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Immunology and Infection

इन विट्रो में कुत्ते न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58083
Automatic Translation
1, 2
1Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

हम पूरे रक्त से कुत्ते न्यूट्रोफिल को अलग करने और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग लाइव न्यूट्रोफिल में शुद्ध गठन कल्पना करने के लिए तरीकों का वर्णन । यह भी वर्णित प्रोटोकॉल के लिए शुद्ध गठन और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं ।

Abstract

रोगजनकों पर हमला करने के जवाब में, न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), जो histones और रोगाणुरोधी प्रोटीन के साथ सजाया डीएनए के extracellular नेटवर्क हैं । अत्यधिक शुद्ध गठन (NETosis) और पूति के दौरान citH3 रिहाई चूहों और मनुष्यों में कई अंग रोग और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, लेकिन कुत्तों में इसके निहितार्थ अज्ञात हैं । इस के साथ साथ, हम एक तकनीक का वर्णन करने के लिए पूरे रक्त से प्रेक्षण और NETosis के ठहराव के लिए कुत्ते न्यूट्रोफिल अलग । ल्युकोसैट-रिच प्लाज्मा, dextran अवसादन द्वारा उत्पंन, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल जुदाई मीडिया और सेल गिनती और व्यवहार्यता परीक्षण के लिए एकत्र granulocytes द्वारा अलग है । लाइव न्यूट्रोफिल में रीयल-टाइम NETosis का निरीक्षण करने के लिए, सेल permeant और सेल impermeant फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग को न्यूट्रोफिल (lipopolysaccharide) या एलपीएस 12-phorbol 13-myristate (पमा) द्वारा या तो सक्रिय करने के लिए जोड़ा जाता है । परमाणु आकृति विज्ञान और शुद्ध गठन में परिवर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा समय के साथ मनाया जाता है । इन विट्रो में NETosis आगे कोशिका मुक्त डीएनए (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) एक संशोधित डबल-immunolabelling प्रोटोकॉल का उपयोग कर के सह-colocalization द्वारा विशेषता है । शुद्ध गठन और citH3 अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जाल और citH3-सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक अंधा तरीके से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर quantified हैं । इस तकनीक को एक विशिष्ट परख के लिए इन विट्रो में कुत्ते न्यूट्रोफिल की क्षमता का मूल्यांकन NETosis से गुजरना है ।

Introduction

न्यूट्रोफिल कम रहते है granulocytes हमलावर रोगजनकों के खिलाफ प्रारंभिक सुरक्षा के लिए जिंमेदार है । न्यूट्रोफिल, संक्रमण की साइट के लिए भर्ती, phagocytosis, दानेदार, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS)1की पीढ़ी द्वारा सूक्ष्मजीवों को खत्म । बैक्टीरिया या endotoxins की उपस्थिति में, न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), extracellular और क्रोमेटिन और histones (elastase)2की तरह दानेदार प्रोटीन के साथ सजाया myeloperoxidase से बना । हालांकि जाल अपरिहार्य रोगाणुरोधी गुण है, बढ़ती प्रयोगात्मक और नैदानिक सबूत पता चलता है कि पूति के दौरान अति उत्साही शुद्ध गठन कई अंग रोग और मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं3,4, 5 , 6.

क्योंकि जाल कुत्तों में एक समान pathophysiological भूमिका निभा सकता है, चिकित्सीय हस्तक्षेप है कि या तो रोकने या कम शुद्ध गठन सेप्टिक जानवरों में उपंयास उपचार रणनीतियों के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस कारण से, वहाँ एक विश्वसनीय तकनीक का आकलन करने के लिए और कुत्तों में NETosis और शुद्ध घटकों का अंदाजा लगाने के लिए की जरूरत है । सेल सहित नेट अवयव मुक्त डीएनए (cfDNA) और nucleosomes पहले कुत्ते न्यूट्रोफिल और प्लाज्मा में नैदानिक कुत्तों7,8,9से मूल्यांकन किया गया है । प्रतिदीप्ति परख, Goggs और Letendre का उपयोग कर पाया कि सेप्टिक कुत्तों से cfDNA के उच्च स्तर है स्वस्थ8कुत्तों । हालांकि इन तकनीकों का अत्यधिक उद्देश्य और मात्रात्मक, NETosis के मार्कर के रूप में cfDNA और nucleosomes की माप गैर विशिष्ट है, क्योंकि वे NETosing न्यूट्रोफिल के अलावा अन्य कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है । यहां हम एक तकनीक है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल करने के लिए जीना NETosing न्यूट्रोफिल के व्यवहार की जांच का वर्णन । हम यह भी विस्तार से एक बार संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग कर डबल immunolabeling रूपसे यों तो जाल और उनके घटकों जैसे MPO और कुत्ते न्यूट्रोफिल10में citH3 के रूप में ।

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में प्रयोग समिति, डेविस (प्रोटोकॉल संख्या: १८३३८) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. रक्त संग्रह

  1. या तो cephalic या jugular नस सिरिंज आकांक्षा द्वारा एक 21 जी सुई का उपयोग से खून की 10 मिलीलीटर ड्रा ।
  2. अत्यधिक कतरनी तनाव से बचने के लिए, ट्यूब (एस) सोडियम हेपरिन युक्त (७५ खासियत) में रक्त स्थानांतरित करने से पहले सिरिंज से सुई निकालें. धीरे ट्यूबों थक्कारोधी और रक्त के पर्याप्त मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए कई बार पलटना । नमूनों को बर्फ पर रखने से पहले थक्के या लाल सेल समुच्चय के सबूत के लिए जांच करें ।

2. न्युट्रोफिल अलगाव

  1. बर्फ की एक समान मात्रा के साथ anticoagulated रक्त ठंडा है Dubecco फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS) (pH ७.४, divalent cations के बिना) पतला । एक ५० मिलीलीटर में पतला रक्त के 8 मिलीलीटर स्थानांतरण शंकु ट्यूब से युक्त 25 मिलीलीटर 3% dextran ( Leuconostoc एसपीपी. से ०.९% सोडियम क्लोराइड समाधान में भंग) । एरिथ्रोसाइट्स के एकत्रीकरण और अवसादन की अनुमति के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान में ट्यूब ईमानदार रखें ।
  2. ध्यान से ल्युकोसैट की परत 5 मिलीलीटर-रिच प्लाज्मा (चित्रा 1) घनत्व ढाल मीडिया के 5 मिलीलीटर के शीर्ष पर एक 14 मिलीलीटर में गोल-नीचे ट्यूब । 2 समाधान11मिश्रण करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  3. ४०० एक्स जी पर ट्यूबों के साथ त्वरण/मंदी (A/D) 0 पर सेट (कोई ब्रेक) 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
  4. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक का उपयोग प्लास्टिक प्लाज्मा और परिधीय रक्त mononuclear कोशिका (PBMC) परतों (चित्रा 1) को दरकिनार करके granulocyte सेल परत इकट्ठा । संदूषण को कम करने के लिए हर बार एक नए प्लास्टिक का उपयोग करें ।
  5. polymorphnuclear (PMN) सेल लेयर के 4 से 6 मिलीलीटर को ५० मिलीलीटर के रूप में शंकु ट्यूब में रखें । के बाद से एरिथ्रोसाइट समुच्चय की एक छोटी राशि PMN परत के साथ aspirated जा सकता है, एक 1 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए धीरे एरिथ्रोसाइट समुच्चय है कि ट्यूब के नीचे बसे है हटाने के लिए ।
  6. बचे हुए एरिथ्रोसाइट्स को 20 मिलीलीटर ठंडे ultrapure पानी से लाइसे । धीरे ट्यूब पलटना 30 ६० एस के लिए कई बार बर्फ ठंडा १.८% सोडियम क्लोराइड समाधान के एक समान मात्रा जोड़ने से पहले पर्याप्त lysing सुनिश्चित करने के लिए ।
  7. ११२ पर 10 मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस, एक/
  8. यदि इस गोली लाल दिखाई देता है एरिथ्रोसाइट lysis कदम दोहराएं । supernatant ध्यान से एक सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक के साथ त्यागें और धीरे DPBS के १०० µ एल में गोली स्थगित (5 मिमी डेक्सट्रोज, ०.९ मिमी MgCl2, १.९ मिमी CaCl2 और 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, पीएच ७.३). सभी resuspend कोशिकाओं और बर्फ पर जगह गठबंधन ।
  9. किसी स्वचालित कक्ष विश्लेषक का उपयोग करके एक कक्ष संख्या निष्पादित करें और किसी hemocytometer द्वारा गणना सत्यापित कर लें । यदि आवश्यक हो, एक गिलास एक cytocentrifuge का उपयोग कर स्लाइड पर PMNs ध्यान केंद्रित (१,००० rpm, 5 मिनट) और कोशिकाओं की कुल संख्या से बाहर न्यूट्रोफिल की संख्या की गिनती से न्यूट्रोफिल का प्रतिशत निर्धारित करते हैं ।
  10. Strober एट अल द्वारा उल्लिखित के रूप में एक trypan नीले अपवर्जन परीक्षण प्रदर्शन करके न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता का निर्धारण । 12 सफल अलगाव ९५ से १००% और न्यूट्रोफिल से एक व्यवहार्यता उपज चाहिए ९५% से अधिक होना चाहिए ।
  11. प्रतिशत व्यवहार्यता और प्रतिशत न्यूट्रोफिल के साथ कुल सेल गिनती गुणा द्वारा न्यूट्रोफिल की एकाग्रता का निर्धारण । सफल अलगाव १.५ से 6 x 106/mL. न्यूट्रोफिल की एकाग्रता उपज चाहिए
  12. 5 मिमी डेक्सट्रोज, ०.९ मिमी MgCl2, १.९ मिमी CaCl2, और ७.३ के लिए समायोजित पीएच के साथ 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन युक्त DPBS के साथ 1 x 106/mL के अंतिम एकाग्रता के लिए न्यूट्रोफिल पतला ।

3. लाइव न्यूट्रोफिल की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी

  1. प्लेस २०० के ४०० μL को न्यूट्रोफिल (1 x 106/mL) के प्रत्येक कुआं में एक पाली-L-lysine लेपित 12-वेल कल्चरल प्लेट । न्यूट्रोफिल 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन द्वारा कुओं के नीचे का पालन करने की अनुमति दें ।
  2. दो न्यूक्लिक एसिड रंजक में से एक के 1 माइक्रोन के साथ लेबल न्यूक्लिक एसिड, एक कि बरकरार झिल्ली के साथ कोशिकाओं में दाग और एक है कि पारगंय झिल्ली के साथ कोशिकाओं में दाग ( सामग्री की तालिकादेखें), कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ।
  3. १०० μg/एमएल lipopolysaccharide (एलपीएस) (ई. कोलाई O55 के साथ न्यूट्रोफिल को सक्रिय करें । B5), १०० एनएम phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) धनात्मक नियंत्रण के रूप में, या DPBS के समतुल्य मात्रा ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में ३७ ° c पर १८० मिनट के लिए ।
  4. GFP का उपयोग कर छवियों को प्राप्त (उत्तेजना: 470/22 एनएम, उत्सर्जन: 525/50 एनएम) और टेक्सास लाल चैनल (उत्तेजना: 585/29 एनएम, उत्सर्जन: 628/32 एनएम) पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर 40X आवर्धन पर निंनलिखित समय अंक: 30, ९०, १२०, और १८० मिनट ।

4. नेट ठहराव और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर नेट घटकों का पता लगाने

  1. ध्यान से जगह 18 मिमी व्यास पाली-डी-lysine लेपित कवर एक 12 के कुओं में अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट फिसल जाता है । कुओं का उचित लेबल ।
  2. बीज १०० से २०० μL अलग न्यूट्रोफिल (1 x 106/mL) सीधे coverslips पर और न्यूट्रोफिल 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन द्वारा कवर पर्ची का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. ३.३ में वर्णित के रूप में न्यूट्रोफिल सक्रिय करें । पहले ली एट अल द्वारा वर्णित के रूप में सक्रियण से पहले २०० µ μ सीएल-amidine (15 मिनट, ३७ डिग्री सेल्सियस) के साथ न्यूट्रोफिल का इलाज करके शुद्ध गठन को बाधित । 13 यह सुनिश्चित करें कि प्रयोग में उचित वाहन नियंत्रण (DMSO) शामिल है ।
  4. ठीक संदंश के साथ कवर स्लिप्स को सावधानीपूर्वक निकालें । परत एक परीक्षण ट्यूब स्टैंड पर एक आयल फिल्म शीट के लिए उथले कुओं और जगह बनाने के 2 एक अच्छी तरह से10में 4% पीएफए के 3 बूंदें । कुओं को उचित रूप से लेबल करें और धीरे से कवर को पीएफए-भरे कुओं पर उल्टा पटका । कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर तय की अनुमति दें ।
  5. 5 मिनट के लिए DPBS में कोशिकाओं को धो 3 बार, उंहें एक अच्छी तरह से अगले करने के लिए ले जाकर ।
  6. यदि न्युट्रोफिल सक्रियण और निर्धारण के बाद शीघ्र ही immunolabelling नहीं किया जा सकता है, तो कवर स्लिप्स को कवर स्लिपिंग पेपर के एक टुकड़े पर आमने-सामने रखकर सूख जाने की अनुमति दें । कवर स्लिप्स अप करने के लिए 1 सप्ताह आमने-सामने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है एक लेबल 12-अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में 4 ° c आगे विश्लेषण तक. अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले ४.४ में वर्णित के रूप में एक ही तकनीक का उपयोग कर 1 मिनट के लिए DPBS में कोशिकाओं 3 बार धो लें ।
  7. कोशिकाओं permeabilize करने के लिए, धीरे से कवर पर्ची 1% NP-४० 1 मिनट के लिए ४.४ में वर्णित तकनीक का उपयोग कर के एक बूंद पर उल्टा करना । एक झूली कुरसी पर 1 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लो ।
  8. बेतरतीब ढंग से एक नंबर के लिए प्रत्येक नमूने निरुपित और एक हीरे बिंदु मार्कर का उपयोग करने के लिए तदनुसार coverslips लेबल ।
  9. तैयार करने और व्यक्तिगत पेट्री बर्तन तेल फिल्म और जगह के साथ लाइन में खड़ा लेबल 5% बकरी सीरम का २०० μL पर फिल्म (अवरुद्ध बफर) । coverslips को अवरोधित बफ़र पर उल्टा लेट कर । एक झूली कुरसी पर प्लेस और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  10. एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लो ।
  11. प्राथमिक एंटीबॉडी (1:400 खरगोश polyclonal विरोधी फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3) में 5% बकरी सीरम) पतला । लेबल पेट्री तेल फिल्म के साथ लाइन में खड़ा बर्तन में गर्मी कोशिकाओं । प्रत्येक कवर अप ५० पर पतला एंटीबॉडी समाधान के १०० μL पर उल्टा स्लिप करना । एक घुमाव पर प्लेस और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  12. एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लो ।
  13. पतला माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित करने के लिए एक fluorophore (1:200) में 5% बकरी सीरम. लेबल पेट्री तेल फिल्म के साथ लाइन में खड़ा बर्तन में गर्मी कोशिकाओं । प्रत्येक कवर अप ५० पर पतला एंटीबॉडी समाधान के १०० μL पर उल्टा स्लिप करना । एक झूली कुरसी पर प्लेस और अंधेरे में ३७ ° c पर 1 ज मशीन ।
  14. अंधेरे में एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लें ।
  15. myeloperoxidase के समवर्ती का पता लगाने के लिए (MPO) ली एट अल द्वारा वर्णित के रूप में एक संशोधित डबल immunolabeling प्रोटोकॉल के लिए निम्न चरणों का पालन करें । 13
  16. लेबल पेट्री तेल फिल्म के साथ लाइन में खड़ा बर्तन में गर्मी कोशिकाओं । प्रत्येक कवर करना १०० पर २०० μL 10% खरगोश सीरम के कोमल कमाल के तहत (रात भर, अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस,) पर उल्टा पर्ची ।
  17. अंधेरे में एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लें ।
  18. अंधेरे में एक झूली कुरसी पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ५० μg/एमएल unconjugated बकरी विरोधी खरगोश फैब टुकड़े में गर्मी कोशिकाओं ।
  19. अंधेरे में एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लें ।
  20. 5% बकरी सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी (1:200 खरगोश polyclonal विरोधी मानव MPO एंटीबॉडी) पतला । लेबल पेट्री तेल फिल्म के साथ लाइन में खड़ा बर्तन में गर्मी कोशिकाओं । प्रत्येक कवर अप ५० पर पतला एंटीबॉडी समाधान के १०० μL पर उल्टा स्लिप करना । एक घुमाव पर प्लेस और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज मशीन ।
  21. ४.८ में वर्णित 5% बकरी सीरम और मशीन में एक fluorophore के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित पतला
  22. अंधेरे में एक झूली कुरसी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लें ।
  23. हस्तक्षेप नियंत्रण दूसरी प्रतिरक्षा-लेबलिंग कदम में या तो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन को छोड़कर द्वारा तैयार किया जाना चाहिए ।
  24. ३०० 4 के एनएम के साथ डीएनए दाग ', 6-Diamidion-2-Phenylindole, कमरे के तापमान पर अंधेरे में 5 मिनट के लिए Dihydrochloride (DAPI) ।
  25. अंधेरे में एक झूली कुरसी पर 1 मिनट के लिए DPBS में 3 बार धो लें ।
  26. एक बूंद (~ ५० μl) एक गिलास स्लाइड पर antifade mounter के लागू होते हैं । धीरे कोशिकाओं के साथ coverslip बढ़ते से पहले अतिरिक्त बफर हटाने के लिए एक शोषक कागज पर coverslip के किनारे नल उल्टा । बढ़ते माध्यम coverslip और गिलास स्लाइड के बीच एक पतली परत बनाने चाहिए । हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए, बहुत धीरे ठीक संदंश के साथ coverslip पर दबाएँ.
  27. नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रात भर इलाज के लिए अनुमति दें । बढ़ते मध्यम विसर्जन लेंस के साथ सूक्ष्म विश्लेषण के लिए कठोर चाहिए । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस में नमूनों की दुकान ।

5. न्युट्रोफिल Extracellular जाल ठहराव

  1. ब्लाइंड ऑपरेटर (ओं) को प्राप्त करने और प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए माइक्रोस्कोप छवियों का विश्लेषण ।
  2. 40X आवर्धन पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, संबंधित चैनलों के अंतर्गत एक प्रयोग में प्रत्येक coverslip के विभिन्न क्षेत्रों से बेतरतीब ढंग से 10 छवियों को ले. सुनिश्चित करें कि जोखिम समय, चमक और प्रत्येक चैनल के विपरीत छवियों के अधिग्रहण भर में लगातार रखा जाता है ।
  3. ऐसे ImageJ (NIH) के रूप में उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग छवियों का विश्लेषण । cfDNA, citH3 और MPO (आंकड़ा 3 ए, बी) के सह-स्थानीयकरण के आधार पर जाल की पहचान करें । प्रत्येक प्रायोगिक शर्त के लिए 10 यादृच्छिक क्षेत्रों में जाल और न्यूट्रोफिल की संख्या यों तो । जारी जाल की संख्या एक प्रयोगात्मक हालत के लिए एक अनुपात (जाल की संख्या: न्यूट्रोफिल की कुल संख्या) के रूप में व्यक्त किया जा सकता है ।
  4. intracellular citH3 अभिव्यक्ति पर उपचार प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, intracellular citH3 और न्यूट्रोफिल की संख्या के साथ intracellular के 10 यादृच्छिक क्षेत्रों में citH3 आवर्धन पर संबंधित चैनलों के तहत न्यूट्रोफिल की संख्या की गणना ( चित्रा 3, लाल तीर) । Intracellular citH3 अभिव्यक्ति citH3 न्यूट्रोफिल के बिना Intracellular की संख्या के लिए Intracellular citH3 के साथ न्यूट्रोफिल की संख्या के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जा सकता है ।

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Representative Results

लाइव सेल इमेजिंग के इस प्रोटोकॉल का उपयोग, जांचकर्ताओं परमाणु आकृति विज्ञान, प्लाज्मा झिल्ली अखंडता और रहने वाले न्यूट्रोफिल में cfDNA की उपस्थिति का पालन कर सकते हैं । एक सेल impermeant परमाणु डाई दाग क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली के साथ कोशिकाओं में नाभिक एसिड लाल । एक अंय सेल-permeant डाई, लेबल intracellular बरकरार प्लाज्मा झिल्ली के साथ रहते कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड । सभी बरकरार न्यूट्रोफिल, उनके उपचार की परवाह किए बिना, हरी दिखाई और उत्तेजना (चित्रा 2a) के बाद 0 से 30 मिनट में विशेषता lobulated नाभिक प्रदर्शित करना चाहिए । पमा-स्वास्थ्यकर्मी न्यूट्रोफिल के नाभिक लगभग ६० मिनट तक अपने lobulated रूप को खोने लगते हैं और cfDNA (figure b) की रिलीज तक को समाप्त करना जारी रखते हैं । एलपीएस, एक धीमी और अधिक कुत्ते न्यूट्रोफिल के शारीरिक उत्तेजक, आमतौर पर क्रोमेटिन या NETosis में उत्तेजना के बाद ९० मिनट तक परिणाम नहीं है (चित्रा बी) । १२० मिनट तक, एलपीएस-और पमा-आपन न्यूट्रोफिल को cfDNA से घिरा देखा जा सकता है । एलपीएस की तुलना में, अधिक-पमा सक्रिय न्यूट्रोफिल उनके प्लाज्मा झिल्ली अखंडता खो के रूप में वे सेल impermeant डाई (चित्रा 2c) से लाल दाग रहे हैं । उत्तेजित न्यूट्रोफिल (DPBS control) को गर्मी की अवधि (चित्रा 2a-सी) के दौरान lobulated नाभिक और बरकरार प्लाज्मा झिल्ली को बनाए रखना चाहिए ।

cfDNA, citH3 और MPO granules से मिलकर नेट घटकों डबल immunolabeling प्रोटोकॉल का उपयोग कर पाए जाते हैं । जाल की रिहाई, cfDNA, citH3 और MPO के सह स्थानीयकरण के आधार पर की पहचान की, एलपीएस और पमा के जवाब में चित्र 3 ए और बीमें दिखाए जाते हैं, क्रमशः । न्यूट्रोफिल १८० मिनट के लिए एलपीएस द्वारा उत्तेजित पास न्यूट्रोफिल (3ए) के करीब निकटता में असतत वेब जाल की तरह पाड़ों का उत्पादन । इसके विपरीत, पमा-सक्रिय न्यूट्रोफिल का उत्पादन विशाल मात्रा में किया गया है कि क्षेत्र में ध्यान से बड़े थे (चित्र बी, डी) । एंजाइम peptidylarginine deiminase (PAD) द्वारा catalyzed histones H3 की Citrullination, NETosis की एक बानगी है । पमा, पैड का एक शक्तिशाली उत्तेजक, कोशिकाओं की एक उच्च संख्या में परिणाम intracellular citH3 व्यक्त की तुलना में उत्तेजित और एलपीएस-उत्तेजित न्यूट्रोफिल (चित्रा 3E) ।

Figure 1
चित्रा 1: एक योजनाबद्ध कुत्ते न्युट्रोफिल अलगाव के कदम का प्रदर्शन आरेख । पतला heparinized पूरे रक्त पहले लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के अवसादन के लिए 3% dextran के साथ मिलाया जाता है । ल्युकोसैट-रिच प्लाज्मा तो एकत्र और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल जुदाई मीडिया के बराबर मात्रा पर स्तरित है । निंनलिखित केंद्रापसारक (४०० x जी, 30 मिनट), आरबीसी-granulocyte परत निकाली जाती है और शेष RBCs hypotonic lysis द्वारा हटा रहे हैं । १.८% NaCl के अलावा, granulocytes नीचे घूमती है (११२ x g, 5 मिनट) और समर्पित बफर में resuspend । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि लाइव कुत्ते न्यूट्रोफिल के फ्लोरोसेंट छवियां । पृथक न्यूट्रोफिल १०० µ g/एमएल एलपीएस, १०० एनएम पमा, या Dubecco के फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के समकक्ष मात्रा के साथ सक्रिय थे १८० मिनट की कुल के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में न्यूक्लिक में रहते बरकरार न्यूट्रोफिल एसिड एक सेल का उपयोग कर के साथ हरे दाग थे permeant डाई जबकि cfDNA और समझौता सेल झिल्ली के साथ न्यूट्रोफिल एक सेल के साथ लाल दाग-impermeant डाई थे । (A, D) DPBS-और एलपीएस-इलाज न्यूट्रोफिल सभी lobulated नाभिक (तारांकन) के साथ एक बरकरार कोशिका झिल्ली बनाए रखा । (A, E) पमा-आपन न्यूट्रोफिल के नाभिक (ऐरोहेड) से गुजरने लगे । (बी, एफ) ९० min तक, एलपीएस-या पमा-आपन न्यूट्रोफिल में अधिकांश नाभिक ने अपने lobulated रूप (Blue ऐरोहेड) को खो दिया था । (ग) १२० मिनट के बाद, सभी पमा-आपन न्यूट्रोफिल पारगंय प्लाज्मा झिल्ली cfDNA से घिरा हुआ था, जबकि cfDNA एलपीएस की एक छोटी संख्या-सक्रिय न्यूट्रोफिल (तीर) के आसपास देखा जा सकता है । उत्तेजित न्यूट्रोफिल cfDNA उपज नहीं था और न ही किसी भी समय बिंदु (एक-सी) में सेल झिल्ली समझौता किया था । (A-B) मूल 40X आवर्धन । स्केल बार = १०० µm. (D-F) 80X आवर्धन । स्केल बार = 30 µm. Experiment 3 अलग दाताओं से अलग न्यूट्रोफिल से दो बार दोहराया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: शुद्ध गठन । (A-C) प्रतिनिधि immunofluorescent में इन विट्रो नेट गठन की छवियां । एक दाता से पृथक न्यूट्रोफिल तय किए गए, permeabilized और डीएनए के लिए दाग (नीला), myeloperoxidase (MPO, हरा) और फॉस्फोलिपिड lgg हिस्टोन H3 (citH3, लाल) के साथ उत्तेजना के बाद (a) १०० µ g/मिलि एलपीएस, (B) १०० nM पमा या (C) DPBS १८० min. जाल के लिए, cfDNA, MPO और citH3 के सह-स्थानीयकरण द्वारा पहचाना गया, (A) एलपीएस पर (डॉटेड रेखाएं) बाह्यरेखांकित हैं (B) पमा-आपन न्यूट्रोफिल । citH3 की intracellular अभिव्यक्ति के उदाहरण लाल तीरों द्वारा दर्शाए गए हैं. (ग) न कोई जाल और न ही intracellular citH3 को उत्तेजित न्यूट्रोफिल में देखा जाता है. स्केल बार = १०० µm. (डी, ई) प्रतिनिधि बॉक्स और शुद्ध गठन के मूंछ भूखंड और न्यूट्रोफिल में intracellular citH3 अभिव्यक्ति 4 कुत्तों से पृथक । बॉक्स 25th से ७५वें शतमक और छोटी से सबसे बड़े मान के लिए मूंछ अवधि तक बढ़ाता है । एलपीएस र पमा उत्तेजना परिणामस्वरुप भरपुर (घ) शुद्ध गठन र (ङ) intracellular citH3 अभिव्यक्ति भन्दा उत्तेजित न्यूट्रोफिल । + मतलब का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल नाभिक अनुरूपता में परिवर्तन और cfDNA रिहाई में बदलाव का पालन करने के लिए एक सेल permeant डाई और एक सेल impermeant डाई का उपयोग कर न्यूट्रोफिल कुत्ते रहते हैं । इस परख का मुख्य लाभ यह है कि यह वास्तविक समय के लिए सेल निर्धारण के बिना रहते न्यूट्रोफिल में उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी द्वारा गठन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, इसलिए, इन विट्रो शुद्ध गठन में देख के लिए एक सरल और मूल्यवान उपकरण प्रदान । चूंकि इस परख शुद्ध घटकों का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है, यह प्रजातियों में से सीमित उपलब्धता के साथ प्रजातियों में NETosis का अध्ययन करने के लिए आदर्श है विशिष्ट एंटीबॉडी. इस परख का प्रयोग, लेखकों का प्रदर्शन किया है कि कुत्ते न्यूट्रोफिल एलपीएस या पमा उत्तेजना के तहत क्रोमेटिन से गुजरना13NETosis से पहले । इस तकनीक का एक प्रमुख दोष यह है कि यह NETosis के लिए विशिष्ट नहीं है । क्योंकि कोशिका impermeant डाई भी न्यूक्लिक एसिड या न्यूक्लिक लीजड ड न्यूट्रोफिल, cfDNA या कोशिका impermeant-सकारात्मक कोशिकाओं से जारी किया एसिड या NETosing न्यूट्रोफिल के रूप में झूठा व्याख्या की जा सकती है । वैकल्पिक रूप से, NETosis की विशिष्टता को PAD4-अवरोध करनेवाला, Cl-amidine के साथ इलाज कर रहे हैं पमा-या एलपीएस-सक्रिय न्यूट्रोफिल को शामिल करके बढ़ाया जा सकता है । हम यहां के महत्व को सुनिश्चित करने के बाँझ और न्यूट्रोफिल के उचित हैंडलिंग अलगाव प्रक्रिया के रूप में संदूषण और सरासर बलों में इन विट्रो परिगलन और कोशिका lysis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम भी प्रोटोकॉल भर में पर्याप्त तापमान के साथ पालन करने और लंबे समय तक (> 1 मिनट) hypotonic lysis को रोकने की सलाह देते हैं । अलग न्यूट्रोफिल ओवरटाइम की व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए, एक Trypan नीले अपवर्जन परीक्षण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक नकारात्मक उत्तेजित न्यूट्रोफिल से मिलकर नियंत्रण अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं ।

क्योंकि सेल द्वारा पाया cfDNA-अभेद्य न्यूक्लिक एसिड रंजक NETosis के लिए विशिष्ट नहीं है, हम इन विट्रो शुद्ध गठन और immunolabeling intracellular अभिव्यक्ति में कुत्ते citH3 में बढ़ाता के लिए एक डबल न्यूट्रोफिल प्रोटोकॉल विकसित की है । के रूप में न्यूट्रोफिल रिहाई extracellular अंतरिक्ष में cfDNA और citH3 के साथ MPO की तरह दानेदार प्रोटीन, नेट ठहराव के सह स्थानीयकरण पर आधारित cfDNA, citH3 और MPO जैसे cfDNA, nucleosomes या डीएनए-MPO परिसर के रूप में अंय परख की तुलना में अधिक विशिष्ट है 14. एंटीबॉडी की सीमित उपलब्धता के कारण कि पार कुत्ते प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया, हम प्राथमिक एंटीबॉडी कि एक और प्रजाति (खरगोश) से उत्पंन करते थे । माध्यमिक एंटीबॉडी पर अवशिष्ट मुक्त बाध्यकारी साइटों द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी का कब्जा करने की प्रक्रिया के या तो कदम में रोकने के लिए, हम पहले खरगोश unconjugated फैब टुकड़े द्वारा पीछा सीरम मुक्त बाध्यकारी साइटों को संतृप्त करने के लिए उपयोग किया । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम के लिए पर्याप्त धोने सुनिश्चित करने के लिए इम्युनोग्लोबुलिन और फैब टुकड़े जो ब्याज की दूसरी प्रोटीन का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते है की अतिरिक्त बाध्यकारी को रोकने के लिए है । हम भी प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न कमजोर पड़ने का परीक्षण करने के लिए विशिष्ट बाध्यकारी और हस्तक्षेप को कम करने की सिफारिश. यह सुनिश्चित करने के लिए कि या तो immunolabelling कदम से माध्यमिक एंटीबॉडी विशेष रूप से अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी को बांधता है, जांचकर्ताओं 2 अलग नियंत्रण है कि दूसरे immunolabelling कदम में या तो प्राथमिक एंटीबॉडी बाहर शामिल करना चाहिए । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग तब होती है जब दोनों द्वितीयक एंटीबॉडी से संकेतों का पता लगाया है ।

हिस्टोन citrullination या अमीना, catalyzed द्वारा एंजाइम peptidylarginine deminase ४ (PAD4), चूहों और मनुष्यों में बैक्टीरिया-जुड़े NETosis में आवश्यक है१५,१६. इस परख का प्रयोग, हम निर्धारित करने में सक्षम थे कि एलपीएस-प्रेरित NETosis कुत्तों में भी13पैड से हिस्टोन H3 citrullination की आवश्यकता है । ब्याज की उत्तेजक PAD4 सक्रियण द्वारा NETosis लाती है कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम पमा या कैल्शियम ionophore, A2318717की तरह ज्ञात PAD4 उत्प्रेरकों का उपयोग कर सकारात्मक नियंत्रण के शामिल होने की सलाह देते हैं । यदि न्यूट्रोफिल सकारात्मक नियंत्रण नमूनों में citH3 के लिए नकारात्मक दाग दिखाने के लिए, प्रोटोकॉल एक पर्याप्त सकारात्मक धुंधला होने तक संशोधित किया जाना चाहिए । हम भी जैविक नकारात्मक या तो उत्तेजित न्यूट्रोफिल या न्यूट्रोफिल पैड अवरोधक, सीएल-amidine के साथ इलाज से मिलकर नियंत्रण के शामिल किए जाने की सिफारिश ।

अलग जाल संरचना की सटीक पहचान इस तकनीक का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यह विशेष रूप से व्यापक NETosis के साथ नमूनों में मुश्किल हो सकता है, के रूप में एकाधिक आसंन न्यूट्रोफिल से जारी शुद्ध संरचनाओं के विलय NETotic घटनाओं के आकलन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस परख के परिणाम प्रवाह cytometry या एलिसा, जो कुत्ते न्यूट्रोफिल में उपयोग के लिए अभी तक मांय नहीं किया गया है जैसे अंय अधिक उद्देश्य परख के साथ संबद्ध किया जा सकता है । धाराप्रवाह शुद्ध संरचना के गठन से बचने के लिए, जांचकर्ता कोशिकाओं के कम एकाग्रता बीज कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, कुल मशीन समय कम व्यापक NETosis और शुद्ध संरचनाओं के विलय से बचने कर सकते हैं । हालांकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग अंय प्रजातियों में NETosis की जांच करने के लिए किया जा सकता है, लेखकों के अनुभव के आधार पर, न्युट्रोफिल प्रतिक्रिया एलपीएस या पमा प्रजातियों के बीच बहुत भिंन हो सकते हैं ।

कुत्तों में जाल की खोज पर प्रकाश डाला गया है कि NETosis माइक्रोबियल संक्रमण और प्रतिरक्षा मध्यस्थता रोग के दौरान जंमजात प्रतिरक्षा का एक संरक्षित तंत्र है । यहां प्रस्तुत परख कुत्तों और अंय प्रजातियों में NETosis के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है । पूति प्रेरित NETosis की एक बेहतर समझ पूति के लिए उपंयास उपचार रणनीतियों के विकास में आगे अनुसंधान की सुविधा होगी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इसी लेखक मॉरिस एनिमल फाउंडेशन (D15CA-९०७) द्वारा वित्त पोषित किया गया । अध्ययन के कैलिफोर्निया, डेविस, घोड़े के स्वास्थ्य और साथी पशु स्वास्थ्य के लिए केंद्र (2016-24-एफ) के लिए केंद्र के विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक के आंकड़े और वीडियो के साथ उसकी सहायता के लिए ंघी गुयेन के साथ उसकी सहायता के लिए गीना एनजी स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392 Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS GE Life Sciences 17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific A1285801 With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190136 Without divalent cations
E. coli O55:B5 InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S11368 5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain ThermoFisher Scientific S7578 1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40 Pierce 28324
Poly-D-Lysine coated coverslips neuVitro H-12-pdl 12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody Abcam Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments Jackson ImmunoResearch 111-007-003 Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody Dako A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) Life Technologies Corporation D1306

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३८ इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी पूति granulocyte अलगाव हिस्टोन citrullination peptidylarginine deiminase
इन <em>विट्रो में</em> कुत्ते न्युट्रोफिल Extracellular जाल गठन: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गतिशील और मात्रात्मक विश्लेषण
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Li, R. H. L., Tablin, F. In… More

Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58083, doi:10.3791/58083 (2018).

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