Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Vi beskriver metoder til at isolere canine neutrofiler fra fuldblod og visualisere netto dannelse i live neutrofiler ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Også beskrevet er protokoller at kvantificere netto dannelse og citrullinated Histon H3 (citH3) udtryk ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi.

Abstract

Som reaktion på invaderende patogener, frigive neutrofiler neutrofile ekstracellulære fælder (net), som er ekstracellulære netværk af DNA dekoreret med histoner og antimikrobiel proteiner. Overdreven netto dannelse (NETosis) og citH3 udgivelse under sepsis er forbundet med flere funktionsforstyrrelser og dødelighed i mus og mennesker, men dens konsekvenser i hunde er ukendt. Heri, beskriver vi en teknik til at isolere canine neutrofiler fra fuldblod for observation og kvantificering af NETosis. Leukocyt-rich plasma, genereret af dextran sedimentering, er adskilt af kommercielt tilgængelige tæthed gradient adskillelse medier og granulocytter indsamlet celle antal og levedygtighed afprøvning. For at overholde real-time NETosis i live neutrofiler, føjes celle permeant og celle impermeant fluorescerende nukleinsyre pletter til neutrofiler aktiveret enten af LPS (LPS) eller phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA). Ændringer i nukleare morfologi og netto dannelse er observeret over tid af Fluorescens mikroskopi. In vitro NETosis er yderligere karakteriseret ved co-colocalization af celle-gratis DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) og citrullinated Histon H3 (citH3) bruger en modificeret dobbelt-immunolabelling protokol. For at objektivt kvantificere netto dannelse og citH3 udtryk ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, redskaber og citH3-positive celler er kvantificeret i en blindet måde ved hjælp af tilgængelige software. Denne teknik er en specifik assay til at evaluere in vitro- kapaciteten af canine neutrofiler til at gennemgå NETosis.

Introduction

Neutrofiler er kortlivede granulocytter ansvarlig for den indledende forsvar mod invaderende patogener. Neutrofiler, rekrutteret til infektionsstedet, fjerne mikroorganismer ved fagocytose, degranulering og generation af reaktive ilt arter (ROS)1. Bakterier eller endotoksiner dekoreret neutrofiler release neutrofile ekstracellulære fælder (net), sammensat af ekstracellulære kromatin med histoner og granulerede proteiner som elastase og myeloperoxidase (MPO)2. Selv om NETs har uundværlig antimikrobielle egenskaber, tyder øge eksperimentel og klinisk dokumentation på, at nidkære netto dannelse under sepsis kan føre til flere organ dysfunktion og død3,4, 5 , 6.

Fordi net kan spille en lignende patofysiologiske rolle i hunde, kan terapeutiske indgreb, der enten forhindre eller mindske netto dannelse tjene som roman behandling strategier i septisk dyr. Derfor er der behov for en pålidelig teknik til at vurdere og bestemme NETosis og netto komponenter i hunde. NETTO komponenter, herunder celle-gratis DNA (cfDNA) og nucleosomes er tidligere blevet evalueret i canine neutrofile og plasma fra kliniske hunde7,8,9. Ved hjælp af fluorescens assays, fundet Goggs og Letendre at septisk hunde have højere niveauer af cfDNA end sunde hunde8. Selv om disse teknikker er meget objektive og kvantitative, er måling af cfDNA og nucleosomes som markører for NETosis uspecifikke, da de kan være afledt af nekrotiske celler end NETosing neutrofiler. Her beskriver vi en teknik, der udnytter Fluorescens mikroskopi for at undersøge adfærd af levende NETosing neutrofiler. Vi detalje også en modificeret protokol bruger dobbelt-immunolabeling til subjektivt kvantificere redskaber og deres komponenter såsom MPO og citH3 i canine neutrofiler10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der beskrives her blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of California, Davis (protokol nummer: 18338).

1. indsamling

  1. Trække 10 mL af blodet fra enten cephalic eller jugularis venen ved hjælp af en 21 G nål ved sprøjte aspiration.
  2. For at undgå overdreven shear stress, fjerne nål fra sprøjten inden flytningen blod ind i røret indeholdende natrium heparin (75 USP). Forsigtigt invertere rør et par gange at sikre tilstrækkelig blanding af antikoagulans og blod. Kontrollere for tegn på blodpropper eller red cell aggregater før du placerer prøverne på is.

2. neutrofile Isolation

  1. Fortynd antikoaguleret blod med et lige saa stort volumen af iskolde Dubecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) (pH 7,4, uden divalent kationer). Overføre 8 mL fortyndet blod ind i en 50 mL polypropylen koniske rør indeholdende 25 mL 3% dextran (fra Leuconostoc spp. opløst i 0,9% natriumchlorid løsning). Røret anbringes lodret i stuetemperatur i 30 min. at tillade sammenlægning og sedimentation af erytrocytter.
  2. Omhyggeligt lag 5 mL af leukocyt-rich plasma (figur 1) på toppen af 5 mL af tæthed gradient medier i et 14 mL polypropylen runde-nederste rør. Vær omhyggelig med ikke at blande 2 løsninger11.
  3. Der centrifugeres rør på 400 x g med acceleration/deceleration (A/D) er sat til 0 (ingen bremse) i 30 min ved stuetemperatur.
  4. Ved hjælp af en 5 mL serologisk afpipetteres indsamle granulocyt cellelag af omgåelse plasma og perifert blod mononukleære celler (PBMC) lag (figur 1). Brug en ny afpipetteres hver gang til at minimere forurening.
  5. Plads 4-6 mL af polymorphnuclear (PMN) cellelag i et 50 mL polypropylen koniske rør. Da en lille mængde af erytrocyt aggregater kan være indsugning sammen med PMN lag, skal du bruge en 1 mL serologisk afpipetteres forsigtigt fjerne de erytrocyt aggregeringer, der afvikles i bunden af røret.
  6. Lyse de resterende erythrocytter med 20 mL koldt ultrarent vand. Forsigtigt Vend røret flere gange for 30 til 60 s for at sikre tilstrækkelig lysing før du tilføjer et lige saa stort volumen af iskold 1,8% natriumchlorid løsning.
  7. Der centrifugeres ved 112 x g i 10 min. ved 4 ° C, A/D er sat til 0.
  8. Gentag erytrocyt lysis trin, hvis dette pellet vises rødt. Supernatanten omhyggeligt med en serologisk pipette og forsigtigt resuspenderes i 100 µL af DPBS (5 mM dextrose, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 og 1% bovint serumalbumin, pH 7.3). Kombiner alle resuspenderet celler og Anbring på is.
  9. Udføre en celletal, ved hjælp af en automatiseret celle analyzer og kontrollere Greven af en hemocytometer. Om fornødent koncentrere sig PMNs til et glas dias ved hjælp af en cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) og bestemme procentdelen af neutrofiler ved at tælle antallet af neutrofile ud af det samlede antal celler.
  10. Fastlægge levedygtigheden af neutrofiler ved at udføre en trypan blå udstødelse test, som beskrevet af Strober et al. 12 succesfulde isolation bør give en rentabilitet fra 95 til 100% og neutrofile bør være mere end 95%.
  11. Bestemme koncentrationen af neutrofile ved at multiplicere de samlede celletal med procent levedygtighed og procent neutrofiler. Vellykket isolation bør give en koncentration af neutrofiler fra 1,5 til 6 x 106/mL.
  12. Fortynd neutrofiler til en endelig koncentration på 1 x 106/mL med DPBS indeholdende 5 mM dextrose, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2og 1% bovint serumalbumin med pH justeret til 7,3.

3. fluorescerende mikroskopi af levende neutrofiler

  1. Sted 200 til 400 μL af neutrofiler (1 x 106/mL) i hver brønd med en poly-L-lysin belagt 12-godt kultur plade. Tillad neutrofiler at holde sig til bunden af brøndene ved at inkubere celler ved 37 ° C i 30 min.
  2. Label nukleinsyrer med 1 μM af en af to nukleinsyre farvestoffer, som pletter i celler med intakte membraner og som pletter i celler med gennemtrængelige membraner (Se Tabel af materialer), i 10 min ved stuetemperatur.
  3. Aktivere neutrofiler med 100 μg/mL LPS (LPS) (E. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) som positiv kontrol, eller svarer til mængden af DPBS som negativ kontrol i 180 minutter ved 37 ° C.
  4. Erhverve billeder ved hjælp af normal god landbrugspraksis (Excitation: 470/22 nm, Emission: 525/50 nm) og Texas rød kanaler (Excitation: 585/29 nm, Emission: 628/32 nm) på et Fluorescens mikroskopi på 40 X forstørrelse på følgende tidspunkter: 30, 90, 120, og 180 min.

4. netto kvantificering og påvisning af netto komponenter ved hjælp af immunfluorescens

  1. Omhyggeligt placere 18 mm diameter Poly-D-lysin belagt dæksel glider ind i huller i en 12-godt kultur pladen. Label brøndene korrekt.
  2. Frø 100 til 200 μl isoleret neutrofile (1 x 106/mL) direkte på coverslips og tillade neutrofiler at tiltræde dæksel glider af inkubere celler ved 37 ° C i 30 min.
  3. Aktivere neutrofiler, som beskrevet i punkt 3.3. Hæmmer netto dannelse af forbehandling neutrofiler med 200 µΜ Cl-amidine (15 min, 37 ° C) før aktivering som tidligere beskrevet af Li et al. 13 Sørg for at korrekt køretøj kontrol (DMSO) er inkluderet i eksperimentet.
  4. Fjern forsigtigt dækslet underkjoler med fine pincet. Lag en paraffin film ark over et reagensglas stå at oprette brønde og sted 2 til 3 dråber af 4% PFA i hver godt10. Etiket brøndene passende og forsigtigt lægge dæksel glider op og ned på PFA-fyldt brøndene. Tillad celler til at være fast ved stuetemperatur i 20 min.
  5. Vaske cellerne 3 gange i DPBS i 5 min, ved at flytte dem fra en brønd til næste.
  6. Hvis immunolabelling ikke kan udføres kort efter neutrofile aktivering og fiksering, tillade dække podekviste skal være luft tørret ved at placere dæksel glider ansigt op på et stykke papir, absorbans. Dæksel glider kan opbevares i op til 1 uge opad i en mærket 12-godt kultur plade ved 4 ° C indtil videre analyse. Vaske cellerne 3 gange i DPBS i 1 minut ved hjælp af samme teknik som beskrevet i 4.4, før du fortsætter til næste trin.
  7. For at permeabilize celler, forsigtigt lægge dække glide op og ned på et fald på 1% NP-40 i 1 minut ved hjælp af teknikken beskrevet i 4.4. Vask 3 gange i DPBS for 1 min på en rocker.
  8. Tilfældigt tildele et nummer hver prøve og bruge en diamant punkt markør til at mærke coverslips i overensstemmelse hermed.
  9. Forberede og etiket individuelle petriskåle foret med paraffin film og placere 100 til 200 μl af 5% ged serum på filmen (blokerende buffer). Læg coverslips op og ned på den blokerende buffer. Sted på en rocker og Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
  10. Vask 3 gange i DPBS i 5 min på en rocker.
  11. Fortynd den primære antistof (1: 400 kanin polyklonale anti-citrullinated Histon H3 (citH3) i 5% ged serum). Inkuber celler i mærket petriskåle foret med paraffin film. Lægge hver dække glide op og ned på 50 til 100 μl af de fortyndede antistof løsning. Sted på en rocker og Inkuber i 1 time ved 37° C.
  12. Vask 3 gange i DPBS i 5 min på en rocker.
  13. Fortyndet sekundær antistof konjugeret med et fluorophore (1:200) i 5% ged serum. Inkuber celler i mærket petriskåle foret med paraffin film. Lægge hver dække glide op og ned på 50 til 100 μl af de fortyndede antistof løsning. Sted på en rocker og inkuberes 1 h ved 37 ° C i mørke.
  14. Vask 3 gange i DPBS i 5 min på en rocker i mørke.
  15. For samtidige påvisning af myeloperoxidase (MPO) Følg følgende trin til en modificeret dobbelt immunolabeling protokol som beskrevet af Li et al. 13
  16. Inkuber celler i mærket petriskåle foret med paraffin film. Lægge hver dække glide op og ned på 100 til 200 μl af 10% kanin serum under blid vuggende (overnatning, 4 ° C, i mørke).
  17. Vask 3 gange i DPBS i 5 min på en rocker i mørke.
  18. Inkuber celler i 50 μg/mL ukonjugeret ged anti-kanin Fab fragmenter i 2 timer ved stuetemperatur på en rocker i mørke.
  19. Vask 3 gange i DPBS i 5 min på en rocker i mørke.
  20. Fortynd primære antistof (1:200 kanin polyklonale anti-menneskelige MPO antistof) i 5% ged serum. Inkuber celler i mærket petriskåle foret med paraffin film. Lægge hver dække glide op og ned på 50 til 100 μl af de fortyndede antistof løsning. Sted på en rocker og inkuberes 1 h ved 37° C i mørke.
  21. Fortynd sekundær antistof konjugeret med et fluorophore i 5% ged serum og inkuberes som beskrevet i 4,8
  22. Vask 3 gange i DPBS i 5 min på en rocker i mørke.
  23. Interferens kontrol bør forberedes ved at udelukke inkubering med enten primære antistoffer i andet trin af immun-mærkning.
  24. Pletten DNA med 300 nM af 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dihydrochlorid (DAPI) i 5 min. i mørke ved stuetemperatur.
  25. Vask 3 gange i DPBS for 1 min på en rocker i mørke.
  26. Påfør en dråbe (~ 50 μl) af antifade praeparat på et glas dias. Tryk forsigtigt på kanten af coverslip på en absorberende papir til at fjerne overskydende buffer før montering coverslip med cellerne op og ned. Montering medium bør danne et tyndt lag mellem coverslip og glas dias. For at fjerne luftbobler, meget forsigtigt Tryk på coverslip med fine pincet.
  27. Tillad prøver at helbrede natten i mørke ved 4 ° C. Montering medium skal hærde til mikroskopisk analyse med fordybelse linser. Opbevare prøver i 4 ° C i mørke.

5. neutrofile ekstracellulære fælde kvantificering

  1. Blinde operatør(er) erhverve og analysere mikroskop billeder til de eksperimentelle betingelser.
  2. Ved hjælp af et fluorescens mikroskop på 40 X forstørrelse, tage 10 billeder tilfældigt fra forskellige regioner i hvert coverslip i et eksperiment under de respektive kanaler. Sikre at eksponeringstid, lysstyrke og kontrast for hver kanal holdes konsekvent i hele erhvervelse af billeder.
  3. Analysere billeder ved hjælp af tilgængelige software såsom ImageJ (NIH). Identificer net baseret på Co lokalisering af cfDNA, citH3 og MPO (figur 3A, B). Kvantificere antallet af net og neutrofile i 10 tilfældige felter for hver eksperimentelle betingelse. Numre af NETs udgivet kan udtrykkes som en ratio (antallet af net: samlede antal neutrofile) for hver eksperimentelle betingelse.
  4. For at evaluere effekterne behandling på intracellulære citH3 udtryk, tælle antallet af neutrofile med intracellulære citH3 og antallet af neutrofile uden intracellulære citH3 i 10 tilfældige felter på 40 X forstørrelse under de respektive kanaler ( Figur 3, røde pile). Intracellulær citH3 udtryk kan udtrykkes som forholdet mellem antallet af neutrofile med intracellulære citH3 til antallet af neutrofile uden intracellulære citH3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruger denne protokol af levende celle imaging, kan efterforskere observere nukleare morfologi, plasma membran integritet og tilstedeværelsen af cfDNA i levende neutrofiler. En celle impermeant nukleare farvestof pletter kerner syrer rød i celler med beskadiget cellemembraner. En anden celle-permeant farvestof, etiketter intracellulære nukleinsyrer i levende celler med intakte plasma membraner. Alle intakt neutrofiler, uanset deres behandlinger, der skal stå grøn og udviser de karakteristiske lobulated kerner på 0-30 min efter stimulation (figur 2A). Kerner af PMA-behandlede neutrofiler begynder at miste deres lobulated udseende af omkring 60 min og fortsætte til decondense indtil udgivelsen af cfDNA (figur 2B). LP'ER, en langsommere og mere fysiologisk stimulans af canine neutrofiler, typisk ikke medfører kromatin decondensation eller NETosis indtil 90 min efter stimulation (figur 2B). Af 120 min, kan LPS - og PMA-aktiveret neutrofiler ses omgivet af cfDNA. Sammenlignet med LP'ER, mister mere-PMA aktiveret neutrofiler deres plasma membran integritet som de farves røde af celle impermeant farvestof (figur 2 c). Unstimulated neutrofile (DPBS kontrol) bør opretholde lobulated kerner og intakt plasmamembran hele Inkubationstiden (figur 2A-C).

NETTO komponenter bestående af cfDNA, er citH3 og MPO granulat opdaget ved hjælp af den dobbelte immunolabeling protokol. Frigivelse af NETs, identificeret baseret på Co lokalisering af cfDNA, citH3 og MPO, svar på LP'ER og PMA er vist i figur 3A og 3B, henholdsvis. Neutrofiler stimuleret af LP'ER til 180 min. producerer diskrete web-lignende stilladser af net i tæt nærhed til nærliggende neutrofile (figur 3A). Derimod produceret PMA-aktiveret neutrofiler enorme mængder af net, der var mærkbart større i området (figur 3B, D). Citrullinering af histonerne H3, katalyseres af enzymet peptidylarginine deiminase (PAD), er kendetegnende for NETosis. PMA, en potent stimulerende pad, resulterer i et højere antal celler, der udtrykker intracellulære citH3 i forhold til unstimulated og LP'ER-stimuleret neutrofile (figur 3).

Figure 1
Figur 1: en skematisk diagram viser trinene i canine neutrofile isolation. Fortyndet heparinized fuldblod er først blandet med 3% dextran for sedimentation af røde blodlegemer (RBC). Leukocyt-rich plasma er derefter indsamlet og lagdelte på lige store mængder af kommercielt tilgængelige tæthed gradient adskillelse medier. Efter centrifugering (400 x g, 30 min), RBC-granulocyt lag er udvundet og de resterende røde blodlegemer er fjernet af hypotonic lysis. Efter tilsætning af 1,8% NaCl, granulocytter er spundet ned (112 x g, 5 min) og genopslemmes i dedikerede buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative fluorescerende billeder af levende canine neutrofiler. Isolerede neutrofiler blev aktiveret med 100 µg/mL LP'ER, 100 nM PMA, eller tilsvarende volumen af Dubeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) som negativ kontrol i alt 180 min. nukleinsyrer i live intakt neutrofiler var plettet grøn med hjælp af en celle-permeant farvestof, mens cfDNA og neutrofile med kompromitteret cellemembraner blev farvet rød med en celle-impermeant farvestof. (A, D) DPBS - og LP'ER-behandlede neutrofiler alle opretholdt en intakt cellemembranen med lobulated kerner (stjerne). (A, E) Kerner af PMA-aktiveret neutrofiler begyndte at gennemgå decondensation (pilespidser). (B, F) Ved 90 min, havde de fleste kerner i LPS - eller PMA-aktiveret neutrofiler mistet deres lobulated udseende (blå pilespidser). (C) efter 120 min, alle PMA-aktiveret neutrofiler havde gennemtrængelig plasma membraner omgivet af cfDNA, mens cfDNA kunne ses omkring et lille antal LPS-aktiveret neutrofile (pile). Unstimulated neutrofiler producerer ikke cfDNA og heller ikke havde kompromitteret cellemembranen til enhver tid (A-C). (A-B) Oprindelige 40 X forstørrelse. Skalalinjen = 100 µm. (D-F) 80 X forstørrelse. Skalalinjen = 30 µm. eksperiment blev replikeret to gange fra neutrofiler isoleret fra 3 forskellige donorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: netto dannelse. (A-C) Repræsentative immunfluorescent billeder af in vitro- nettet formation. Isolerede neutrofiler fra en enkelt donor var fast, permeabilized og farves for DNA (blå), myeloperoxidase (MPO, grønne) og citrullinated Histon H3 (citH3, red) efter stimulation med (A) 100 µg/mL LP'ER, (B) 100 nM PMA eller (C) DPBS for 180 min. er net, identificeres ved co lokalisering af cfDNA, MPO og citH3, skitseret (stiplet linje) på (A) LPS- og (B) PMA-aktiveret neutrofiler. Eksempler på intracellulære udtryk for citH3 er markeret med røde pile. C ingen redskaber eller intracellulære citH3 ses i unstimulated neutrofiler. Skalalinjen = 100 µm. (D, E) repræsentative boks og bakkenbart parceller af netto dannelse og intracellulære citH3 udtryk i neutrofile isoleret fra 4 hunde. Boksen strækker sig fra den 25th 75th percentiler og whiskers spænder fra den mindste til den største værdi. LP'ER og PMA stimulation resulterede i betydelige (D) netto dannelse og (E) intracellulære citH3 udtryk i forhold til unstimulated neutrofiler. + repræsenterer middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer her en protokol for at observere ændringer i kerner kropsbygning og cfDNA udgivelse i levende canine neutrofiler ved hjælp af både en celle permeant farvestof og en celle impermeant farvestof. Den største fordel ved denne analyse er, at det giver mulighed for real-time detektering af netto dannelsen af høj opløsning mikroskopi i live neutrofiler uden celle fiksering, derfor, at give et simpelt og værdifuldt redskab for observation i vitro netto dannelse. Da denne analyse ikke kræver antistoffer til påvisning af netto komponenter, er det ideelt til at studere NETosis i arter med begrænset tilgængelighed af artsspecifikke antistoffer. Ved hjælp af denne analyse, forfatterne påvist at hunde neutrofiler gennemgå kromatin decondensation under LP'ER eller PMA stimulation før NETosis13. En væsentlig ulempe ved denne teknik er, at det ikke er specifikke for NETosis. Fordi den celle impermeant farvestof pletter også nukleinsyrer i nekrotiske celler eller nukleinsyrer frigivet fra mængden neutrofiler, kunne cfDNA eller cellen impermeant-positive celler fortolkes fejlagtigt som redskaber eller NETosing neutrofiler. Alternativt, specificiteten af NETosis kan øges ved at inkludere PMA - eller LPS-aktiveret neutrofiler, som er forbehandlet med PAD4-hæmmer, Cl-amidine. Vi viste her betydningen af at sikre sterilitet og korrekt håndtering af neutrofiler i hele isoleret proces som forurening og enorme kræfter kan føre til in vitro- nekrose og celle lysering. Vi anbefaler også overholder de passende temperaturer hele protokollerne og forebygge langvarig (> 1 min.) hypotonic lysis. For at bekræfte levedygtigheden af isolerede neutrofiler overarbejde, er en Trypan blå udstødelse test samt en negativ kontrol består af unstimulated neutrofile stærkt anbefales.

Fordi cfDNA opdaget af celle-vandtætte nukleinsyre farvestoffer ikke er specifik for NETosis, udviklede vi en dobbelt-immunolabeling protokol for kvantificering af in vitro- NET dannelse og intracellulære citH3 udtryk i canine neutrofiler. Da neutrofile frigive kornede proteiner som MPO sammen med cfDNA og citH3 i det ekstracellulære rum, er netto kvantificering baseret på Co lokalisering af cfDNA, citH3 og MPO mere specifik i forhold til andre assays såsom cfDNA, nucleosomes eller DNA-MPO kompleks 14. på grund af de begrænsede mængder af antistoffer, der krydsreagere med canine proteiner, vi brugte primære antistoffer, der stammer fra en anden dyreart (kanin). For at forhindre hentning af primære antistoffer af resterende frie bindingssteder på sekundære antistoffer i enten trin i farvning processen, udnyttet vi først kaninserum efterfulgt af ukonjugeret Fab fragmenter til at mætte gratis bindingssteder. Et kritisk trin i denne procedure er at sikre tilstrækkelig vask for at undgå overskydende binding af immunoglobuliner og Fab fragmenter, som kan interferere med påvisning af anden protein af interesse. Vi anbefaler også teste forskellige fortyndinger af primære og sekundære antistoffer til at minimere uspecifik bindende og interferens. For at sikre, at de sekundære antistoffer fra enten immunolabelling trin bindes specifikt til dens primære antistof, bør efterforskere omfatter 2 forskellige kontrolelementer, der udelukker enten primære antistof i andet trin af immunolabelling. Ikke-specifik binding opstår, når signaler fra begge sekundære antistoffer er opdaget.

Histon citrullinering eller deamination, katalyseres af enzymet peptidylarginine deminase 4 (PAD4), er afgørende for bakterier-associerede NETosis i mus og mennesker15,16. Ved hjælp af denne analyse, var vi i stand til at bestemme, at LPS-induceret NETosis i hunde også kræver Histon H3 citrullinering af PAD13. For at teste, om stimulans af interesse inducerer NETosis af PAD4 aktivering, anbefaler vi optagelse af positiv kontrol bruge kendte PAD4 aktivatorer som PMA- eller calcium ionophor, A2318717. Hvis neutrofiler Vis negativ farvning for citH3 i positive kontrolprøverne, skal protokollen revideres før en tilstrækkelig positiv farvning er ført. Vi anbefaler også medtagelsen af biologiske negative kontroller bestående af enten unstimulated neutrofiler eller neutrofiler behandlet med PAD hæmmer, Cl-amidine.

Nøjagtig identifikation af forskellige redskaber struktur kan være en udfordring med denne teknik. Dette kan være særligt vanskeligt i prøver med omfattende NETosis, som en sammenlægning af netto strukturer frigivet fra flere tilstødende neutrofiler kan føre til undervurderingen af NETotic begivenheder. Resultaterne af denne analyse kan være korreleret med andre mere objektive assays som flowcytometri eller ELISA, som endnu ikke er blevet valideret til brug i canine neutrofiler. For at undgå dannelsen af sammenflydende netto struktur, kan efterforskere frø en lavere koncentration af celler. Alternativt, faldende de samlede inkubationstiden kan undgå omfattende NETosis og sammenlægning af netto strukturer. Selv om denne protokol kan bruges til at undersøge NETosis i andre arter, baseret på forfatternes erfaring, kan neutrofile svar til LP'ER eller PMA variere meget mellem arterne.

Opdagelsen af net i hunde fremhæver, at NETosis er en bevaret mekanisme af medfødt immunitet under mikrobiel infektion og immun-medieret sygdom. Assays præsenteres her kan være et værdifuldt redskab til undersøgelse af NETosis i hunde og andre arter. En bedre forståelse af sepsis-induceret NETosis vil lette yderligere forskning i udviklingen af nye behandling strategier for sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Tilsvarende forfatteren blev finansieret af Morris Animal Foundation (D15CA-907). Undersøgelsen blev støttet af midler fra University of California, Davis, Center for Equine sundhed og Center for Companion Animal Health (2016-24-F). Forfatterne vil gerne anerkende Geena Ng for hendes hjælp med tal og Nghi Nguyen for hendes hjælp med videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs. Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  3. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity. The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  4. Czaikoski, P. G., et al. Neutrophil Extracellular Traps Induce Organ Damage during Experimental and Clinical Sepsis. PLoS One. 11 (2), e0148142 (2016).
  5. Dwivedi, D. J., et al. Prognostic utility and characterization of cell-free DNA in patients with severe sepsis. Critical Care. 16 (4), R151 (2012).
  6. Mai, S. H., et al. Delayed but not Early Treatment with DNase Reduces Organ Damage and Improves Outcome in a Murine Model of Sepsis. Shock. 44 (2), 166-172 (2015).
  7. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  8. Letendre, J. A., Goggs, R. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).
  9. Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).
  11. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  12. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  13. Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase. Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).
  14. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  15. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  16. Leshner, M., et al. PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures. Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).
  17. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 138 immunofluorescens mikroskopi sepsis granulocyt isolation Histon citrullinering peptidylarginine deiminase
<em>In Vitro</em> Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, R. H. L., Tablin, F. In… More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter