Summary

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Published: July 03, 2018
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Summary

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Abstract

Polymodal Ionenkanäle transduzieren mehrere Reize unterschiedlicher Art in allosterische Änderungen; Diese dynamische Konformationen sind schwierig zu bestimmen und nach wie vor weitgehend unbekannt. Mit den jüngsten Fortschritten in einzelne Partikel Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Licht auf die strukturellen Merkmale der Agonist Bindungsstellen und Aktivierungsmechanismus mehrere Ionenkanäle ist das Bühnenbild für dynamische Tiefenanalyse der ihre Anspritzung Mechanismen mit spektroskopischen Methoden. Spektroskopische Techniken wie Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron-Resonanz (Hirsch) wurden vor allem auf das Studium der prokaryotischen Ionenkanäle beschränkt, die in großen Mengen gereinigt werden können. Die Voraussetzung für große Mengen von funktionalen und stabilen Membranproteinen hat das Studium der Säugetier-Ionenkanäle, die durch diese Ansätze behindert. EPR und Hirsch bieten viele Vorteile, einschließlich der Bestimmung der Struktur und dynamischen Veränderungen der mobilen Protein Regionen, wenn auch mit geringer Auflösung, der durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM zu schwierig sein könnte, und Überwachung, reversible Anspritzung Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Hier bieten wir Protokolle für den Erhalt der Milligramm funktionale Waschmittel solubilisiert Transienten Rezeptor potenzielle kation Unterfamilie V Kanalmitglied 1 (TRPV1), die EPR und Hirsche Spektroskopie bezeichnet werden kann.

Introduction

Mit den jüngsten Fortschritten in der Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) wurden Säugetier-Ion Kanalstrukturen zu einem außergewöhnlichen Preis gewonnen. Insbesondere haben strukturelle Studien Polymodal Ionenkanäle, wie z. B. die Transienten Rezeptor potential Vanilloid 1 (TRPV1), weitere Verständnis für seine Aktivierung Mechanismen1,2,3, zur Verfügung gestellt 4 , 5. dynamischer Informationen über Ionenkanäle in einer Membran-Umgebung eingebettet ist jedoch erforderlich, ihre Polymodal gating und Medikament-Bindung Mechanismen zu verstehen.

Elektron-PARAMAGNETISCHE Resonanz (EPR) und doppelte Elektron-Elektron Resonanz (Hirsch) Spectroscopies haben einige der am meisten definitive mechanistische Modelle für Ionen-Kanäle6,7,8,9 , zur Verfügung gestellt , 10 , 11 , 12 , 13. diese Ansätze wurden hauptsächlich beschränkt sich auf die Prüfung der prokaryotischen und Archeal Ion Kanäle, liefern eine große Menge an Waschmittel-gereinigte Proteine als bei Bakterien überexprimiert. Mit der Entwicklung der Eukaryoten Membran Proteine Produktion in Insekt und Säugerzellen für funktionelle und strukturelle Charakterisierung14,15,16ist es jetzt möglich, biochemische zu erhalten Mengen von Waschmittel-gereinigte Proteine für spektroskopische Untersuchungen.

Die EPR und Hirsche Signale ergeben sich aus ein Paramagneticspin Etikett (SL) (d.h. Methanethiosulfonate), ein Single-Cystein Rückstand in das Protein. Die Spin-Etiketten Berichten drei Arten von Strukturinformationen: Bewegung, Erreichbarkeiten und Entfernungen. Diese Informationen ermöglichen es, festzustellen, ob Rückstände innerhalb des Proteins liegen oder der Membran oder wässrigen Umgebung in die Apo und Liganden-gebundenen Staaten13,17,18,19ausgesetzt sind. Im Rahmen einer hochauflösenden Struktur (wenn vorhanden) bieten die EPR und Hirsch-Daten eine Auflistung von Einschränkungen für die Ableitung von dynamischer Models in ihrer natürlichen Umgebung während der Überwachung reversible gating Übergang (d.h., geschlossen, offen, sensibilisiert und desensibilisiert). Darüber hinaus konnte flexibele Regionen, die möglicherweise schwierig zu bestimmen, durch Röntgen-Kristallographie oder Cryo-EM abgerufen werden, mithilfe dieser ökologischen Datensätze zum Sekundärstrukturen sowie Lage innerhalb der Protein-20zuweisen. Cryo-EM Strukturen erhalten in Lipid-Nanodiscs zur Verfügung gestellt, wertvolle Informationen über die Anspritzung von Ionen-Kanäle3,21,22,23,24, 25; Spektroskopische Methoden könnte jedoch dynamischen Informationen von Konformationsänderungen Staaten (z.B. thermische Veränderungen) bieten, die möglicherweise schwer zu bestimmen, mit Cryo-EM.

Viele Schwierigkeiten müssen überwunden werden, um die EPR und Hirsch, einschließlich Mangel an Proteinfunktion, wenn Sie alle Cystein Rückstände (besonders reichlich in Säugetieren Kanälen), eiweißarme Ausbeute, Protein Instabilität während der Reinigung und nach Spin labeling entfernen umzusetzen , und Proteinaggregation in Spülmittel oder Liposomen. Hier haben wir Protokolle dieser kritischen Barrieren zu überwinden und haben informierten sich Rehe und EPR Spektren für ein Säugetier sensorischer Rezeptor ausgelegt. Hierbei ist es, Methoden zu beschreiben, denn der Ausdruck, Reinigung, Kennzeichnung und Wiederherstellung einer funktionellen minimal Cystein-weniger Ratte TRPV1 (eTRPV1) für spektroskopische Analysen zu konstruieren. Diese Methode eignet sich für diese Membranproteine, die halten ihre Funktion trotz der Entfernung von Cystein Rückstände oder Cystein bildet Disulfid-Bindungen enthalten. Diese Sammlung von Protokollen könnte für die spektroskopische Analyse von anderen Säugetieren Ionenkanälen angepasst werden.

Protocol

1. TRPV1 Mutagenese Hinweis: Eine minimale TRPV1-Konstrukt für spektroskopische Analyse26 entstand aus dem Full-Length Cystein-weniger Kanal TRPV127 mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode (Abbildung 1). Dieses Cystein-weniger minimalste TRPV1 Konstrukt (bezeichnet als eTRPV1 im folgenden) besteht aus Rückständen 110-603 und 627-764. eTRPV1 wurde geklont in pMO (ein pcDNA3.1-basierte Vektor) für Funkt…

Representative Results

Funktionelle Charakterisierung des minimalen Cystein-weniger TRPV1 konstruieren (eTRPV1) und Single-Cystein Mutanten Der erste Schritt zur spektroskopischen Untersuchungen ist Ingenieur und Cystein-weniger Protein Konstrukte (Abbildung 2A), die sind funktionell und biochemische Mengen an Proteinen zu charakterisieren. eTRPV1 ist funktional wie von Ca2 + Bildgebung und TEVC (<strong class="xf…

Discussion

Aktuelle Technologien für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Membranproteine machten es möglich, ausreichende Mengen an Protein für spektroskopische Untersuchungen14,15,16,42zu erhalten. Hier haben wir diese Technologien, um auszudrücken, zu reinigen, rekonstruieren und spektroskopische Analysen in TRPV1 angepasst.

Unter den kritischen Schritten in das Proto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind sehr dankbar, Dr. H. Mchaourab für den Zugriff auf die EPR und Hirsche Spektrometer und Dr. T. Rosenbaum für die Bereitstellung der Full-Length Cystein-weniger TRPV1 Plasmid.

Materials

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent Technologies 210519-5
2-Propanol (Isopropanol) Fisher Scientific A416
Albumin Bovine Serum (BSA) GoldBio.com A-420-10
Amylose resin NEB E8021L
Aprotinin GoldBio.com A-655-25
Asolectin from Soybean Sigma 11145
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen Life Technologies 10359016
Biobeads SM-2 Adsorbents  Bio-Rad 152-3920
Borosilicate glass pipettes (3.5'') (oocyte inyection) Drummond Scientific 3-000-203 G/X
Borosilicate glass pipettes (oocyte recordings) Sutter Instrument B150-110-10HP
CaCl2 2H2O Fisher Scientific C79
Carbenicillin (Disodium) GoldBio.com C-103-5
Cellfectin Reagent Invitrogen Life Technologies 10362-010
cellSens Olympus
Chloroform Fisher Scientific C606SK
Collagenase Type 1 Worthington-Biochem LS004196
Critiseal VWR 18000-299
D-(+)-Glucose Sigma  G8270
D-(+)-Maltose Monohydrate Fisher Scientific BP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside) Anatrace D310S
High glucose medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma D0572 
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 45-000-148
EGTA Fisher Scientific O2783
Fetal Bovine Serum Invitrogen Life Technologies 10082-147
Fluo-4 AM Life Technologies F-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Science, Inc 2160250
GenCatch PCR Cleanup Kit Epoch Life Science, Inc 2360050
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
Glass capillary (25 µl) VWR 53432-761
Glass Flask 2800 mL Pyrex USA 4423-2XL
Glycerol Fisher BioReagents BP229
HEK293S GnTl- ATCC CRL-3022
HEPES Sigma  H4034
IPTG (isopropyl-thio-B-galactoside) GoldBio.com I2481C25
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific BP906-5
KCl Fisher Chemical P217
LB Broth, Miller Fisher bioReagents BP1426
Leupeptin Hemisulfate GoldBio.com L-010-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen Life Technologies 11668-019
MgCl2 6H2O Fisher Scientific BP214
MgSO4 7H2O Fisher Scientific BP213
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Ambion AM1344
MOPS Fisher bioReagents BP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Methanethiosulfonate Toronto Research Chemicals, Inc O873900
NaCl Fisher Chemical S271
Opti-MEM Life Technologies 31985-062
Pepstatin A GoldBio.com P-020-5
Pluronic Acid F-127 (20%) PromoKine   CA707-59004
PMSF GoldBio.com P4170
Poly-L-lysine Solution Sigma-Aldrich P4707
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Sealed capillary VitroCom special order
SF-900 II SFM (insect cell medium) Gibco, Life Technologies 10902-088
Sf9 Cells (SFM Adapted) Invitrogen Life Technologies 11496-015
Soybean Polar Lipid Extract Avanti Polar Lipids, Inc 541602C
Sucrose Fisher Scientific S25590
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare 29091596
TCEP HCl GoldBio.com TCEP1
Tetracyclin Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100
Tris Base Fisher BioReagents BP152
Tryptone Difco 0123-01
X-gal GoldBio.com X4281C
Xenopus oocytes Nasco LM00935M
XL1 – Blue Competent Cells Agilent Technologies, Inc 200249
Yeast Extract Difco 0127-01-7
Econo-Pack chromatography column Bio-Rad 7321010
Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Precast Gels Bio-Rad 17000436
pFastBac1 Expression Vector Invitrogen Life Technologies 10360-014
DH10Bac Competent Cells Invitrogen Life Technologies 10361-012
Critiseal capillary tube sealant Leica Microsystems 02-676-20
ABI Model 3130XL Genetic Analyzers Applied Biosystems 4359571
Transfer pipete Fishebrand 13-711-9AM
Nanoject II Drummond Scientific 3-000-204

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Sierra-Valdez, F. J., Stein, R. A., Velissety, P., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis. J. Vis. Exp. (137), e57796, doi:10.3791/57796 (2018).

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