % EtOH provenant du réservoir à P7 et puis lavez les pointes à l’ALP multicanale Astuce lavage par aspiration et distribution d’un volume de 110 % de l’eau quatre fois.
- Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour le second V 96 puits-plaque de bibliothèque de Dilution inférieure (P8) et plat de 96 puits-plaque de fond préalable (P9).
- Empiler les deux 96 puits V-plaques de Dilution bibliothèque fond ensemble et les deux plaques de fond préalable 96 puits plat ensemble. Passer les plaques à statique Alpes P1, P2, P6, P10, P11, P12 et P13.
- Répétez les étapes 3,4-3,9 trois fois, ajouter des produits chimiques dilués à projection plaques huit fois au total. Enfin, vérifiez le nombre de graines dans chaque loge des présélection des plaques conformation visual et compléter ces puits avec moins de trois graines par des graines stérilisées et vernalisées supplémentaires.
4. l’incubation et la visualisation des plaques de dépistage
- Incuber les plaques à 96 puits à fond plat de dépistage pendant quatre jours dans une chambre à 22 ° C sur un cycle de lumière/obscurité de 16/8 dans un contenant étanche de la dessiccation. Visualiser les plaques 96 puits à fond plat de dépistage sous un microscope à dissection. Enregistrer tous les phénotypes aberrants pour complément d’enquête.
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Representative Results
La capacité à exactement et efficacement caractériser les phénotypes basées sur l’ajout de petites molécules au dépistage des concentrations sous un microscope à dissection est l’objectif final de cette méthode de génétique chimique avant sur Arabidopsis. Les phénotypes observés lorsque tous les 50 000 composés ont été menées est diverses et peut être divisée en plusieurs classes distinctes (Figure 2). Figure 3 a -F montre des exemples de phénotypes observés à faible grossissement sous un microscope à dissection. Certains phénotypes a fourni des résultats non concluants (Figure 3, H). Ceux-ci devaient être testés à nouveau à des concentrations plus faibles pour s’assurer que le produit chimique n’a pas fourni un phénotype différent à une dose inférieure.
Mauvais résultats peuvent survenir pour de nombreuses raisons. L’un est un taux de mauvaise germination des graines. Cela peut provoquer une plaque de dépistage à prédominance n’exposer aucune germination ou phénotypes germination incomplète (Figure 3, H), qui peut prêter à confusion. Pour y remédier, pré-tester les taux de germination pour toutes les semences utilisées. Une fois que le taux de germination ont été établies et est supérieurs à 95 % d’Arabidopsis, vernalisation des semences avant l’ajout de produits chimiques est une étape clé assurant la germination simultanée. Manque de germination simultanée peut conduire à des faux positifs dans la détermination du phénotype. En outre, des résultats médiocres peuvent surgir si médias est autorisé à s’évaporer pendant l’incubation. Ce manque d’hydratation empêche la germination des graines et peut être évité par l’utilisation de contenants résistant à la dessiccation. En outre, solutions de DMSO et les médias sont dans les deux colonnes extérieures de chaque plaque, assurant le bon micro climats, et le taux de germination est obtenus.
Des résultats expérimentaux sont obtenus lorsque le taux de germination est > 95 %, graines sont vernalisation avant l’addition en plaques 96 puits à fond plat, assurer la germination simultanée, et les médias ne s’évapore pas durant l’incubation. Idéalement, produits chimiques pourraient être testés à une concentration qui permet toutes les graines germent et les phénotypes d’évaluer avec précision (Figure 3 a-F). Blanchi de la majorité des semis traitements produites avec des phénotypes qui étaient visuellement indiscernables de fausses contrôles avec aucun phénotypes morphologiques (Figure 3 a), avec la grande majorité des phénotypes aberrants consistant et sévèrement racines rabougris (Figure 2).
Figure 2 : les phénotypes plus courantes observées et la proportion de chaque phénotype observé. A) un total de 3 271 petites molécules se sont avéré pour être bioactifs à 100 µM après quatre jours d’incubation. La couleur indique la sévérité du phénotype (noir = plus sévère, blanc = moins sévère). Le plus couramment observé phénotype se rapporte à la morphologie de la racine, avec plus de 1 500 composés induisant des racines rabougris de sévérité variable. Coloration est aussi couramment affectée par les composés dans cette bibliothèque, avec 1 148 semis enregistrés comme entièrement blanchie ou partiellement décolorée. Un peu moins de 400 composés produisent des phénotypes distinctifs des poils absorbants – soit un retard de croissance ou les deux rabougrissent et de couleur vive. Enfin, la germination a été affectée par un peu moins de 200 composés. Dans ces cas, les graines n’ont pas terminé la germination ou n’a pas encore commencé à germer. B) les plantules présentant des anomalies de la morphologie de la racine, soit étant un retard de croissance ou gravement rabougris, constituait près de la moitié de tous les plants phénotypiquement aberrantes. Le prochain plus grand groupe ont été ceux qui ont abouti à semis blanchies ou décolorés. Les phénotypes qui se rapportaient à des anomalies de poils absorbants également constitués une partie importante tandis que l’inhibition de la germination, la germination ou aucune germination incomplet, ne s’est produite dans un petit pourcentage de tous les composés bioactifs. Enfin, il y avait un certain nombre de phénotypes qui a eu lieu à une telle fréquence faible, ils ont été regroupés dans la catégorie « autre », un exemple de ce qui était la production de mucilage vert, vu à la Figure 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images de phénotypes représentant observée pendant l’écran de génétique chimique avant. Aucune des anomalies morphologiques visibles (A), les poils bruns (B), un retard de croissance des racines (C), sévèrement rabougries racine (D), blanchi (E), vert de mucilage (F), la germination incomplète (G) et aucune germination (H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : vue d’ensemble du Stacker 10 et pont mis en place avant l’instauration du protocole. Le Carrousel de Stacker est composé de quatre Stacker 10 (Hôtels A - D) qui chacune accueillir dix chambres. Le pont est titulaire d’une variété des Alpes : le chargeur de pointe, la navette de Stacker, le lavage multicanale Tip et 13 Alpes statique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Stacker 10 et pont réglage n’est requis pour la création d’une bibliothèque de Dilution. Les quatre Stacker 10 sont chargés avec des boîtes de pointes de Pipette AP96 P20 en salles 1 et 6 d’hôtels A - D et des piles de quatre 96 puits V-plaques de fond dans les salles 7-9 2-5 et des chambres d’hôtels A - D. Le plan de pont est composé de deux réservoirs de 300 mL sur statique Alpes P3 et P7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Stacker 10 et pont mis en place pour ajouter Media-graines mélange aux plaques Screening. Le gerbeur électrique 10 est doté de quatre plat de 96 puits-plaques de fond dans les salles 1 et 2 de l’Hotel A. Le plan de pont est composé de deux réservoirs de 300 mL sur statique Alpes P3 et P7 et une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 sur TL1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Stacker 10 et pont mis en place pour l’ajout de petites molécules à plaques Screening. Le gerbeur électrique 10 est doté d’une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 dans la salle 1, une pile de deux V 96 puits-Dilution de fond les plaques dans les chambres 2, 4, 6 et 8 et une pile de plat de 96 puits deux-plaques fond rempli avec le mélange de graines de médias dans 3 chambres , 5, 7 et 9. Le plan de pont est composé de deux réservoirs de 300 mL sur statique Alpes P3 et P7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole est conçu pour aider les chercheurs dans la réalisation d’un écran de génétique chimique avant sur Arabidopsis. Nous fournissons des résultats représentatifs d’un écran de 50 000 composés (Figure 2 et Figure 3), un des plus grands écrans avant génétique chimique effectuée sur Arabidopsis à ce jour9,13,23. L’utilisation d’un robot de manipulation de liquides permis bibliothèque de dilution plus efficace et génération de la bibliothèque de dépistage, améliorer la rapidité et l’efficacité de l’identification de nouveaux composés. Augmenter la capacité à l’écran dans une nature à haut débit était accompagné par la diminution du travail au nom de la chercheuse. Cette technique a été conçue pour être utilisé avec des plaques de 96 puits, pouvant accueillir de petites graines ou plantes visibles sous un microscope à dissection. Utilisant des plaques avec les plus grands puits pour s’adapter à grosses graines nécessiterait des modifications pour le débit et la conception.
Autres limitations de cette technique comprennent la difficulté d’utiliser cette pièce d’équipement avec des techniques aseptiques ; Cependant, on n’a pas rencontré des pourcentages élevés de contamination due ½ MS médias dépourvus de saccharose. On pourrait contourner n’importe quel problème de contamination en plaçant le robot en chambre stérile, permettant des conditions stériles et de culture cellulaire, ou en utilisant un robot de manipulation de liquides avec une chambre stérile24,25. Une autre limitation est la taille de la pointe et l’aspiration de la graine. Un embout de la pipette petit comme le P20 AP96 aurait obturé par des graines ; par conséquent, une plus grande de la pipette doit être utilisée pour la distribution de semences et le mélange de la solution.
Étapes critiques au sein de ce protocole comprennent l’étiquetage minutieuse de toutes les plaques dans la bibliothèque de la dilution et la bibliothèque de dépistage, veillant à ce qu’ils sont dans le bon sens ainsi que l’ordre correct pour alimenter le robot. Une claire étiquetage et traitement systématique est simple et peut surmonter ce problème. Une autre étape essentielle est de s’assurer que l’équipement est au bon endroit avant de commencer l’expérience, au sein du Stacker 10 et sur le pont. Si l’équipement n’est pas placé correctement sur le pont, le 96 voies 200 µL tête peut tomber en panne, dégâts à l’appareil et nécessitant un entretien. Une autre étape essentielle est de s’assurer que la bonne quantité de liquide est placée dans les réservoirs de 300 mL et que ce montant est inscrit correctement dans le logiciel. Si les numéros ne correspondent pas, les conseils n’atteindra pas le liquide et l’aspiration ne se produira pas.
Il est également nécessaire de prendre des mesures pour s’assurer que les résultats obtenus sont exacts. Une erreur que nous avons remarqués tout en développant le protocole est liée au Conseil de la vie. Après successive chargement et de déchargement, les pointes perdent leur capacité à aspirer et distribuer avec précision. Il est donc impératif que chaque ensemble de 96 conseils sert un maximum de quatre fois. Il est également important de changer l’eau régulièrement afin d’éviter tout risque pour les produits chimiques ajoutés par inadvertance aux plaques de contrôle. Enfin, certains produits chimiques ont tendance à précipiter de la solution26. Pour s’assurer que chaque produit chimique est ajouté à la concentration correcte, étapes de mixage sont incorporés dans la dilution et le protocole de dépistage. Mélanger peut entraîner de faibles quantités de produits chimiques étant une interprétation difficile, ajout de la bibliothèque à la bibliothèque du potentiel chimique induite des phénotypes.
En utilisant les plaques correctes pour chaque partie du protocole est également très important. Plaques de fond V sont conçus pour s’assurer que les petits volumes de liquide peuvent être aspirés et sont recommandés pour une utilisation dans la création de la bibliothèque de Dilution. Toutefois, ces plaques ne conviennent pas pour la partie de la présélection du protocole, étant donné que leur réflexion de la lumière conduit à la mauvaise visualisation des phénotypes. Afin d’observer les phénotypes des 3-4 jours vieux plants, l’écran doit effectuer dans les plaques de fond plat.
Une fois que les plaques de dépistage ont été créés, la visualisation est nécessaire. plaques 96 puits à fond plat permettent de faciliter la visualisation sous microscopes de dissection. Il est impératif que les plaques sont stockés dans des contenants résistant à la dessiccation pour réduire l’évaporation des médias. Une alternative à la visualisation microscopique utilise un scanner à haute résolution. Images produites à haute résolution révèlent la plupart des phénotypes observés dans cet écran et fournissent une archive des résultats qui peuvent être réexaminées à l’avenir. Une fois que la visualisation est terminée, et projeté de la bibliothèque de votre choix, cette méthode puis peut être effectuée que sur les différents organismes ou avec une autre bibliothèque chimique. Modifications de l’équipement pourraient permettre la culture stérile, permettant aux entreprises dans les royaumes de cellules souches, champignons, insectes et petites plantes2,18,25,27.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue et Andrea Sanchez pour une discussion constructive et critique. Dr. Sharyn Perry pour les photographies phénotypiques. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous coopérative contrat no 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
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