Summary
Una pantalla de alto rendimiento de pequeñas moléculas sintéticas se llevó a cabo en las especies de plantas modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desarrollado para un robot de manejo de líquidos, aumenta la velocidad de pantallas genética química hacia delante, acelerando el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas que afectan a la fisiología vegetal.
Abstract
Genética química cada vez más se emplea para descifrar rasgos en las plantas que pueden ser recalcitrantes a la genética tradicional debido a la redundancia génica o mortalidad. Sin embargo, la probabilidad de que una pequeña molécula sintética ser bioactivos es baja; por lo tanto, se deben probar miles de moléculas para encontrar de interés. Robótica sistemas están diseñados para manejar grandes números de muestras, aumenta la velocidad con que puede someterse a una biblioteca química además minimizar/estandarización de error para manejo de líquidos. Para lograr una pantalla adelante genética química de alto rendimiento de una biblioteca de 50.000 moléculas pequeñas en Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos utilizando un líquido multicanal Banco manejo de robot fueron desarrollados que requieren un mínimo participación del técnico. Con estos protocolos, 3.271 pequeñas moléculas fueron descubiertas que causaron alteraciones fenotípicas visibles. compuestos de 1.563 inducida por raíces cortas, coloración de 1.148 compuestos alterados, pelos 383 compuestos causados y otras, no categorizado, alteraciones y germinación 177 compuestos inhibidas.
Introduction
En los últimos 20 años los investigadores en el campo de la biología vegetal han hecho grandes progresos utilizando enfoques de genética química, adelante y atrás, mejorar nuestra comprensión de la biosíntesis de la pared celular, citoesqueleto, biosíntesis de la hormona y señalización, Gravitropismo, patogenesia, biosíntesis de purinas y endomembranoso trata de1,2,3,4,5. Empleando técnicas de genética química hacia adelante permite la identificación de fenotipos de interés y permite a los investigadores a entender los fundamentos genotípicos de procesos específicos. Por el contrario, genética reversa química busca productos químicos que interactúan con una proteína determinado objetivo6. Arabidopsis ha estado a la vanguardia de estos descubrimientos en Biología Vegetal porque su genoma es pequeña, traz y anotado. Tiene un tiempo de generación corto, y hay varias líneas de mutante/reportero disponibles para facilitar la identificación de la maquinaria subcelular aberrante7.
Hay dos principales cuellos de botella que retardan el progreso de avance pantallas genéticas química, el inicial proceso de selección y determinar el destino del compuesto de interés de8. Una ayuda importante en el aumento de la velocidad de la selección de moléculas pequeñas es el uso de la automatización y equipo automatizado9. Robots de manejo de líquidos son una excelente herramienta para manejar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas y han sido fundamentales para impulsar avances en las ciencias biológicas10. El protocolo que presentamos está diseñado para aliviar los cuellos de botella asociados con el proceso de selección, lo que permite la identificación de moléculas bioactivas de pequeño a un ritmo rápido. Esta técnica disminuye la carga de trabajo y tiempo en nombre del operador mientras que también disminuye el costo económico para el investigador de principio.
Hasta el momento, han tenido más quimiotecas analizados entre 10.000 y 20.000 compuestos, algunos con tanto como 150.000 y algunos con tan sólo 709,11,12,13,14, 15 , 16. el protocolo introducido aquí se implementó en una biblioteca pequeña molécula de 50.000 compuestos (véase Tabla de materiales), uno de la genética química hacia adelante más grande pantallas realizados en Arabidopsis hasta la fecha. Este protocolo se ajusta a la tendencia actual de aumento de la eficiencia y la velocidad con respecto a la genética química hacia adelante, especialmente lo que respecta al herbicida descubrimiento, descubrimiento de insecticida, fungicida descubrir, descubrimiento y Biología del cáncer17 drogas ,18,19,20,21. Aunque implementado aquí con Arabidopsis, este protocolo podría ser fácilmente adaptado a cultivos de células, las esporas y potencialmente incluso insectos en medio líquido de 96, 384 o placas 1536 pocillos. Debido a su pequeño tamaño, Arabidopsis es favorable a la proyección en 96 placas bien. Sin embargo, distribuir semillas uniformemente entre pozos es un desafío. Mano siembra es correcta pero el uso intensivo de mano de obra, y aunque existen dispositivos diseñados para dispensar las semillas en placas de 96 pocillos, son caros para comprar. Aquí, mostramos cómo puede eludirse este paso con sólo una pequeña pérdida de precisión.
El objetivo general de este método fue hacer examen una gran biblioteca química contra Arabidopsis más manejable, sin comprometer la precisión, mediante el uso de un robot para manejo de líquidos. El uso de este método mejora la eficacia del investigador al disminuir el tiempo necesario para la completa gestión de series de dilución inicial y subsecuentes pantallas fenotípicas, permitiendo una visualización rápida de muestras con un microscopio de disección y rápido identificación de nuevas moléculas bioactivas de pequeño. La figura 1 muestra los resultados clave de este protocolo en 4 pasos.
Figura 1: flujo de trabajo general de la pantalla genética química adelante. Un resumen del protocolo que se describe con algún detalle para cada uno de los 4 pasos claves. 1: recibir la biblioteca química, 2: lo que hace la biblioteca de la dilución, 3: fabricación de las placas de cribado y 4: incubación y visualizar las placas de cribado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. creación de una biblioteca de dilución
- La etiqueta 625 placas de dilución biblioteca a mano, asegurando que coinciden con su placa correspondiente de la biblioteca de química. Además, conecte en el flujo y las mangueras de flujo para el multicanal punta lavado automatizado laboratorio posicionador (montan@A) atravesando el disco de la consola para el depósito de 5 galones (véase Tabla de materiales).
- Acceder al ordenador y encienda la bomba de lavado a través de la conexión del controlador de dispositivo a la ALP de lavado punta de multicanal para circular el agua. Esto apagará automáticamente al final del protocolo.
- Carga, con la mano, el apilador 10 conectado al carrusel del apilador, en el siguiente orden en hoteles A - D (figura 4, apilador); una caja de AP96 P20 pipetas en el cuarto 1, cuatro 96-Well V-placas inferiores en habitaciones de 2-5 con las dos placas superiores que contienen concentraciones comunes de la biblioteca ordenada y las dos placas inferiores vacíos (figura 5, apilador). Además, carga una caja de puntas de pipeta de P20 AP96 en sala 6 y cuatro V 96-Well-placas inferiores en habitaciones 7-9 con las dos placas superiores que contienen concentraciones comunes de la biblioteca ordenada y las dos placas inferiores vacíos (figura 5, apilador).
- Establecer, con la mano, la cubierta con un depósito de agua de 300 mL en el P3, un baño de EtOH de 70% 300 mL en P7, punta cargador ALP (TL1) y multicanal punta lavado ALP (TW1) (cubierta,figura 4y figura 5, cubierta).
- Utilizando el software operativo, presentamos AP96 P20 pipetas de la 10 de apilador y moverlos a la ALP de cargador de punta.
Nota: 1.5 a través de 1.12 todos se realizan con el sistema operativo del robot; el manejo de líquidos Véase Tabla de materiales. - Actualmente 2 habitaciones de Hotel A y separar los cuatro V de 96 pocillos-parte inferior placas en la cubierta, colocar la parte inferior dos en P4 y P8 y los dos primeros en P5 y P9 (figura 4).
- Carga AP96 P20 pipetas con el Punta cargador ALP en el canal 96 200 μL cabeza. 90 μl del depósito de agua de 300 mL de aspirar y dispensar en el V 96-Well-placa inferior de la dilución en P4. Repita este paso para la placa P8.
- Mezclar la placa biblioteca química P5 repetitivamente aspirando y distribución 15 μl tres veces. Además, Aspire 10 μl de la placa de la biblioteca química de P5 y dispensar 10 μL en la placa de dilución de P4.
- Mezclar las soluciones de la placa P4 repetitivamente aspirando y dispensar 50 μl un total de tres veces. Una vez mezclado, limpie el AP96 P20 pipetas de aspiración y dispensación 70 μl de 70% EtOH de P7, luego lavarlas en el ALP de lavado punta de multicanal por aspiración y la dispensación de un 110% del volumen de agua cuatro veces.
- Repita los pasos 1.8-1.9 para el segundo par de placas en P8 y P9. Al crear el segundo V 96-Well-placa inferior de la dilución, pila las placas en el siguiente orden de abajo a arriba: P9, P5, P8 y P4. Luego, coloque la pila en una montan@A estático vacío; sea P1, P2, P6, P10, P11, P12 y P13.
- Repita los pasos 1.6-1.10 hasta sala de 5 en un Hotel. Repita el paso 1.5 a llegar a la sala 6, hacia nuevo AP96 P20 pipetas de la montan@A de cargador punta y colocando las puntas de pipetas de P20 AP96 utilizado en un vacío estático ALP.
- Repita los pasos 1.6-1.10 hasta 9 habitaciones de Hotel A es vacío. Sin embargo, con el fin de proceder a Hotel B, las placas y consejos sobre la cubierta deben ser recargados en Hotel A.
- A mano, llene el depósito de agua de 300 mL. Este paso es crucial, y el programa de computadora puede incorporar una pausa que detalla este mensaje, que requiere que el usuario a 'continuar', antes de realizar el siguiente paso.
- Repita los pasos 1.5 1.13 para los hoteles restantes, asegurando un depósito completo 300 mL de agua cada vez antes de proceder al siguiente hotel.
2. Añadir mezcla de semilla de los medios de comunicación a las placas de cribado
- Hacer ½ Murashige y Skoog (MS) los medios con 0,1% Agar por la adición de 4,3 g MS Salts, 0.50 g MES, 1,0 g Agar en 1 L DI H2O. ajustar el pH a 5.7 aunque la adición de hidróxido de potasio de 5 M vigilando con una sonda de pH.
- Esterilizar las semillas por sacudiéndolos en 1% de lejía y SDS entre 15 y 30 min y enjuagar 4 veces con un volumen igual de agua por centrifugación. Una vez que las semillas son estériles, ponerlos a 4 ° C de 24 horas a 7 días para vernilization. El centro de recursos biológicos de Arabidopsis se describen otros métodos de esterilización, vernilization y crecimiento22.
- Añade a los medios de comunicación a mano con una densidad de 0,1 g/100 mL. Esta densidad se traduce en un promedio de 3 a 10 semillas por pozo de una placa de 96 pocillos.
- Lugar, a mano, cuatro plano de 96 pozos-placas de fondo en las habitaciones 1 y 2 del Hotel (Hotel A,figura 6). Poner una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en la montan@A cargador punta, un depósito de 300 mL llena con la mezcla de semilla de los medios de comunicación creada en pasos 2.1-2.3 en P3 y un depósito de 300 mL se llena con el 70% EtOH en P7 (figura 4, la cubierta y figura 6 Cubierta).
Nota: 2.5 a 2.8 se realizan con el software operativo. - Presentan habitaciones 1 y 2 en un Hotel y separar las pilas de cuatro placas. Coloque una placa en cada uno de los Alpes estático vacío (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 y P12). Carga AP96 P250 pipetas en el canal 96 200 μL cabeza.
- 90 μl del depósito de los medios de comunicación-semilla 300 mL en el P3 de aspirar y dispensar en el primer piso de 96 pocillos-placa inferior. Repita este proceso hasta que todas las ocho placas contienen la mezcla de semilla de los medios de comunicación.
- Limpiar las puntas de pipetas AP96 P250 por aspiración y dispensación 70 μl del depósito de 300 mL con 70% EtOH en P7. Lavar las puntas en la montan@A multicanal Tip lavar por aspiración y la dispensación de un 110% del volumen de agua cuatro veces, descargan las puntas en TL1 y recoger las placas con la mano.
3. adición de pequeñas moléculas a las placas de cribado
- Carga a mano, una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en habitación de Hotel 1 A, V dos de 96 pocillos-placas inferiores de la biblioteca del dilución en salas de 2, 4, 6 y 8 y dos 96 bien fondo plano proyección placas en salas de 3, 5, 7 y 9 (figura 4 Figura 7, un Hotel y apilador). Además, conecte las mangueras a y de la montan@A de lavado punta de multicanal para el depósito de 5 galones.
Nota: 3.2 a 3.10 se realizan con el software operativo. - Configurar la plataforma para contener un depósito de lavado 300 mL de 70% EtOH en P7; el depósito de semilla de los medios de comunicación puede dejarse en la cubierta en P3 (figura 4, Deck y figura 7, cubierta). Además, encienda la unidad de la consola a través de conexión del controlador de dispositivo para hacer circular agua a través de la ALP de lavado punta de multicanal. Esto apagará automáticamente al final del protocolo.
- Presentar el AP96 P250 pipeta Tip Box desde el Hotel A y a la ALP de cargador de punta.
- Presentan el V 96-bien-las placas inferiores de la biblioteca de dilución de 2 habitaciones de Hotel A la cubierta y coloque uno sobre P4 ALP estático y sobre P8. Presentar el plano de 96 pozos-placas de proyección de fondo de sala de 3 del Hotel a la cubierta y coloque una en ALP estática P5 y P9 otra.
- Carga AP96 P250 pipetas con el Punta cargador ALP en el canal 96 200 μL cabeza.
- Mezclar el V 96-Well-placa inferior de la dilución en P4 aspirando y dispensar 50 μl tres veces. A continuación, aspirar 10 μl de esta placa y dispensar en el plano de 96 pozos-placa inferior de la proyección en P5.
- Mezclar las soluciones de la placa en el P5 por aspirar y dispensar 50 μl tres veces. Limpiar las puntas de pipetas AP96 P250 con etanol por aspiración y dispensación 70 μl de 70% EtOH desde el embalse de P7 y luego lavar las puntas en el multicanal punta lavado ALP por aspiración y la dispensación de un 110% del volumen de agua cuatro veces.
- Repita los pasos del 3.5 y 3.6 para la segunda V 96-Well-placa inferior de la biblioteca de dilución (P8) y plano de 96 pozos-placa inferior de la proyección (P9).
- Pila los dos 96-Well V-placas de dilución biblioteca inferiores juntas y las dos placas de proyección de fondo plano de 96 pozos juntas. Hacia las placas estáticas Alpes P1 P2, P6, P10, P11, P12 y P13.
- Repita los pasos 3.4 3.9 tres veces, añadiendo productos químicos diluidos a proyección placas un total de ocho veces. Por último, compruebe el número de semillas en cada pocillo de las placas de cribado a través de la conformación visual y complementar esos pozos con menos de tres semillas por semillas esterilizadas y vernalized adicionales.
4. incubación y la visualización de las placas de cribado
- Incubar las placas de Screening de 96 pocillos fondo plano durante cuatro días en una cámara ambiental a 22 ° C en un ciclo de luz/oscuridad de 16/8 en un contenedor de prueba de desecación. Visualizar la placas de 96 pocillos de fondo plano de detección con un microscopio de disección. Registrar todos los fenotipos aberrantes para la posterior investigación.
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Representative Results
La capacidad con precisión y eficiencia caracterizan fenotipos basados en la adición de pequeñas moléculas en concentraciones debajo de un microscopio de disección de detección es el objetivo final de este método de avance genética química en Arabidopsis. Los fenotipos observados cuando todos los compuestos de 50.000 habían sido defendidos era diversos y podría ser dividido en varias clases distintas (figura 2). Figura 3A -F muestra ejemplos de fenotipos que se observaron en la ampliación baja debajo de un microscopio de disección. Algunos fenotipos proporcionan resultados no concluyentes (figura 3, H). Éstos tuvieron que ser reexaminados en concentraciones más bajas para asegurar que el producto químico no prestar un fenotipo diferente en una dosis más baja.
Pobres resultados pueden surgir por muchas razones. Uno es las tasas de mala germinación de las semillas. Esto puede provocar una placa de detección predominante exhibir ninguna germinación o fenotipos de germinación incompleta (figura 3, H), que puede ser engañosa. Para superar esto, comprobación preliminar de las tasas de germinación de todas las semillas que utiliza. Una vez que las tasas de germinación se han establecido y son más del 95% para Arabidopsis, vernalización de las semillas antes de la adición química es un paso clave garantizar la germinación simultánea. Falta de germinación simultánea puede llevar a falsos positivos en fenotipado. Además de esto, pueden surgir resultados pobres si se permitieron que los medios de comunicación que se evapore durante la incubación. Esta falta de hidratación impide la germinación de semillas y puede evitarse mediante el uso de contenedores a prueba de desecación. Además, soluciones de DMSO y medios de comunicación en las dos columnas exteriores de cada placa, asegurando adecuados micro climas y se obtienen tasas de germinación.
Resultados experimentales satisfactorios se logran cuando las tasas de germinación > 95%, las semillas son vernalized antes de la adición en placas de 96 pozos de fondo plano, asegurando la germinación simultánea, y los medios de comunicación no se evaporan durante la incubación. Idealmente, serían probados productos químicos en una concentración que permite todas las semillas a germinar y fenotipos evaluarse con precisión (Figura 3A-F). La mayoría de las plántulas de tratamientos producidas con fenotipos que son visualmente indistinguibles de controles simulacros con ninguna fenotipos morfológicos (Figura 3A), con la gran mayoría de los fenotipos aberrantes de blanqueado y severamente retraso en el crecimiento de las raíces (figura 2).
Figura 2: los fenotipos más comunes observados y la proporción de cada fenotipo observado. A) un total de 3.271 pequeñas moléculas fueron encontrados para ser bioactivos en 100 μm después de cuatro días de incubación. El color indica la severidad del fenotipo (negro = más severa, blanco = menos severa). Los más comúnmente observados fenotipo corresponde a la morfología de la raíz, con más de 1.500 compuestos inducir raíces atrofiadas de la severidad diversa. Coloración también fue afectada por los compuestos en esta biblioteca, con 1.148 plántulas registradas como blanqueado totalmente o parcialmente descoloridos. Casi 400 compuestos producen fenotipos característicos pelos – o retraso en el crecimiento o retraso en el crecimiento tanto de colores brillantes. Finalmente, la germinación fue afectada por compuestos menos 200. En estos casos, las semillas no se ha completado la germinación o incluso no comenzó a germinar. B) plántulas exhibe anormalidades en la morfología de la raíz, o retraso en el crecimiento o severamente atrofiadas, constituía casi la mitad de todas las plántulas fenotípicamente aberrantes. El siguiente grupo más grande fueron las que dieron lugar a plántulas blanqueadas o decoloradas. Fenotipos que pertenecían a anormalidades del pelo de la raíz también compuestas una porción considerable mientras que la inhibición de la germinación, o ninguna germinación o germinación incompleta, sólo se produjeron en un pequeño porcentaje de todos los compuestos bioactivos. Por último, había un número de fenotipos que se produjo a baja frecuencia, se agruparon en la categoría 'otros', un ejemplo de ello fue la producción de mucílago verde, visto en la figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imágenes de fenotipos representativos observaron durante la pantalla de adelante genética química. No anormalidades morfológicas visibles (A), marrones pelos de la raíz (B), retraso en el crecimiento de la raíz (C), grave retraso en el crecimiento de raíz (D), blanqueado (E), verde mucílago (F), incompleta germinación (G) y no hay germinación (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resumen de la 10 de apilador y cubierta establecido antes de la iniciación del Protocolo de. El carrusel del apilador se compone de cuatro apilador 10 (Hoteles A - D) que acomodar diez habitaciones. La cubierta tiene una variedad de los Alpes: el cargador de punta, el autobús de apilador, el lavado multicanal punta y 13 Alpes estática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: cubierta configurar para crear una biblioteca de dilución y apilador 10. El 10 de Apilador de cuatro están cargados de cajas de AP96 P20 pipetas en salas de 1 y 6 de hoteles A - D y pilas de 4 V de 96 pocillos-placas inferiores en habitaciones 7-9 2-5 y habitaciones de hoteles A - D. El diseño de la cubierta se compone de dos depósitos de 300 mL en Alpes P3 y P7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: cubierta y apilador 10 configurado para agregar mezcla de semilla de los medios de comunicación a las placas de cribado. El 10 de apilador está cargado con cuatro planos de 96 pocillos-placas de fondo en las habitaciones 1 y 2 del Hotel A. El diseño de la cubierta se compone de dos depósitos de 300 mL en estática Alpes P3 y P7 y una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en TL1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: cubierta y apilador 10 creado por adición de pequeñas moléculas a las placas de cribado. El 10 de apilador es cargado con una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en la habitación 1, una pila de dos V 96-Well-dilución de la parte inferior placas en habitaciones de 2, 4, 6 y 8 y una pila de dos piso de 96 pocillos-placas inferiores llenan con la mezcla de semilla de los medios de comunicación en 3 habitaciones , 5, 7 y 9. El diseño de la cubierta se compone de dos depósitos de 300 mL en estática Alpes P3 y P7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo está diseñado para ayudar a los investigadores a lograr una pantalla adelante genética química en Arabidopsis. Proporcionamos resultados representativos desde una pantalla de 50.000 compuestos (figura 2 y figura 3), una de las más grandes pantallas adelante genética química realizada en Arabidopsis a fecha9,13,23. El uso de un robot para manejo de líquidos permitido más eficiente biblioteca de dilución y proyección generación biblioteca, mejorando la velocidad y la eficiencia de la identificación de nuevos compuestos. Aumentando la capacidad de pantalla en una naturaleza de alto rendimiento fue acompañado por la disminución de mano de obra en nombre de la investigadora. Esta técnica fue diseñada para usarse con placas de 96 pocillos, donde se pueden alojar pequeñas semillas o plantas visibles bajo un microscopio de disección. Utilizando placas con pozos más grandes para adaptarse a las semillas más grandes requerirá modificaciones en el diseño y rendimiento.
Limitaciones adicionales de esta técnica incluyen la dificultad de utilizar este pedazo de equipo con técnicas asépticas; sin embargo, no encontraron altos porcentajes de contaminación debido a los medios MS ½ carecer de sacarosa. Uno podría evitar cualquier problema de contaminación por colocar el robot en una sala estéril, permitiendo para el cultivo de células y las condiciones de esterilidad, o usando un robot de manejo de líquidos en una cámara estéril24,25. Otra limitación es el tamaño de la boquilla y la aspiración de semilla. Obstruir una pipeta pequeña como el P20 AP96 con semillas; por lo tanto, debe utilizarse una pipeta más grande para la dosificación de semillas y la mezcla de la solución.
Pasos críticos en este protocolo incluyen el etiquetado cuidadoso de todas las placas en la biblioteca de dilución y la biblioteca de la proyección, asegurando que en la orientación adecuada junto con el orden correcto cuando el robot de alimentación. Claro etiquetado y tratamiento sistemático es sencilla y puede resolver este problema. Otro paso crítico es asegurar que el equipo está en el lugar correcto antes de comenzar el experimento, dentro de los 10 de apilador y en la cubierta. Si el equipo no está bien colocado en la cubierta, el canal 96 200 μL cabeza podría chocar, dañar el instrumento y que requieren mantenimiento. Otro paso crítico es asegurar que la cantidad correcta de líquido se coloca dentro de los depósitos de 300 mL y que esta cantidad se escribe correctamente en el software. Si los números no coinciden, las puntas no llega el líquido y la aspiración no se producirá.
También es necesario tomar medidas para garantizar la exactitud de los resultados obtenidos. Un error que hemos observado durante el desarrollo del protocolo fue vinculado a punta de vida. Después de sucesivos de carga y descarga, las puntas pierden su capacidad para aspirar y dispensar con precisión. Por lo tanto es imperativo que cada juego de 96 puntas utiliza un máximo de cuatro veces. También es importante cambiar el agua regularmente para evitar el potencial para los productos químicos que inadvertidamente se añade a las placas de cribado. Por último, algunos productos químicos tienen una tendencia a precipitado fuera de solución26. Para asegurar que cada producto químico se agrega a la concentración correcta, pasos mezcla se incorporan en la dilución y el protocolo de investigación. Mezcla podría resultar en bajas cantidades de sustancias químicas siendo agregados de biblioteca a biblioteca, desafiante interpretación del potencial químico inducido por fenotipos.
También es muy importante usar las placas correctas para cada parte del protocolo. Las placas inferiores V están diseñadas para asegurar que pequeños volúmenes de líquido pueden ser aspirados y se recomiendan para uso en la creación de la biblioteca de dilución. Sin embargo, estas placas no son adecuadas para la proyección parte del Protocolo, puesto que su reflexión de la luz conduce a la mala visualización de los fenotipos. Para observar los fenotipos de 3 a 4 días las plántulas viejas, la pantalla debe llevarse a cabo en placas de fondo plano.
Una vez que se han creado las placas de detección, visualización es necesaria. placas de 96 pozos fondo plano permiten fácil visualización bajo microscopios de disección. Es imprescindible que las placas se almacenan en contenedores a prueba de desecación para reducir la evaporación de los medios de comunicación. Una alternativa a la visualización microscópica está utilizando un escáner de alta resolución. Imágenes en alta resolución revelan la mayoría de los fenotipos observados en esta pantalla y proporcionan un archivo de los resultados que pueden ser revisadas en el futuro. Una vez que la visualización es completa, y proyectó la biblioteca de su elección, este método podría entonces realizar en diferentes organismos o con una biblioteca de química diferentes. Podrían permitir modificaciones en el equipo de cultivo estériles, permitiendo que empresas en el Reino de las células madre, hongos, insectos y pequeñas plantas2,18,25,27.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a Jozsef cigüeña, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue y Andrea Sánchez para la discusión crítica y constructiva. El Dr. Sharyn Perry para las fotografías fenotípicas. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo cooperativa acuerdo no. 1355438.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
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